沈圓圓，于福田，秦雅莉，陳尚里，董詩瑜，趙笑潁，劉小玲

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

蠶蛹是蠶絲的主要副產(chǎn)品，我國蠶蛹年產(chǎn)量達(dá)50萬噸，約占全球總產(chǎn)量的80%。蠶蛹的蛋白質(zhì)含量為60%左右，富含18種氨基酸[1]。蠶蛹蛋白是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的可食用蛋白，還有一定的藥用價(jià)值。近年來，研究發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白和蠶蛹肽具有抗氧化[2]、降血壓[3]、降血脂[4]、抗菌[5]和免疫調(diào)節(jié)[6]等功能活性，但關(guān)于其抗炎活性的研究幾乎沒有。目前，蠶蛹資源由于深加工技術(shù)缺乏，僅用作肥料和動物飼料，甚至被作為工業(yè)廢棄物處理[7]。因此，蠶蛹的開發(fā)利用具有廣闊的發(fā)展空間，制備蠶蛹肽（silkworm pupa peptides，SPP）對提高蠶蛹資源利用率和挖掘其潛在藥用價(jià)值具有重要意義。

炎癥是機(jī)體應(yīng)對刺激的一種防御反應(yīng)[8]，但不受控制的炎癥會誘發(fā)多種疾病。炎癥性疾病是由于大量促炎性介質(zhì)，特別是一氧化氮自由基（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNFα）、白 介 素1β（Interleukin-1β，IL-1β）和 白 介 素6（Interleukin-6，IL-6）等過度分泌引起的[9]。目前，常用的抗炎藥物因具有多種副作用而在實(shí)際應(yīng)用中逐漸受到限制。生物活性肽具有吸收速度快、安全性高、無副作用等優(yōu)點(diǎn)，在炎癥性疾病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。近年來，抗炎活性肽已在多種食物蛋白中得到很好的探索，如雞肉、魚肉和大豆蛋白等[10]。目前，蠶蛹肽常用的制備方法有：酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和基因重組法。例如，LI等[11]通過使用堿性蛋白酶在50 ℃、pH9.0的條件下水解蠶蛹蛋白50 min制備得到蠶蛹肽；XU等[12]采用固相法化學(xué)合成蠶蛹肽并對其抗腫瘤活性進(jìn)行研究。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法制備蠶蛹肽操作簡便，成本較低，更易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊[13]。

本文利用納豆菌生長過程中分泌的蛋白酶降解蠶蛹蛋白制備蠶蛹肽。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)篩選出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，并采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞建立炎癥模型，測定NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量，對蠶蛹肽的抗炎活性進(jìn)行初探，以期為蠶蛹肽在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的工業(yè)應(yīng)用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

繅絲冷凍蠶蛹 廣西河池桑蠶基地；納豆菌本課題組實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌種；RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞 中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基 美國 Gibco公司；胎牛血清

以色列Bioind公司；脂多糖（LPS，Escherichia coli055:B5） 北京索萊寶科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒 日本同仁化學(xué)研究所；一氧化氮（NO）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；氫氧化鈉等其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

T25高速分散均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CR21N高速冷凍離心機(jī) 日立公司；Infinite M200PRO酶標(biāo)儀 奧地利TECAN公司；ZQZY-85CS振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；CCL-170B-8二氧化碳培養(yǎng)箱 新加坡藝思高科技有限公司；CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 參照ZHOU等[14]的有機(jī)溶劑法對蠶蛹進(jìn)行脫脂。將繅絲冷凍蠶蛹放于室溫下解凍2 h，然后將蠶蛹勻漿后凍干粉碎，過80目篩，取蠶蛹粉置于8倍體積的正己烷中，38 ℃條件下磁力攪拌5 h，8000 r/min室溫離心10 min后，棄上清液，通風(fēng)櫥晾干，所得脫脂蠶蛹粉（殘油率為1.56%±0.32%）置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蠶蛹蛋白粉的制備 參照ZENG等[15]的堿溶酸沉法提取蠶蛹蛋白。脫脂蠶蛹粉→堿溶（10%（W/V），1 mol/L NaOH調(diào)pH至10.0）→45 ℃攪拌5 h→8000 r/min離心處理10 min→收集上層清液→酸沉10 min（1 mol/L HCl調(diào)pH至4.0）→8000 r/min離心處理10 min→收集沉淀→洗滌并離心2次（蒸餾水?dāng)嚢瑁?.1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0）→冷凍干燥→蠶蛹蛋白粉。

1.2.3 納豆菌液態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹肽

1.2.3.1 納豆菌生長曲線的測定 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g、酵母浸粉0.5 g、氯化鈉1.0 g、瓊脂1.5 g、蒸餾水100 mL，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g、牛肉粉3.0 g、葡萄糖1.0 g、蒸餾水100 mL，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。參考高潔等[16]的方法進(jìn)行，從試管斜面上挑取2環(huán)納豆菌，立即接入種子培養(yǎng)基，37 ℃，160 r/min，搖床振蕩培養(yǎng)。將未接種培養(yǎng)基作為對照組，每隔2 h取出種子液測定其在600 nm處的吸光度（OD），每份樣品平行測定3次，取平均值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線以確定納豆菌的生長對數(shù)期，測定總時(shí)長為40 h。

1.2.3.2 種子液的制備 將從斜面培養(yǎng)基活化好的菌種接至種子培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)制得處于對數(shù)期的種子液。

1.2.3.3 蠶蛹肽的制備 將種子液（107～108CFU/mL）以一定比例的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（蠶蛹蛋白粉3.0 g、葡萄糖1.0 g、磷酸二氫鉀0.1 g、磷酸氫二鉀0.25 g、硫酸鎂0.5 g、蒸餾水100 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0）中，并置于適宜溫度下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。待一定時(shí)間后終止發(fā)酵，9000 r/min，4 ℃，離心20 min以除去菌體沉淀和未利用的蠶蛹蛋白殘?jiān)?，取上清液?.45 μm微孔濾膜過濾，并將其冷凍干燥，即得蠶蛹肽，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以多肽得率為評價(jià)指標(biāo)，分別研究各單因素對納豆菌液態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹肽的影響。初始條件分別?。航臃N量4 mL、蠶蛹蛋白添加量3 g、初始pH7、發(fā)酵溫度37 °C、發(fā)酵時(shí)間32 h。選取各因素變量分別為接種量（2、3、4、5、6 mL）、蠶蛹蛋白添加量（1、2、3、4、5 g）、初始pH（5、6、7、8、9）、發(fā)酵溫度（31、34、37、40、43 °C）、發(fā)酵時(shí)間（24、28、32、36、40 h），進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量（A）、蠶蛹蛋白添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，以多肽得率（Y）為響應(yīng)值。采用Design-Expert V 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化出納豆菌液態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹肽的工藝。試驗(yàn)因素與水平編碼如表1 所示。

1.2.6 多肽得率的測定 參照魯偉等[17]的雙縮脲法進(jìn)行多肽濃度的測定。取2.5 mL發(fā)酵液于試管中，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混合均勻后靜置20 min，然后8000 r/min室溫離心20 min，取0.5 mL上清液于另一試管中，再加入2.0 mL雙縮脲試劑，混合均勻后靜置20 min，再次8000 r/min離心20 min，取上清液于540 nm波長處測吸光度。以加0.5 mL蒸餾水和2.0 mL雙縮脲試劑作為空白對照組。

式中：W表示多肽得率，%；c表示發(fā)酵上清液多肽濃度，mg/mL；V表示發(fā)酵液體積，mL；m表示蠶蛹蛋白添加量，mg。

1.2.7 抗炎活性

1.2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7巨噬細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素的DMEM中培養(yǎng)。將處于對數(shù)期的細(xì)胞以5×104個/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，并在37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[18]。

1.2.7.2 實(shí)驗(yàn)分組 設(shè)置空白對照組為未經(jīng)LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞，模型組為LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為不同濃度（50、100、150 μg/mL）蠶蛹肽處理LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞。每組設(shè)置6個復(fù)孔。

1.2.7.3 細(xì)胞活力的測定 通過CCK-8法測定細(xì)胞活力[19]。在無或有LPS（1 μg/mL）刺激細(xì)胞24 h建立細(xì)胞炎癥模型的情況下，用不同濃度（50、100、150 μg/mL）蠶蛹肽處理RAW 264.7巨噬細(xì)胞12 h。然后，每孔放入10 μL CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱孵育1 h后，通過用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度計(jì)算細(xì)胞活力，并根據(jù)下式計(jì)算：

式中：As實(shí)驗(yàn)組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測樣品）；Ac對照組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無待測樣品）；Ab空白組（不含細(xì)胞和待測樣品的培養(yǎng)基、CCK-8）。

1.2.7.4 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響 用1 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞24 h建立細(xì)胞炎癥模型的情況下，用不同濃度（50、100、150 μg/mL）蠶蛹肽處理RAW 264.7巨噬細(xì)胞12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用倒置顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.2.7.5 一氧化氮（NO）含量的測定 通過格里斯（Griess）法檢測NO含量[20]。用1 μg/mL的LPS刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞24 h建立炎癥模型，然后用不同濃度（50、100、150 μg/mL）的蠶蛹肽處理RAW 264.7巨噬細(xì)胞12 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用NO檢測試劑盒進(jìn)行NO含量的測定。簡而言之，將50 μL上清液鋪在96孔板中，并在其中加入等量的Griess試劑，然后用酶標(biāo)儀測定540 nm處的吸光度。使用亞硝酸鈉（NaNO2）標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～100 μmol/L），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO的含量。

1.2.7.6 促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量的測定通過ELISA法檢測促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。根據(jù)小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒使用說明書，測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中促炎因子的水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS Statistics26.0軟件對每一組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異；采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)組合試驗(yàn)和利用Origin 9.8進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆菌生長曲線

圖1為納豆菌在種子培養(yǎng)基上的生長曲線。由圖可知，納豆菌的生長曲線大致可分為四個階段，在0～4 h處于遲緩期，4～12 h處于對數(shù)生長期，12～34 h處于穩(wěn)定期，34 h以后進(jìn)入衰亡期。用于發(fā)酵的納豆菌應(yīng)選用處于對數(shù)生長期的菌種，因?yàn)樘幱谠撾A段的菌種生長速率最快、代謝旺盛、酶系豐富活躍、外界適應(yīng)能力強(qiáng)，因此，選取培養(yǎng)12 h的菌種作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的種子液。

圖1 納豆菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Bacillus natto

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 接種量對多肽得率的影響 如圖2所示，隨著接種量的不斷增加，多肽得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，接種量達(dá)到4 mL時(shí)多肽得率最佳。這可能與納豆菌的產(chǎn)酶量以及數(shù)量有關(guān)[16]，接種量在2～4 mL時(shí)，隨著接種量的增加，納豆菌分泌的蛋白酶也逐漸增多，導(dǎo)致豐富的蛋白酶水解底物而產(chǎn)生大量的蠶蛹肽；接種量4～6 mL時(shí)，納豆菌的大量繁殖需要消耗更多的營養(yǎng)物質(zhì)，而后期營養(yǎng)物質(zhì)不足以滿足納豆菌的生長繁殖和產(chǎn)酶，酶解所得的蠶蛹肽優(yōu)先供自身生長發(fā)育，致使多肽得率降低。因此，選取3～5 mL的接種量作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)水平范圍。

圖2 接種量對多肽得率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of polypeptide

2.2.2 蠶蛹蛋白添加量對多肽得率的影響 如圖3所示，隨著蠶蛹蛋白添加量的增加，多肽得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，蠶蛹蛋白添加量在3 g時(shí)達(dá)到最大值，多肽得率為13.04%±0.09%。前期蠶蛹蛋白添加量過低時(shí)，納豆菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)不足[16]，影響發(fā)酵速度，導(dǎo)致多肽得率較低。后期伴隨著蠶蛹蛋白添加量的增加，納豆菌會不斷分解蠶蛹蛋白，因納豆菌本身特性而產(chǎn)生大量粘稠性物質(zhì)。發(fā)酵液的粘度過大會造成底物與蛋白酶無法充分接觸[21]，進(jìn)而影響納豆菌酶解產(chǎn)生多肽。另外，納豆菌屬于嗜氧菌，發(fā)酵液粘度過大供氧不足，產(chǎn)酶量減少，酶活降低，多肽得率降低。因此，選取2～4 g的蠶蛹蛋白添加量作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)水平范圍。

圖3 蠶蛹蛋白添加量對多肽得率的影響Fig.3 Effect of silkworm pupa protein addition on the yield of polypeptide

2.2.3 初始pH對多肽得率的影響 如圖4所示，隨著初始pH的增加，多肽得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，初始pH為7時(shí)達(dá)到最大值，多肽得率為13.06%±0.06%。這可能是因?yàn)閜H的改變會影響納豆菌的生長發(fā)育、肽的積累及其穩(wěn)定性；pH也會影響酶的解離程度、底物蠶蛹蛋白的電荷性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能，這些因素都會降低酶的活性。因此，納豆菌液態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹肽的最佳的初始pH為7，過高或過低的pH都不利于蠶蛹肽的生成。

圖4 初始pH對多肽得率的影響Fig.4 Effect of initial pH on the yield of polypeptide

2.2.4 發(fā)酵溫度對多肽得率的影響 如圖5所示，發(fā)酵溫度的升高會對多肽得率有一定的影響。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，多肽得率最高為13.22%±0.05%。這可能與納豆菌的自身特性有關(guān)，納豆菌生長溫度范圍廣，最高可達(dá)45～55 ℃，最低可達(dá)5～20 ℃。當(dāng)納豆菌處于最適生長溫度時(shí)有利于其生長發(fā)育，同時(shí)也更有利于其產(chǎn)生大量蛋白酶。因此，納豆菌液態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹多肽的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對多肽得率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the yield of polypeptide

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對多肽得率的影響 由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，多肽得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，發(fā)酵時(shí)間在第36 h時(shí)達(dá)到最大值，多肽得率為12.94%±0.04%。這可能與納豆菌的產(chǎn)酶有關(guān)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，納豆菌產(chǎn)酶量不斷增多，蠶蛹蛋白得到充分的水解；但在發(fā)酵后期，前期得到的多肽會進(jìn)一步水解，多肽可能被水解為二肽或游離氨基酸。因此，選取32～40 h的發(fā)酵時(shí)間作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)水平范圍。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對多肽得率的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the yield of polypeptide

2.3 蠶蛹肽發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以接種量（A）、蠶蛹蛋白添加量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）3個影響較大的因素為自變量，多肽得率（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental design

對接種量（A）、蠶蛹蛋白添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）3個單因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得出多肽得率（Y）回歸方程：

對回歸模型進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)如表3所示，回歸模型高度顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.0886＞0.05），說明模型建立成功。決定系數(shù)R2為0.9753，說明多肽得率與回歸模型預(yù)測結(jié)果有較高一致性。校正決定系數(shù)R2Adj為0.9435，說明響應(yīng)值多肽得率有94.35%受模型中所涉及的各因素的影響[22]。根據(jù)F值可知各因素對多肽得率影響的主次順序?yàn)椋築＞A＞C，即蠶蛹蛋白添加量＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間。納豆菌液態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹多肽過程中蠶蛹蛋白添加量（B）對多肽得率影響達(dá)到高度顯著水平（P＜0.001），接種量（A）對多肽得率影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），發(fā)酵時(shí)間（C）對多肽得率影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。交互項(xiàng)AB、AC和BC對多肽得率影響均不顯著（P＞0.05）。二次項(xiàng)B2和C2對多肽得率影響都達(dá)到高度顯著水平（P＜0.001），A2對多肽得率影響不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

響應(yīng)面三維曲面圖和等高線圖（圖7）可直觀反映各因素間交互作用對多肽得率的影響結(jié)果。由圖7（a）可知，發(fā)酵時(shí)間位于中心水平時(shí)，蠶蛹蛋白添加量較接種量對多肽得率的影響更大，當(dāng)接種量在3.5～5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量在2.0～3.3%范圍內(nèi)多肽得率存在最大值；由圖7（b）可知，蠶蛹蛋白添加量位于中心水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間較接種量對多肽得率的影響更大，當(dāng)接種量在3.7～5.0 mL、發(fā)酵時(shí)間在33～37 h范圍內(nèi)多肽得率存在最大值；由圖7（c）可知，接種量位于中心水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間較蠶蛹蛋白添加量對多肽得率的影響更大，當(dāng)蠶蛹蛋白添加量在2.0～3.3 g、發(fā)酵時(shí)間在34～38 h范圍內(nèi)多肽得率存在最大值。

圖7 因素間交互作用對多肽得率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface and contour lines of the interaction of various factors on the yield of polypeptide

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0.6分析所得最優(yōu)工藝條件為：接種量5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量2.61 g、發(fā)酵時(shí)間35.37 h。為驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果的可靠性，并考慮實(shí)際操作中條件的設(shè)置，按照接種量5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量2.6 g、發(fā)酵時(shí)間35.4 h進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得多肽得率為14.58%±0.16%，與預(yù)測值（14.60%）相近，證明用響應(yīng)面法優(yōu)化蠶蛹多肽得率的回歸模型可靠。

2.5 蠶蛹肽的抗炎活性

2.5.1 蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響由圖8可知，LPS及蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細(xì)胞均無毒性。RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)1 μg/mL的LPS作用24 h后，其細(xì)胞存活率為101.33%±0.41%，說明LPS不影響RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖活力（P＜0.05）。在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細(xì)胞有顯著的增殖作用（P＜0.05），且有一定的劑量依賴性。因此，選用濃度為50、100、150 μg/mL的蠶蛹肽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8 蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effect of silkworm pupa peptides on the activity of RAW264.7 macrophages

2.5.2 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響 圖9為不同濃度蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響。在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)濃度為150 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到最大值124.47%±1.81%。這主要是由于生物活性肽具有安全性高、分子量小、易吸收等特點(diǎn)，可以被細(xì)胞用作營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長[21]。

圖9 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effect of silkworm pupa peptides on the activity of RAW264.7 macrophages induced by LPS

2.5.3 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響 如圖10（a）所示，正常的RAW264.7巨噬細(xì)胞接近圓形或橢圓形且表面光滑。當(dāng)用1 μg/mL的LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立炎癥模型后，細(xì)胞逐漸變?yōu)樗笮危?xì)胞表面存在皺紋和大量延伸的偽足，見圖10（b）。此時(shí)的細(xì)胞大部分為樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞中的氣泡和顆粒也增加并分散在系統(tǒng)中[23]。圖10（c）～（e）為不同濃度蠶蛹肽處理炎癥細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組，從中可以看出，隨著樣品濃度的增加細(xì)胞表面逐漸變得光滑、收縮，偽足也不斷減少，說明蠶蛹肽可有效緩解炎癥。當(dāng)蠶蛹肽的濃度達(dá)到150 μg/mL時(shí)，大部分細(xì)胞的形態(tài)恢復(fù)正常而且細(xì)胞數(shù)量明顯增加，說明蠶蛹肽可促進(jìn)細(xì)胞的生長繁殖。

圖10 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.10 Effect of silkworm pupa peptides on morphology of RAW264.7 macrophages induced by LPS

2.5.4 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO釋放量的影響 NO自由基在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[24]。正常情況下，巨噬細(xì)胞很少表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）；在炎癥過程中，iNOS將大量表達(dá)并產(chǎn)生NO，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和炎癥性疾病。細(xì)胞的NO分泌量可以間接反映炎癥水平，因此用LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，通過測定NO水平來評估蠶蛹肽對炎癥的作用[25]。如圖11所示，與對照組相比，經(jīng)LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO釋放量極顯著增加（P＜0.01），說明LPS誘導(dǎo)的炎癥模型建立成功。與模型組相比，經(jīng)50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)的蠶蛹肽治療12 h后，極顯著降低了NO的釋放量（P＜0.01）。不同濃度的蠶蛹肽均可減少NO的生成，并且呈劑量依賴性。當(dāng)蠶蛹肽濃度為150 μg/mL時(shí)，與模型組相比，NO的釋放量降低了49.98%。

圖11 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO釋放量的影響Fig.11 Effect of silkworm pupa peptides on NO release from RAW264.7 macrophages induced by LPS

2.5.5 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影響 除NO外，一些炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎等炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用[26]。TNF-α可以通過持續(xù)刺激誘導(dǎo)多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)白細(xì)胞遷移，引起上皮細(xì)胞凋亡，從而引起全身炎癥[27]。IL-1β對巨噬細(xì)胞具有趨化作用，大量IL-1β侵入血液會引起發(fā)熱[28]。IL-6在炎癥早期產(chǎn)生，可促進(jìn)T細(xì)胞的分化和活化，在急性和慢性炎癥性疾病中都是關(guān)鍵的介質(zhì)[29]。阻斷TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的信號傳導(dǎo)可有效治療炎癥性疾病，因此可將它們作為評價(jià)抗炎活性的指標(biāo)。如圖12所示，未經(jīng)LPS刺激的空白組細(xì)胞中TNF-α（圖a）、IL-1β（圖b）和IL-6（圖c）的檢出量很低。經(jīng)LPS刺激后，蠶蛹肽以劑量依賴性方式極顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β和IL-6的分泌（P＜0.01），蠶蛹肽對IL-1β和IL-6的最大抑制率分別為42.58%、30.79%。但是，蠶蛹肽不以劑量依賴性方式降低TNF-α的分泌。這可能是由于蠶蛹肽對IL-1β和IL-6的抑制效果比TNF-α更敏感[30]?？偟膩碚f，蠶蛹肽的抗炎活性與抑制炎癥因子有關(guān)。

圖12 蠶蛹肽對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中炎癥因子TNF-α（a）、IL-1β（b）和IL-6（c）分泌的影響Fig.12 Effect of silkworm pupa peptides on secretion of inflammatory factors TNF-α（a）, IL-1β（b）and IL-6（c）in RAW264.7 macrophages induced by LPS

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到了納豆菌液態(tài)發(fā)酵制備蠶蛹肽的最佳工藝條件：接種量5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量2.6 g、初始pH7.0、發(fā)酵溫度37 ℃和發(fā)酵時(shí)間35.4 h，此條件下的多肽得率為14.58%。此外，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合下獲得的蠶蛹肽在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞體外炎癥模型中表現(xiàn)出較好的抗炎活性，在50～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細(xì)胞無毒性，并且對細(xì)胞有顯著的增殖作用（P＜0.05）。蠶蛹肽可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中NO、IL-1β和IL-6的分泌（P＜0.05），且呈劑量依賴性。本研究為微生物發(fā)酵法制備抗炎活性肽提供一定的理論基礎(chǔ)。經(jīng)發(fā)酵得到的蠶蛹抗炎活性肽是一種混合物，有待于進(jìn)一步分離、純化、鑒定并對其作用機(jī)理進(jìn)行探究。