王承瑞，劉思思，易有金 ，李昌珠，肖志紅，劉汝寬,

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院省部共建木本油料資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

近年來，由食源性致病微生物引起的食物中毒已經(jīng)成為了全球共同關(guān)注的食品安全問題[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，全球每年接近70%的食源性疾病是由食源性致病菌引起的[2]。食源性致病菌約有幾十種，通常易引發(fā)食源性疾病的致病菌主要有以下7種[3-6]：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶血性鏈球菌（Streptococcus haemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。其中，由金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和大腸桿菌O157：H7等細(xì)菌性食物中毒引起的食品安全事件約占我國(guó)食品安全事件的30%～90%，也是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題[7-9]。因此，尋找安全、天然及高效的抑菌劑，對(duì)抑制食源性致病菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期及預(yù)防食品安全事件具有重大意義。

皂素是一類結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的成分，由皂苷和糖、糖醛酸或其他有機(jī)酸所組成[10]。根據(jù)已知皂苷元的分子結(jié)構(gòu)，可以將皂苷分為兩大類，一類為甾體皂苷，另一類為三萜皂苷[11]。如穿山薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，皂角殼皂素、綠茶皂素和油茶皂素屬于三萜皂苷。皂苷廣泛存在于植物中，多數(shù)研究表明，皂苷具有一定的抑菌作用[12]。如油茶皂素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌有較明顯的抑制作用，對(duì)白色念珠菌有一定程度的抑制作用，對(duì)綠膿桿菌無抑制作用[13-14]。如李萬華等[15]從皂角中分離出兩種化合物，分別是刺囊酸和皂莢皂苷C，皂莢粗提物對(duì)芒果炭疽病和蒂腐菌有較強(qiáng)的抑菌作用[16]；任冬冬等[17]利用氣化爆鳴法對(duì)皂角進(jìn)行處理，并進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，皂角提取液對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑菌效果，其中，對(duì)枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的效果最佳，MIC為0.23 mg/mL，并且得出皂角提取液對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果比革蘭氏陰性菌更好。經(jīng)研究，綠茶中最主要的抑菌成分為茶多酚，其中茶皂素也有一定的抑菌效果。華德興等[18]采用瓊脂稀釋法測(cè)定了綠茶中的茶皂素的抑菌活性，結(jié)果證明，茶皂素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）有抑菌效果。盧雯靜[19]利用茶皂素（山茶花）對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）和酵母菌（Saccharomyces）開展抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示茶皂素對(duì)四種菌均有抑制效果，其中，對(duì)酵母菌的抑制作用尤為顯著。

從上述研究中可看出，已有研究者對(duì)三種不同來源皂素的抑菌效果分別展開研究，但目前利用三萜皂苷進(jìn)行抑菌效果比較的研究較少，研究不夠深入、全面，因此，本研究選取油茶籽、綠茶、皂角殼三種不同來源皂素，對(duì)四種常見的食源性致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，旨在為開發(fā)綠色、安全和穩(wěn)定的食品防腐劑提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同皂素來源：綠茶、油茶籽和皂角殼粉末 均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；供試菌株：大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC 133264、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 186335、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC 109047、沙門氏菌（Salmonellasp.）BNCC 336792 由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供；牛肉膏 Thermo Fisher Scientific公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂 合肥博美生物科技有限公司；蛋白胨 上海盛思生化科技有限公司；氯化鈉、無水乙醇 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸 標(biāo)準(zhǔn)品，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，營(yíng)養(yǎng)瓊脂20 g，超純水1000 mL，pH調(diào)節(jié)至7.2，分裝至三角瓶中，121 ℃滅菌后待用；營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，超純水1000 mL，pH調(diào)節(jié)至7.2，分裝至三角瓶中，121 ℃滅菌后待用。

101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-2G雙人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；GZ-280-S生化培養(yǎng)箱 廣智科技設(shè)備（韶關(guān)）有限公司；ME204分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；LMQ.C-80E高壓滅菌鍋 濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；KK23E18TI冰箱 安徽博西華制冷有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 皂苷含量的測(cè)定 由于市面上沒有純的茶皂素和皂角殼皂素的標(biāo)準(zhǔn)品，而三種不同來源皂素均屬于齊墩果烷型的五環(huán)三萜皂苷，與齊墩果酸結(jié)構(gòu)相似，因此選取齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采取香草醛-濃硫酸法[20]進(jìn)行皂苷含量的測(cè)定。

1.2.1.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 稱取0.03 g齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入無水乙醇溶解，再將液體移入100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線。

1.2.1.2 試樣溶液制備 分別稱取0.2 g不同來源皂素（皂角殼、綠茶和油茶籽粉末）的試樣，加入無水乙醇進(jìn)行溶解，再移入100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋溶液至刻度，過濾，取濾液進(jìn)行使用。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別移取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mL于10 mL的容量瓶中，然后將容量瓶放置在沸水浴中，待溶劑揮發(fā)后，用流水沖洗使之冷卻至室溫，依次加入0.4 mL香草醛乙醇溶液和0.4 mL濃硫酸，立即搖勻。將容量瓶放置于70℃恒溫水浴鍋中同時(shí)加熱15 min，取出后，用自來水沖洗冷卻，加入乙酸乙酯定容。立即搖勻，使其充分反應(yīng)，并放置冷卻至室溫。在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以試劑空白作為對(duì)照組，以吸光度值為縱坐標(biāo)，各供試樣品總皂苷濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.4 樣品測(cè)定 移取0.6 mL試樣溶液，放入到10 mL的容量瓶中，按上述步驟中自“放置在沸水浴中，待溶劑揮發(fā)后”起，與標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)進(jìn)行顯色反應(yīng)，并測(cè)定其吸光度值，將測(cè)定數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出總皂苷的濃度。

1.2.1.5 計(jì)算公式 試樣中總皂苷含量W2，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，按公式（1）計(jì)算：

式中：C1—測(cè)試試樣溶液中總皂苷的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；m2—試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。

1.2.2 皂素溶液的制備 根據(jù)1.2.1所測(cè)的三種不同來源皂素的含量，計(jì)算出油茶籽、皂角殼和綠茶皂素的質(zhì)量濃度。然后稱取來源于油茶籽、皂角殼和綠茶的皂素，用無菌水溶解，分別配制成6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90 mg/mL等不同質(zhì)量濃度的皂素溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌種活化 參照文莉等[21]的方法，配置營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1 L，121 ℃高溫滅菌20 min后取出，倒入滅菌后的培養(yǎng)皿，冷卻后獲得固體培養(yǎng)基。從-80 ℃冰箱取菌株，用接種環(huán)挑取細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上劃線，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)溫度37 ℃。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的繪制及菌懸液的制備 采用紫外分光光度法測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線[22]。挑取四種食源性致病菌的菌落接種到100 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床37 ℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取出，在600 nm波長(zhǎng)下，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物生長(zhǎng)曲線。

菌懸液的制備[23]：用接種環(huán)挑取單菌落接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)14 h；再以1%接種量接種至10 mL的無菌水中，依次稀釋，通過比濁法，使菌落數(shù)為106CFU/mL。

1.2.5 不同來源皂素抑菌圈的測(cè)定 將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒于無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后，將0.1 mL濃度為106CFU/mL菌懸液，用涂布棒均勻涂于培養(yǎng)基表面。用滅菌的鑷子取牛津杯垂直并等距離的放入培養(yǎng)基上，其中三個(gè)牛津杯中加入不同濃度的皂素溶液，一個(gè)加入無菌水，作為空白，重復(fù)三個(gè)平板，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，觀察抑菌圈的大小，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑[24]。

1.2.6 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 采用二倍稀釋法[25]測(cè)定不同來源皂素對(duì)各供試菌的MIC。取7根無菌試管，進(jìn)行編號(hào)，然后向每管試管中加入2 mL培養(yǎng)基，在第一管中加入2 mL，64 mg/mL皂素溶液，混勻后取2 mL加入第二根試管中，依次稀釋，最后一根試管混勻后，取2 mL液體棄掉，7根試管最終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1 mg/mL。分別向上述試管中接入100 μL的106CFU/mL菌懸液，放置恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察試管中液體是否變渾濁，空白組為加入100 μL無菌水，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。

MBC測(cè)定[26]：自樣品濃度高于 MIC 值（包括MIC 濃度）的試管中各吸取100 μL 混懸液分別滴加到滅菌的平板培養(yǎng)基上，涂布均勻，培養(yǎng)箱中 37 ℃培養(yǎng) 24 h，肉眼觀察結(jié)果，菌落數(shù)小于5個(gè)的最低樣品濃度確定為 MBC值，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 皂苷含量的測(cè)定結(jié)果

陳緒濤等[27]以齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過建立回歸方程計(jì)算得出油茶皂素的含量為96%。同樣，王瑜[20]在測(cè)定皂角殼皂素的含量時(shí)，以齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，得到自制皂苷含量為24.38%。通過測(cè)定齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的梯度溶液的吸光度，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，求得回歸方程為：y=0.6725x+0.0501，決定系數(shù)為R2=0.9996，其中y為吸光值，x為單位濃度（mg/mL）。測(cè)定三種不同來源皂素的吸光度值，計(jì)算可得，油茶籽、綠茶和皂角殼來源皂素的皂苷含量分別為86.50%、82.70%和19.13%。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

2.2 四種食源性致病菌的生長(zhǎng)曲線

由圖2可知，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌分別經(jīng)過了微生物生長(zhǎng)的三個(gè)時(shí)期，即遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期。具體表現(xiàn)為在0～2 h內(nèi)，由于菌種剛剛接種到液體培養(yǎng)基內(nèi)，代謝系統(tǒng)還未適應(yīng)新的環(huán)境，中間代謝產(chǎn)物等還未合成，所以此時(shí)期的吸光度變化不明顯，吸光度沒有明顯增大。在3～10 h范圍內(nèi)，因?yàn)榻?jīng)過遲緩期的準(zhǔn)備，微生物生長(zhǎng)所需的物質(zhì)基礎(chǔ)己經(jīng)足夠，同時(shí)外界環(huán)境也適于菌體生長(zhǎng)，除沙門氏菌外，另外三種食源性致病菌的吸光度呈指數(shù)型增大；在10 h后達(dá)到穩(wěn)定期，活菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定、總細(xì)菌數(shù)達(dá)到最大數(shù)目、細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累達(dá)到頂峰。而沙門氏菌的遲緩期較長(zhǎng)，在10～14 h時(shí)才進(jìn)入對(duì)數(shù)期，四種食源性致病菌在14 h后都進(jìn)入穩(wěn)定期。由于比濁法只能測(cè)定培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，并不能有效區(qū)別穩(wěn)定期和衰亡期，所以14 h以后，吸光度基本保持不變。為了保證實(shí)驗(yàn)過程中菌種的活性，每次實(shí)驗(yàn)前將菌種在液體培養(yǎng)基中活化12～14 h。

圖2 四種食源性致病菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of four food-borne pathogens

2.3 抑菌圈試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

通過采用牛津杯法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行抑菌活性定性分析。測(cè)定結(jié)果表明，三種不同來源皂素對(duì)常見的四種食源性致病菌均有良好抑制作用，結(jié)果如表1、表2和圖3所示。

圖3 不同來源皂素對(duì)四種食源性致病菌的抑菌作用Fig.3 Bacteriostatic effect of saponins from different sources on four food-borne pathogens

表1 不同來源皂素對(duì)3種食源性致病菌抑菌圈的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of inhibition zone of saponin from different sources on three food-borne pathogens

表2 不同來源皂素對(duì)大腸桿菌的抑菌圈的測(cè)定結(jié)果(mm)Table 2 Determination of inhibition zone of saponin from different sources on E.coli(mm)

三種來源皂素對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果比較為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果比較為沙門氏菌＞大腸桿菌?？傮w來說，三種不同來源皂素對(duì)革蘭氏陰性菌（沙門氏菌）的抑制作用最佳，對(duì)其它三種菌的抑菌效果由強(qiáng)至弱分別為枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌；隨著皂素的濃度增大，抑菌效果隨之增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，三種不同來源皂素的抑菌作用強(qiáng)弱為：皂角殼＞油茶籽＞綠茶。這與蔣志平等[28]的研究報(bào)道一致，充分表明皂角能夠有效的抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。有研究表明，皂角殼中的皂苷類化合物主要是刺囊酸和皂莢皂苷C[15]，倪付花等[29]利用雙倍營(yíng)養(yǎng)法測(cè)定皂莢皂苷水溶液的抑菌作用，結(jié)果表明皂莢皂苷水溶液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門桿菌及白色念珠菌均有抑菌作用，對(duì)細(xì)菌的抑制效果較好。與本研究的結(jié)果一致。但由于皂角皂苷的含量相對(duì)較少，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，提取純化難度大，不利于廣泛應(yīng)用。而油茶皂苷是油茶餅粕的主要抑菌活性成分，其抑菌效果較好，將其開發(fā)成為一種新型植物源抑菌劑，可實(shí)現(xiàn)油茶榨油后副產(chǎn)物的有效利用。

2.4 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定結(jié)果

最小抑菌濃度是指在特定環(huán)境下孵育 24 h，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)的最低藥物濃度，試驗(yàn)時(shí)肉眼未見細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MIC。同一細(xì)菌對(duì)不同藥物的敏感性用MIC值衡量，值越小，說明越敏感，其抗菌藥物的作用越強(qiáng)[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表3），皂角殼來源皂素對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的MIC均為4 mg/mL，而對(duì)大腸桿菌的MIC則為8 mg/mL；綠茶和油茶籽來源皂素對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最佳，其MIC均為8 mg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為16 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC均為32 mg/mL。該測(cè)定結(jié)果與上述抑菌圈的結(jié)果基本一致。

表3 不同來源皂素對(duì)4種食源性致病菌最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of the minimum inhibitory concentration of saponin from different sources on four food-borne pathogens

2.5 最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定結(jié)果

由表4可知，皂角殼來源皂素對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的MBC均為8 mg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的MBC均為16 mg/mL；綠茶來源皂素對(duì)沙門氏菌的MBC為16 mg/mL，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC均為32 mg/mL，對(duì)大腸桿菌作用效果最弱，其MBC為64 mg/mL；油茶籽來源皂素對(duì)革蘭氏陽性菌（枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌）的MBC均為32 mg/mL，對(duì)兩種革蘭氏陰性菌（沙門氏菌和大腸桿菌）分別為16 mg/mL和64 mg/mL。

表4 不同來源皂素對(duì)4種食源性致病菌最小殺菌濃度的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination of the minimum bactericidal concentration of saponin from different sources on four food-borne pathogens

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，三種不同來源皂素對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均有不同程度的抑制效果，強(qiáng)弱依次為皂角殼＞油茶籽＞綠茶，因此，三種不同來源皂素均有開發(fā)成為天然抑菌劑的潛力，但由于皂角殼來源皂素在自然界中結(jié)構(gòu)多樣，不易獲取，且皂角（皂莢）資源量相對(duì)較少，限制了其廣泛應(yīng)用。結(jié)合實(shí)際，油茶皂素的抑菌效果較綠茶來源皂素好，且油茶為我國(guó)大宗油料，資源量豐富，故后續(xù)可進(jìn)一步開展油茶皂素的應(yīng)用研究，讓油茶資源獲得更廣泛更高值化的應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)油茶皂素的抑菌機(jī)制展開了初步研究。如何榮榮等[31]探究了油茶皂素對(duì)沙門氏菌的抑菌機(jī)理，主要通過改變細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，從而改變細(xì)菌的正常細(xì)胞形態(tài)，并且引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、堿性磷酸酶及K+的泄露，影響細(xì)菌正常的生長(zhǎng)繁殖。Zhao等[13]研究了油茶皂素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理，得出油茶皂素可改變細(xì)胞形態(tài)；扭曲細(xì)胞體；破裂細(xì)胞膜；破壞細(xì)胞膜的完整性；泄露細(xì)胞質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)中的小分子；阻礙細(xì)菌的生長(zhǎng)和再生產(chǎn)。同樣，張文婷[32]研究得出油茶皂素能作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜，增大細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破裂，內(nèi)容物溶出，從而起到抑菌作用。上述機(jī)理研究重在深入探討油茶皂素自身的抑菌作用，而本研究則側(cè)重于通過橫向?qū)Ρ绕渌硭匾志Ч?，得出油茶皂素具有良好的抑菌活性，并且油茶皂素資源量大，易于獲取，更利于實(shí)際生產(chǎn)。因此，結(jié)合現(xiàn)有的基礎(chǔ)研究，對(duì)油茶皂素開展更加系統(tǒng)而深入的抑菌研究，明確具體抑菌成分，為油茶皂素的廣泛應(yīng)用增添新途徑，可為開發(fā)新型植物源食品防腐劑提供新方向。