徐 諾，姚哲淵，車金水，葉明立，陳梅蘭,

（1.浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州 310015；2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201203）

黃酒以其獨特的滋味、豐富的營養(yǎng)和保健養(yǎng)生功能而著稱于世[1]，其中，糖類是形成其獨特滋味及保健功能的重要成分之一[2]。黃酒中的糖類主要是由葡萄糖、一定量的阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等單糖及麥芽糖、潘糖等低聚糖組成。其中，葡萄糖可以促進肌層與腸粘膜粘連[3]，起到固定作用，改善便秘[4]。阿拉伯糖不僅可以促進腸道蠕動[5]，還可以控制血糖和脂肪的累積，緩解糖尿病、肥胖等一系列疾病[6]。甘露糖具有抑制腫瘤細胞生長[7]、預防飲食引起的肥胖[8]等多種功效，還能用作抗腫瘤藥[9]，是甘露糖醇[10]、維生素[11]的合成前體。核糖能促進局部缺血、缺氧組織的功能恢復[9]，還能有效緩解肌肉無力、疲勞、疼痛等癥狀[12]。乳糖具有類似膳食纖維的作用，有利于雙歧桿菌和乳桿菌的生長，還能增強免疫力[13]。

由此可見，黃酒特別是其所含的糖類物質(zhì)可以對人體健康起到重要作用，因此，對黃酒中糖分的檢測具有現(xiàn)實意義。目前，黃酒研究主要集中于低聚糖含量檢測[14-15]，而對阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等這些單糖含量的檢測研究鮮有報道，因此本研究對不同類型黃酒中糖分含量進行檢測具有十分重要的意義。

目前，檢測食品中含糖量的方法有高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[16]、液相色譜-示差折光檢測法[17]、液相色譜-質(zhì)譜法[18]等。其中，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法中檢測器對標準曲線的線性不確定度的貢獻較大，關系曲線比較復雜；分離效果不佳，靈敏度低；液相色譜-示差折光檢測法易受溫度、流速變化的影響，造成不穩(wěn)定；液相色譜-質(zhì)譜法樣品前處理步驟復雜，耗時較長。由于糖類化合物具有弱酸性、親水性[19]，沒有吸光基團，以陰離子形態(tài)存在于較強的堿性溶液中，因而使用氣相色譜和高效液相色譜法分析糖類物質(zhì)均有不足之處。離子色譜-積分脈沖安培法具有不用衍生、操作方便、靈敏度高和實驗不使用有毒化學試劑的優(yōu)點，同時糖類物質(zhì)的還原性也為安培檢測提供了可能。因此，本實驗基于胡貝貞等[15]的方法，對色譜條件進行優(yōu)化，建立離子色譜-積分脈沖安培法同時檢測黃酒中的阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、核糖、乳糖，在20 min內(nèi)實現(xiàn)6種糖的分離，并利用建立的方法對市售26個黃酒樣品中的單糖進行測定，基于所得的檢測結果，初步探討黃酒中單糖含量以及來源，為黃酒中糖類物質(zhì)的研究提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒樣品 購于當?shù)爻?；D-阿拉伯糖（純度98%）、D-甘露糖（純度99%）、D-核糖（純度99%）、β-乳糖（純度70%） 購于上海麥克林生化科技有限公司；D-半乳糖（純度98%） 購于上海恒信化學試劑有限公司；D-葡萄糖（純度99.5%） 購于廣州市金華大化學試劑有限公司；氫氧化鈉（純度96%） 購于杭州化學試劑有限公司；無水乙酸鈉（純度99%）購于溫州潤華化工實業(yè)公司；Xiboshi SPE C18：300 mg 北京賽諾思科技儀器有限公司；實驗室用水為超純水（電阻率18.20 MΩ·cm）。

ICS-5000 型離子色譜儀（配備 ED5000電化學檢測器、Au 工作電極、PH-Ag/AgCl 復合參比電極、Chromeleon6.8 色譜工作站） 美國Thermo Fisher Scientific公司；CarboPacTMPA 10分析柱（4 mm×250 mm） 戴安（中國）有限公司；超純水機（TKAGenpure） 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取各種糖100 mg，用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的標準儲備液，于4 ℃冷藏保存。使用前，取等量同濃度級別的標準溶液混合后作為混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 取C18固相萃取柱，依次用10 mL甲醇、15 mL超純水活化，靜置20 min，備用。進樣前，樣品用去離子水按需要稀釋150倍，然后取2 mL溶液經(jīng)過已活化好的C18柱和0.2 μm尼龍濾膜，棄去初濾液2 mL，再加2 mL溶液至已活化好的C18柱和0.2 μm尼龍濾膜，收集流出液，進色譜分析。

1.2.3 色譜條件 由于黃酒樣品中存在多種保留性不同的糖類，因此采用梯度淋洗的方式進行淋洗。阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖等保留性較弱且出峰時間相似，因此實驗剛開始采用較低的濃度進行洗脫。由于黃酒中含有多種糖類，對于在柱上保留較強的糖的洗脫，除了用氫氧化鈉淋洗之外，還加入了乙酸鈉淋洗。最終確定的梯度淋洗程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gragient eluting procedure

色譜柱：CarboPacTMPA 10分析柱（4 mm×250 mm）；柱溫：30 ℃；進樣量：25 mL。以250 mmol/L NaOH（A）、超純水（B）和200 mmol/L NaOAc（C）為淋洗液進行洗脫，梯度洗脫條件見表1。

1.2.4 定性定量方法 利用保留時間等保留至定性分析，即在1.2.3色譜條件下，用標準溶液與黃酒酒樣中色譜峰對照定性分析；或?qū)藴嗜芤杭尤朦S酒酒樣中導致某色譜峰增高定性。利用外標法定量分析，即在1.2.3色譜條件下，按標準溶液色譜圖，可求出每個單糖濃度與相應峰面積或峰高校準曲線，根據(jù)校準曲線求出黃酒酒樣色譜圖相應單糖峰面積或峰高的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

色譜結果積分處理采用Thermo Chromenleon 6.8色譜工作站，并利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

以糖類濃度為橫坐標, 色譜峰面積為縱坐標, 繪制標準曲線, 6種糖類標準溶液色譜圖如圖1所示。

圖1 6種糖類標準溶液的色譜圖（濃度為1 ppm）Fig.1 Chromatograms of 6 saccharides standard solution(The concentration of 1 ppm)

2.1.1 標準曲線、檢出限、定量限及重現(xiàn)性 分別采用超純水配制6種糖類混合標準溶液，其中核糖濃度為0.005、0.05、0.5、1、5 μg/mL；半乳糖和甘露糖混合標準溶液的系列濃度為0.01、0.1、1、5、10 μg/mL；阿拉伯糖和乳糖混合標準溶液的系列濃度為0.1、0.5、1、5、10 μg/mL；葡萄糖濃度為1、10、50、100、150 μg/mL。按照1.2.3的色譜條件進樣，并進行線性關系、精密度、檢出限和定量限的考察。

配制阿拉伯糖濃度為0.1 μg/mL，半乳糖濃度為0.01 μg/mL，葡萄糖濃度為1 μg/mL，甘露糖濃度為0.01 μg/mL，核糖濃度為0.005 μg/mL，乳糖濃度為0.1 μg/mL的混合標準溶液重復進樣7次測定峰面積，計算RSD，并以3倍基線噪聲（S/N=3）計算得到檢出限，以10倍基線噪聲（S/N=10）計算得到定量限，標準品的線性關系、精密度，結果如表2。

從表中的測定結果可以看出，該方法的線性關系 良 好（R2≥0.9990），檢 出 限（2.99×10-3～1.38×10-2μg/mL），定量限（9.96×10-3～4.60×10-2μg/mL），相對標準偏差（RSD）≤3.70%，表明了該方法靈敏度高，精密度高。

2.1.2 方法回收率 取已知濃度的黃酒酒樣為標準，加入定量的混合標準品溶液，按方法要求操作并測定，計算6種單糖的回收率，結果如表3所示。從測定的結果可以得到該方法的平均加標回收率在91.6%～109.1%之間，表明方法具有良好的準確度。將每份加標樣品分別進樣7次，通過峰面積計算精密度為1.02%～3.70%，表明該方法的重現(xiàn)性好，結果見表2。

表2 回歸方程、決定系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限和重現(xiàn)性Table 2 Regression equations, determination coefficient, linear ranges, limits of detection, quantification limits and reproducibility

表3 黃酒樣品的加標回收率Table 3 Spike recovery of yellow rice wine samples

2.2 市售黃酒酒樣檢測與分析

用所建立的方法分析黃酒中6種糖類的含量，檢測結果見表4，典型樣品圖見圖2。由表4可知，6種糖類含量均有差異。其中葡萄糖為黃酒中的主要糖類，在26個黃酒中均檢出，含量在14.31～60.42 g/L之間。核糖在20個黃酒中被檢出，但3年陳釀古越龍山、8年吳越稽山和5年陳黃酒中未檢出。而乳糖僅在東風精雕酒、10年咸亨雕王以及吳越稽山中檢出。除葡萄糖外其余糖類在桃釀、玫瑰米酒、桃子米酒中未檢出。阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、核糖和乳糖在黃酒中含量較低。

圖2 3年手工冬釀黃酒樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 3 years‘ hand-brewed rice wine samples in winter

表4 黃酒樣品中6種糖類的濃度（g/L）Table 4 The concentration of 6 saccharides in yellow rice wine samples(g/L)

2.3 不同類型酒樣中單糖的比較分析

如表4所示，在黃酒中，葡萄糖的含量遠遠高于其他單糖，這是因為所用生產(chǎn)黃酒用的原料以淀粉為主，淀粉水解成葡萄糖被發(fā)酵利用，未被利用的葡萄糖就留在酒中。在此發(fā)酵過程中，糖類在其它微生物的作用下發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化生成其他糖類，如阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和核糖[20]。

桃釀、玫瑰米酒和桃子米酒這3種半甜型黃酒總含糖量相對高于加飯酒，但除葡萄糖外，其它幾種糖全部未檢出，見圖3。可能的原因是半甜型黃酒以成品黃酒代替水，加入到發(fā)酵醪中，使糖化發(fā)酵的開始之際，發(fā)酵醪中的酒精濃度就達到較高的水平，在一定程度上抑制了酵母菌的生長速度，由于酵母菌數(shù)量較少，對發(fā)酵醪中產(chǎn)生的糖分不能轉(zhuǎn)化成酒精，故成品酒中的糖分較高[21]，但也抑制了其他微生物的反應，使得半甜黃酒中全未檢測出其它糖。而加飯酒在淀粉糖化和酒精發(fā)酵的雙邊條件下釀造[22]，可能是成熟的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝保證了釀酒酵母對糖化產(chǎn)物的發(fā)酵，使加飯酒中的發(fā)酵過程更為充分，糖類之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，因此，在加飯酒中幾乎全部檢測出6種待測糖類。但進一步分析發(fā)現(xiàn)，6種糖類與黃酒的酒齡及品牌關系不明顯。

圖3 加飯酒與半甜型黃酒的色譜比較圖Fig.3 Chromatographic comparison of rice wine and semisweet rice wine

根據(jù)GB/T 13662-2018黃酒規(guī)定，黃酒是以稻米、黍米、玉米、小麥、水等為主要原材料，經(jīng)加曲和/或部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑后經(jīng)過復雜的生物化學過程釀制而成的發(fā)酵酒[23]。據(jù)文獻[24]報道，采用不同的工藝、不同的原料組合，糖化發(fā)酵劑用料選擇的不同，最終產(chǎn)出的黃酒所含的糖類成分及含量也不同。因此，黃酒糖類物質(zhì)的成分及含量組成可能與其所用原料及釀造工藝等有關，具體尚需進一步動態(tài)跟蹤研究。

3 結論

本研究中建立的離子色譜-積分脈沖安培法同時檢測黃酒中的阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、核糖、乳糖的方法簡便、快捷、靈敏度高、準確性好、精密度高；其次，黃酒中主要存在的單糖是葡萄糖，阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、核糖和乳糖的含量較低；半甜型黃酒中葡萄糖的含量高于加飯酒，其含量的差異可能與釀造工藝有關。

對比白酒中的葡萄糖含量2.01～3.33 mg/L[25]，啤酒樣品中葡萄糖濃度在0.0942～0.4197 mg/L[26]，葡萄酒樣品中葡萄糖濃度在13.45～85371.13 mg/L[27]及本研究黃酒中葡萄糖含量14310.1～60420.6 mg/L數(shù)據(jù)可知，黃酒中糖類物質(zhì)含量遠高于白酒和啤酒，與低含糖量的葡萄酒接近。攝入過量的糖分不僅會導致肥胖問題，還易增加罹患糖尿病、高血壓等慢性疾病的風險[28]，因此，應適量飲用黃酒。