宋姍姍，楊艾華，王小敏，龍 婉，王微微,

（1.遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州遵義 563000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起食品污染和食物中毒的重要和常見細菌[1]，該細菌污染食品后，可導致食品腐敗變質，降低食用價值，且能產生腸毒素，引起毒素型食物中毒[2]。在我國，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒中占有較大的比例，食物中毒事件時有發(fā)生[3-4]。由于金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，食品受到污染的機會很多，因此為保證食品品質以及防腐、保鮮和加工工藝的要求，需在食品中添加防腐劑[5]。目前，在食品工業(yè)上廣泛使用的防腐劑為化學防腐劑，但研究顯示，若化學防腐劑用量超過一定限度后可能對人體健康有一定毒副作用[6-8]，故來源廣泛、種類繁多、安全健康且具有較好抑菌效果的天然防腐劑有望取代化學防腐劑[9-10]。

白茶（white tea）屬于輕微發(fā)酵的茶類，具有外形芽毫完整、湯色淡黃、滋味清純、香氣清雅等品質特點，是我國茶類中的特殊珍品，深受廣大消費者的認可[11-12]。白茶因其獨特的加工工藝，很大程度上保留了茶葉中的營養(yǎng)成分，主要包括初級代謝產物蛋白質、糖類、脂肪以及次級代謝產物多酚類、茶氨酸、生物堿、芳香類等物質[13-16]。其中茶多糖（tea polysaccharide）作為茶葉中的多糖類復合物，是僅次于茶多酚的功能性物質[17-20]。茶多糖除具有抑菌作用外[21-22]，還能清除自由基，提高抗氧化指標，因此將茶多糖用于食品防腐保鮮具有廣闊的應用前景。

我國貴州省湄潭縣因其具有“低緯度、高海拔、多云霧、少日照、無污染”的地理條件，為白茶的生長提供了優(yōu)質的條件[11]。目前，對茶多糖的研究主要集中于普洱茶多糖、綠茶多糖、烏龍茶多糖等[23-25]，湄潭白茶多糖作為一種安全無毒的活性物質，關于其抗菌性能的研究鮮有報道。因此，本文以湄潭白茶為原材料，通過水提醇沉法制備湄潭白茶多糖，并對湄潭白茶多糖體外抑制金黃色葡萄球菌活性及其穩(wěn)定性進行研究，為其開發(fā)成高效、無毒、穩(wěn)定的食品天然防腐劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湄潭白茶 購于貴州省湄潭縣沁園春茶業(yè)，將其在55 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎過篩（40目），自封袋密封保存；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC26003） 遵義醫(yī)科大學微生物學與免疫學實驗室保存；苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、無水葡萄糖、濃鹽酸 均為分析純，成都化學試劑廠；檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀 天津市致遠化學試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限公司；雙蒸水實驗室自制。

BCM-1000A超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HH·W21·600S恒溫水浴鍋、HH-B11·600BY電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；TD5M-WS高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；101-2AB電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；ELx800酶標儀 美國博騰儀器有限公司；LGJ-10D真空冷凍干燥機 四環(huán)科儀（天津）有限公司；TS-110/LE407 pH檢測儀 上海闊思電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 湄潭白茶多糖的制備 準確稱取10.0 g白茶粉末，按1:20 g/mL料液比加入雙蒸水，90 ℃水浴中提取4 h，3500 r/min離心15 min得到粗多糖提取液。按體積比1:1加入Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1, v/v），混勻后靜置20 min，上清液即為脫蛋白的多糖提取液。向上述提取液中加入4倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，3500 r/min離心15 min收集醇沉物。經真空冷凍干燥處理，得湄潭白茶多糖樣品。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[26]。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的制備 取0.1 g葡萄糖配制成0.1 mg/mL的葡萄糖標準品溶液，再用蒸餾水調節(jié)溶液濃度，配制成系列不同濃度的溶液。在6支試管中分別加入不同濃度（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）葡萄糖溶液1 mL，再各加入6%的苯酚水溶液0.5 mL，迅速加入5 mL濃硫酸混勻，沸水浴15 min顯色，冷水浴冷卻，以空白管為對照，在490 nm波長下，測定各葡萄糖標準品溶液吸光度，繪制標準曲線，得線性回歸方程。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的活化及菌懸液的制備 從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取金黃色葡萄球菌單菌落，接種到3 mL新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數生長期，調整細菌密度為1.5×106CFU/mL。

1.2.4 湄潭白茶多糖對金黃色葡萄球菌體外抑菌活性的測定 采用牛津杯法檢測湄潭白茶多糖對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性。取100 μL菌懸液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，靜置5 min后，將已滅菌的牛津杯置于平板表面，輕輕按壓固定，分別吸取100 μL溶液（實驗組：100 mg/mL湄潭白茶多糖溶液；對照組：無菌雙蒸水）加入牛津杯中，每組實驗重復3次，37 ℃培養(yǎng)18 h觀察抑菌圈的形成，測量抑菌圈直徑[27]。

1.2.5 湄潭白茶多糖對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用微量肉湯稀釋法測量湄潭白茶多糖的最小抑菌濃度。將100 μL茶多糖溶液與100 μL菌懸液混合。實驗組：不同濃度茶多糖溶液（100、80、60、40、20、10、8、6、4、2、1 mg/mL）；陰性對照組：菌懸液100 μL+營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基100 μL。每組實驗重復3次，37 ℃培養(yǎng)18 h，隨后使用酶標儀檢測OD600，確定湄潭白茶多糖對金黃色葡萄球菌的MIC[27]。

1.2.6 湄潭白茶多糖抑菌穩(wěn)定性的測定 采用1.5×106CFU/mL金黃色葡萄球菌為指示菌、終濃度為8 mg/mL茶多糖溶液進行實驗。其中未處理組為未經處理的茶多糖溶液與菌懸液等體積混合；對照組為不加茶多糖溶液的菌懸液。設置3次平行實驗，采用96孔板法檢測不同條件對白茶多糖抑菌活性的影響。

1.2.6.1 溫度對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 實驗組分別為20、40、60、80和100 ℃下處理30 min的茶多糖溶液。

1.2.6.2 p H對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 實驗組分別為使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH為4.0、6.0、8.0和10.0的茶多糖溶液。

1.2.6.3 紫外線照射對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 實驗組分別為30 W紫外燈光下照射10、20、30、40和50 min的茶多糖溶液。

1.2.6.4 金屬離子對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響實驗組分別為使用0.1 mol/L NaCl、KCl和CaCl2溶液處理的茶多糖溶液。

1.3 數據處理

所有實驗數據采用Excel 2019進行圖表處理，SPSS 19.0軟件進行數據統計和單因素方差分析，P＜0.05，表明具有顯著性差異；P＜0.01，表明具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

測定葡萄糖溶液的吸光值繪制標準曲線，如圖1所示,在波長490 nm處，每個梯度重復3次取平均值，得到葡萄糖標準曲線，回歸方程為y=2.938x+0.001，R2=0.998，所得葡萄糖標準曲線具有統計學意義。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of dextrose density

2.2 湄潭白茶多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

采用牛津杯法檢測湄潭白茶多糖抑菌活性，根據藥理學實驗方法[27]進行判斷：抑菌圈直徑≤6 mm為無抑菌活性，＞6 mm判斷為有抑菌活性，10 mm≥抑菌圈直徑＞6 mm視為低度敏感，15 mm≥抑菌圈直徑＞10 mm視為中度敏感，抑菌圈直徑＞15 mm視為高度敏感[28]。實驗結果顯示，100 mg/mL湄潭白茶多糖溶液對金黃色葡萄球菌具有強抑菌活性，抑菌圈直徑為（15.51±0.12）mm，為高度敏感。

2.3 湄潭白茶多糖MIC測定

湄潭白茶多糖MIC結果如圖2所示。實驗組均有細菌生長，通過組間單因素方差分析，與對照組相比，8～100 mg/mL湄潭白茶多糖對金黃色葡萄球菌生長具有極顯著差異（P＜0.01），且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果呈一定的劑量依賴關系。MIC為8 mg/mL。

圖2 湄潭白茶多糖對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Fig.2 The MIC of polysaccharides from Meitan White Tea against Staphylococcus aureus

2.4 湄潭白茶多糖抑菌穩(wěn)定性

2.4.1 溫度對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 以金黃色葡萄球菌的OD600值為指標探討茶多糖的抑菌活性[29]，吸光度值越低，其抑菌活性越強，結果如圖3所示。實驗組與未處理組相比較，20～60 ℃處理30 min，其抑菌活性相對穩(wěn)定；80～100 ℃處理30 min，抑菌活性下降明顯，大約為未處理組的45.8%，分析原因為溫度過高茶多糖易發(fā)生分解或轉化反應，導致抑菌活性下降[30]。但與對照組相比，其他組均具有極顯著的抑菌活性（P＜0.01）。表明湄潭白茶多糖具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度對湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.3 Effect of different temperature on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

2.4.2p H對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 湄潭白茶多糖在pH4～10范圍內的抑菌活性結果如圖4所示。與未處理組相比，堿性條件下，抑菌活性略有下降，其中pH10處理的茶多糖，其抑菌活性保留約58.5%，原因可能為茶多糖受到OH-的破壞，結構發(fā)生改變，從而影響其抑菌性能。但與對照組相比，其他組均具有極顯著抑菌活性（P＜0.01）。表明湄潭白茶多糖中的活性物質具有良好的酸堿穩(wěn)定性。

圖4 不同pH對湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.4 Effect of different pH on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

2.4.3 紫外線對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響 湄潭白茶多糖經30 W紫外線處理10～50 min后，抑菌活性相對穩(wěn)定，結果如圖5所示。實驗組與未處理組相比較，抑菌活性均保留80.0%以上。與對照組相比，其他組均具有極顯著抑菌活性（P＜0.01）。說明湄潭白茶多糖中的活性物質能夠對抗紫外線的破壞，保證其在自然環(huán)境中也能發(fā)揮較好的抑菌活性。

圖5 紫外線對湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.5 Effect of ultraviolet ray on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

2.4.4 金屬離子對湄潭白茶多糖抑菌活性的影響如圖6所示，與對照組相比，經0.1 mol/L NaCl和0.1 mol/L KCl處理的茶多糖，仍具有較強的抑菌活性，而經0.1 mol/L CaCl2處理的茶多糖，抑菌活性喪失，分析原因為鈣離子與多糖間存在較強的絡合作用，對其結構有一定的影響，從而使其抗菌活性喪失[31]。與未處理組相比較，經0.1 mol/L NaCl和0.1 mol/L KCl處理的茶多糖，抑菌活性無顯著差異（P＞0.05），活性均保留82.0%以上，說明湄潭白茶多糖對鈉離子和鉀離子具有一定的耐受性。

圖6 金屬離子對湄潭白茶多糖抗菌活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on the antibacterial activity of polysaccharides from Meitan White Tea

3 結論

我國作為茶葉生產大國，白茶原料來源廣泛，同時，白茶多糖作為一種植物源天然防腐劑，提取工藝流程簡便，將其運用到食品防腐保鮮中，既能夠降低食品企業(yè)的應用成本，也利于消費者身體健康。因此，本研究采用水提醇沉法制備湄潭白茶多糖，以金黃色葡萄球菌為指示菌，探討湄潭白茶多糖的體外抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性。牛津杯實驗表明湄潭白茶多糖具有抑菌活性，微量肉湯稀釋法測定其最小抑菌濃度為8 mg/mL。抑菌穩(wěn)定性實驗表明，湄潭白茶多糖表現出良好的抑菌穩(wěn)定性，對20～60 ℃不敏感，耐酸堿，對紫外線和Na+、K+其抑菌活性比較穩(wěn)定，而Ca2+可使其喪失抑菌作用?？傮w上，湄潭白茶多糖表現出了良好的體外抑菌活性和穩(wěn)定性。在后續(xù)研究中，課題組將探討其抑菌機理和安全性評價，進一步開發(fā)湄潭白茶多糖在食品保藏中的應用，為我國食品行業(yè)的發(fā)展及茶葉資源綜合利用奠定理論基礎。