黃文利，歐陽(yáng)耀銘，盧 玲，鄧澤元，范亞葦

（南昌大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047）

豆渣是指在加工生產(chǎn)自制豆?jié){、豆腐等其他豆制品類的過程中產(chǎn)生的粗糙物或殘?jiān)?，是大豆的副產(chǎn)物[1]。由于其易腐壞、有刺激性味道和質(zhì)地差，常用做動(dòng)物飼料或直接丟棄在田地里當(dāng)肥料[2]，但它不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如多種蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等[3]，還含有多種膳食纖維，其中約含有30%的可溶性多糖[4]，可以有效促進(jìn)人的腸道蠕動(dòng)并可預(yù)防慢性便秘和結(jié)腸癌，減少脂肪在體內(nèi)的沉積[5]，減少糖尿病患者對(duì)胰島素的消耗，并促進(jìn)腸道有益菌群的生長(zhǎng)、降低血液中膽固醇含量等功效[6]。目前，對(duì)豆渣中膳食纖維的提取處理方法有很多，如微波提取法[1]、酶水解法[7]、發(fā)酵等，其中，以豆渣為原料提取膳食纖維，利用羊肚菌[2]、酵母菌等微生物對(duì)豆渣進(jìn)行發(fā)酵，可以提高發(fā)酵豆渣中營(yíng)養(yǎng)成分的含量[8]，相對(duì)于其他方法更能提高豆渣的利用率，而且節(jié)約資源，避免環(huán)境污染[9]。膳食纖維作為“第七類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”成為當(dāng)今社會(huì)食品保健方面重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和食品研發(fā)對(duì)象[10]。

粗壯脈紋孢菌，屬真菌門[11]，分生孢子顏色呈紅至棕黃色或淡黃至淡紅橙色，球形或卵狀橢圓形至卵狀長(zhǎng)形或球形，直徑6～8 μm[12]。它是從江西傳統(tǒng)食品中提取純化出來的菌種[13]，富含類胡蘿卜素[14]，能夠產(chǎn)生高活性纖維素酶，能夠在發(fā)酵過程中利用豆渣中的蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸和酶，使一些不溶性纖維可以降解，使豆渣口感變得細(xì)膩[15]。目前對(duì)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣的研究主要集中在發(fā)酵后豆渣營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定和功能性糖的提取工藝[16]，而對(duì)發(fā)酵前后豆渣理化性質(zhì)及多糖結(jié)構(gòu)解析的研究很少。有研究報(bào)道[17]用粗壯脈紋孢菌發(fā)酵的豆渣產(chǎn)品口感細(xì)膩，粗糙感明顯降低，大部分纖維素被降解為功能性糖組分。發(fā)酵后由其多糖含量明顯增加，且具有較高的抗氧化活性，可作為功能性食品使用[18]。然而，發(fā)酵對(duì)其多糖的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化仍不清楚。為了有效地利用發(fā)酵豆渣多糖，需要對(duì)其結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行評(píng)估，對(duì)促進(jìn)豆渣資源的深度開發(fā)至關(guān)重要。

本研究用粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣，對(duì)發(fā)酵前后豆渣中可溶性總糖、蛋白質(zhì)、總酚、總黃酮理化成分進(jìn)行測(cè)定；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析發(fā)酵前后豆渣中多糖的單糖組成，并用微觀掃描電子顯微鏡、X-射線衍射、傅里葉變換紅外光譜、差熱-熱重分析對(duì)發(fā)酵前后多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定，為今后發(fā)酵豆渣功能性糖的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豆渣 南昌市江大南路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；粗壯脈紋孢菌 南昌大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；考馬斯亮藍(lán)G-250 生興生物技術(shù)有限公司；D-葡萄糖、L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、L-甘露糖、L-阿拉伯糖

標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技有限公司；DEAE-52纖維素 索萊寶生化科技有限公司；無水乙醇、硫酸、鹽酸、苯酚、福林酚、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸鈉、氯仿、正丁醇等 均為國(guó)產(chǎn)分析純，廣東省湛江科銘科技有限公司。

海能K 9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 廈門精藝興業(yè)科技有限公司；LGJ- 1 AZ 真空冷凍干燥機(jī) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；Nicolet 5700 智能型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)熱電尼高力公司；JSM 6701 F 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀 日本電子儀器有限公司；L6 s紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；Agilent 6890 N氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司（中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗壯脈紋孢菌發(fā)酵前后豆渣多糖的提取和測(cè)定 菌種斜面培養(yǎng)：稱取40 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）溶于100 mL蒸餾水中，水浴加熱15 min，將滅菌過的瓊脂倒入試管中制成斜面，然后挑取要接種的菌絲，將菌絲呈Z字型輕輕劃斜面試管完成接種，最后放入溫度30 ℃、濕度70%的恒溫恒濕箱光照培養(yǎng)96 h，備用。

豆渣發(fā)酵：稱取40 g豆渣于發(fā)酵瓶中，以豆渣:蒸餾水:菌液比1:2.1:0.4加入蒸餾水和菌液，然后放于恒溫恒濕箱培養(yǎng)72 h，然后烘干粉碎備用。參照魏長(zhǎng)浩等[19]的方法。

多糖的提取：稱取適量用粗壯脈紋孢菌發(fā)酵前后的豆渣樣品，分別將豆渣樣品和蒸餾水以料液比1:20于95 ℃的水浴中浸提2 h，以轉(zhuǎn)速4200 r/min離心5 min取上清液，將離心后沉淀繼續(xù)浸提，重復(fù)上述操作，連續(xù)浸提三次。合并提取的溶液，將提取液快速濃縮至原溶液體積的1/4，加入4倍量75%的無水乙醇，4 ℃醇沉后經(jīng)過夜24 h，醇沉后溶液進(jìn)行離心得出多糖沉淀，然后將離心出的沉淀冷凍干燥后即可得到粗多糖[20]，測(cè)定、計(jì)算粗多糖的得率。

1.2.2 發(fā)酵前后豆渣組成成分及多糖理化性質(zhì)的測(cè)定

1.2.2.1 組成成分的測(cè)定 對(duì)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵前后豆渣中總糖、蛋白質(zhì)、總黃酮、總酚含量進(jìn)行分析測(cè)定。采用苯酚-硫酸法[21]測(cè)總糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0081x-0.0128，R2=0.9987；采用凱氏定氮法[22]測(cè)定蛋白質(zhì)的含量；亞硝酸鈉-硝酸鋁法[23]測(cè)定總黃酮的含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0007x+0.002，R2=0.9997；采用福林酚試劑法[24]測(cè)定總酚的含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0066x+0.1163，R2=0.9992。

1.2.2.2 酶-Sevag法除粗多糖中的蛋白 取適當(dāng)?shù)拇侄嗵菢悠酚阱F形瓶中，料液比1:20添加蒸餾水，添加2%木瓜蛋白酶，在50 ℃搖床振搖1 h，使粗多糖中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下充分水解，90 ℃水浴鍋滅酶活15 min[25]，離心取上層清液，然后添加1/4倍氯仿和正丁醇的混合液（氯仿:正丁醇的比例為4:1，v/v），振搖25 min，4500 r/min下離心5 min，將水相與氯仿相分開，水相部分再加入氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述過程，直至水相和氯仿相之間無蛋白質(zhì)為止，收集水相部分，濃縮、醇沉后離心取沉淀，冷凍干燥后即為脫完蛋白后的豆渣多糖（SRP），通過上述方法得到的未發(fā)酵豆渣的多糖記錄為U-SRP，發(fā)酵豆渣的多糖記錄為F-SRP。

式中：A0表示樣品除蛋白前樣品蛋白含量；A1表示樣品除蛋白后蛋白含量；B0表示樣品除蛋白前樣品中多糖含量；B1表示樣品除蛋白后樣品中多糖含量。

1.2.3 發(fā)酵前后豆渣中多糖結(jié)構(gòu)性能的測(cè)定

1.2.3.1 掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu) 用掃描電子顯微鏡可以觀察發(fā)酵前后豆渣多糖的微觀分子結(jié)構(gòu)。將導(dǎo)電帶貼在樣品臺(tái)上，將樣品輕輕散落在導(dǎo)電帶上，直至綠豆粒大小即可。用洗耳球輕輕吹去多余的樣品粉末，然后用金屬離子濺射儀進(jìn)行鍍金。用電子發(fā)射激光掃描電子顯微鏡（SEM）可以觀察實(shí)驗(yàn)樣品粉末的外觀表面形貌，選擇放大倍數(shù)2000×對(duì)樣品進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)觀察并拍照。

1.2.3.2 X-射線衍射 利用X-射線衍射對(duì)發(fā)酵前后多糖的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。稱取0.1 g發(fā)酵前后的多糖樣品，試樣測(cè)定條件為：管內(nèi)電壓40 kV、管內(nèi)電流40 mA、衍射角范圍為5°～50°。

1.2.3.3 傅里葉變換紅外光譜 取1 mg發(fā)酵前后多糖樣品粉末，在加熱燈下加入2 mg KBr粉末，在瑪瑙研缽中研磨成粉，盡量使粒度在2.0 μm以下，將研磨好的粉末在專用壓片模具上加壓成均勻透明的薄片，使其厚度約1 mm，然后進(jìn)行紅外光譜掃描，對(duì)在4000～500 cm-1波數(shù)內(nèi)的峰型進(jìn)行觀察，得到掃描曲線。

1.2.3.4 單糖組成的測(cè)定 采用氣質(zhì)-聯(lián)用色譜法[26]檢測(cè)發(fā)酵豆渣多糖的單糖組成。

多糖的水解：精密稱取多糖樣品2 mg于10 mL比色管中，加入2 mL（2 mol/L）TFA溶液，充入一定量氮?dú)夂竺芊?，?10 ℃的低溫烘箱中進(jìn)行水解4 h，冷卻數(shù)分鐘后用氮?dú)獯蹈扇コ渲袣埩舻腡FA溶液，然后將比色管密封備用。

水解物的衍生：鹽酸羥胺10 mg，99.5% 的吡啶0.5 mL，分別加入到多糖水解物、各單糖標(biāo)準(zhǔn)品和混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品中。密封后在90 ℃的高溫?zé)崴≈袑?duì)其進(jìn)行快速振蕩即可使其快速反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后，加入0.5 mL 99% 的羥基乙酸酐，在90 ℃的高溫?zé)崴≈羞B續(xù)進(jìn)行振蕩30 min，反應(yīng)產(chǎn)物為乙酸乙腈衍生物。將得到的多糖衍生物過0.22 μm Ny有機(jī)濾膜后待測(cè)，隨后準(zhǔn)備進(jìn)行氣質(zhì)分析。

GC-MS條件：色譜柱 Aglient Hp-5毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），進(jìn)樣前用乙醇洗針3次；進(jìn)樣口溫度280 ℃，柱溫為220 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度設(shè)為250 ℃，進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比20 :1載氣為氦氣，流速設(shè)為1 mL/min；程序升溫初始溫度設(shè)定為160 ℃，保持恒溫2 min，然后以2 ℃/min的速度升溫至200 ℃，然后保持恒溫3 min；離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～600。

1.2.3.5 差熱-熱重分析 采用熱重分析法分析多糖樣品性能與溫度間的關(guān)系。取5～10 mg左右發(fā)酵前后的多糖粉末樣品，放入差熱-熱重聯(lián)用分析儀（DSC-TGA）樣品池中進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)定。溫度范圍25～600 ℃，升溫速度10 ℃/min，氮?dú)馀艢饬魉?0 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有單次統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分為3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)值±標(biāo)準(zhǔn)差值的方式進(jìn)行表示，采用單因素方差分析（ANOVA）和采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)性狀分析，采用Duncan多重極差方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，確定各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)性狀均值的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗壯脈紋孢菌發(fā)酵前后粗多糖的測(cè)定

采用熱水浸提法提取粗壯脈紋孢菌發(fā)酵前后豆渣粗多糖，其粗多糖的得率由2.10%增加到了17.20%，豆渣經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵后粗多糖含量是原物料的8.19倍，張瑋等[27]研究發(fā)現(xiàn)，粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆皮產(chǎn)纖維素酶可降解纖維素，使還原糖產(chǎn)量提高了81.74%。說明發(fā)酵可以提高豆渣中的糖含量，由于豆渣發(fā)酵過程中，會(huì)產(chǎn)生了大量的有機(jī)酸和酶，而粗壯脈紋孢菌可以分泌纖維素酶和半纖維素酶[28]，使一些不溶性的纖維素得以降解，從而增加了豆渣中可溶性糖的含量。

2.2 發(fā)酵前后豆渣組成成分分析

發(fā)酵前后豆渣中總糖、蛋白質(zhì)、總黃酮、總酚含量見表1，經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵后豆渣中各理化組分含量都顯著升高（P＜0.05）。葉俊等[3]發(fā)現(xiàn)，利用粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣可以使豆渣中粗纖維含量降低，其中可溶性總糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量均顯著提高。Vong等[29]發(fā)現(xiàn)，利用Yarrowia lipolytica發(fā)酵豆渣可以提高豆渣的營(yíng)養(yǎng)水平，還可以使一些促鮮味物質(zhì)琥珀酸、谷氨酸顯著增加。余瑋等[28]研究發(fā)現(xiàn)粗壯脈紋孢菌通過產(chǎn)生纖維素酶來分解和轉(zhuǎn)化纖維素,使一些大分子物質(zhì)在酶的作用下分解為小分子物質(zhì)，從而使發(fā)酵后一些物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分得到提高。說明發(fā)酵可能通過纖維素酶和蛋白酶的作用使豆渣中的粗纖維降解[19]。同時(shí)發(fā)酵會(huì)影響豆渣中異黃酮的結(jié)構(gòu)[30]，豆渣中的異黃酮都是以丙二酰基配糖體的形式存在，豆渣經(jīng)過粗壯脈紋孢菌發(fā)酵后，產(chǎn)生纖維素酶可降解其配糖體生成異黃酮配基，從而發(fā)酵后會(huì)增加總黃酮的含量。經(jīng)過酶-Sevag法對(duì)粗多糖脫蛋白得到蛋白質(zhì)的去除率為88.5%；多糖的保留率為86.25%，經(jīng)脫蛋白后的多糖純度更高，為后面更好的研究發(fā)酵前后多糖的結(jié)構(gòu)性能奠定基礎(chǔ)。

表1 發(fā)酵前后豆渣中基本成分測(cè)定結(jié)果（%）Table 1 Determination of basic components in soybean dregs before and after fermentation (%)

2.3 發(fā)酵前后豆渣中多糖結(jié)構(gòu)性能分析

2.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM） 圖1分別為U-SRP和F-SRP的SEM照片。擴(kuò)大2000×的SEM圖像可以清晰地顯示U-SRP和F-SRP的表面微觀結(jié)構(gòu)變化。從圖1可以觀察到F-SRP的表面微觀結(jié)構(gòu)與U-SRP相比出現(xiàn)了明顯的變化。圖1a中的U-SRP電鏡圖可以看出，豆渣多糖由許多致密的小顆粒組成，就像蓬松的頭發(fā)，小顆粒被大顆粒包裹，聚集成一團(tuán)，表面蓬松柔軟的結(jié)構(gòu)更有利于微生物的接觸；FSRP表面結(jié)構(gòu)如圖1b所示，發(fā)酵后多糖分布較分散、不聚團(tuán)、較松散，可能是由于發(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)或酶的代謝產(chǎn)生了小分子物質(zhì)，使豆渣變得疏松柔軟，增加了豆渣多糖的比表面積，這可能對(duì)提高多糖、多酚等生物活性物質(zhì)的提取率有一定的貢獻(xiàn)。

圖1 發(fā)酵前后豆渣多糖掃描電鏡圖Fig.1 SEM graphs of soybean residue polysaccharide before and after fermentation

2.3.2 X-射線衍射 通過分析X射線在實(shí)驗(yàn)晶體中衍射產(chǎn)生的晶體衍射效應(yīng)現(xiàn)象，來幫助檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品是否具有的晶體結(jié)構(gòu)。由如上圖2可以明顯看出，U-SRP在5°～50°衍射范圍內(nèi)無較明顯的吸收峰出現(xiàn)，說明SRP中纖維分子具有牢固的結(jié)晶構(gòu)型，有文獻(xiàn)報(bào)道[31]纖維素由晶體和非晶體組成。在纖維素的結(jié)晶部分，纖維分子整齊的排列、有排列規(guī)律，葡萄糖纖維分子排列中的羥基與纖維分子內(nèi)外的氫離子相互結(jié)合，形成對(duì)于纖維分子相對(duì)穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)晶分子結(jié)構(gòu)。發(fā)酵后F-SRP在衍射角為17.6°時(shí)出現(xiàn)明顯特征衍射峰，說明發(fā)酵對(duì)樣品顆粒內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定程度的破壞，說明發(fā)酵水解了豆渣中的纖維素或半纖維素，使SRP變得蓬松，晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這與微觀掃描電鏡結(jié)果一致。

圖2 發(fā)酵前后多糖的X-射線衍射圖Fig.2 X- ray diffraction of polysaccharides before and after fermentation

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜 用傅里葉紅外光譜分析多糖等大分子有機(jī)物中紅外光與官能團(tuán)的振動(dòng)頻率有關(guān)。當(dāng)多糖被紅外光照射時(shí)，在紅外光譜圖上可以看到各官能團(tuán)會(huì)出現(xiàn)不同的吸收峰，根據(jù)吸收峰所處的紅外光波段，可推測(cè)出多糖具有的官能團(tuán)種類[32]。圖3所示的為U-SRP和F-SRP的傅里葉變換紅外光譜，傅里葉紅外光譜分析結(jié)果表明，復(fù)合材料中存在多種特征官能團(tuán)。從曲線上可以看出，U-SRP和F-SRP的光譜峰吸收帶現(xiàn)狀相似，但吸收帶的相對(duì)強(qiáng)度不同，F(xiàn)-SRP的吸收帶強(qiáng)度更大。多糖樣品在3420.81 cm-1處的寬峰是多糖內(nèi)部發(fā)生一定程度的O-H的伸縮振動(dòng)峰[33]；2928.53 cm-1處的一組峰是由于糖類C-H鍵的伸縮振動(dòng)而形成的；1647.11 cm-1為-COOH中的C-O吸收峰；1418.63 cm-1為C-H的彎曲振動(dòng)峰；1000～1200 cm-1以環(huán)振動(dòng)為主，可能與C-O-H和C-O-C的伸縮振動(dòng)重疊有關(guān)；1031.11 cm-1處的峰證實(shí)了吡喃環(huán)構(gòu)象的存在，說明兩者都含有吡喃糖環(huán)；在890 cm-1有微弱的吸收峰，說明U-SRP和F-SRP內(nèi)部結(jié)構(gòu)有β-型糖苷鍵存在[34]；696.70 cm-1峰為醇或酚O-H鍵的面外彎曲振動(dòng)。在3420.81、2928.534、1418.63 cm-1這三個(gè)波段的吸收峰，即為糖類化合物的特征吸收峰[35]。由U-SRP和F-SRP的傅立葉紅外光譜圖可以看出，粗壯脈紋孢菌發(fā)酵前后對(duì)多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)沒有顯著影響。

圖3 發(fā)酵前后豆渣多糖的紅外光譜Fig.3 IR spectra of soybean residue polysaccharide before and after fermentation

有文獻(xiàn)報(bào)道[36]利用羊肚菌發(fā)酵豆渣，通過傅里葉紅外光譜分析發(fā)酵前后豆渣多糖結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后不僅出現(xiàn)了上述的吸收峰，還發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新的條帶，在1456 cm-1處為脂肪族C-H的變形，表明豆渣多糖中存在芳香化合物。1364 cm-1處為CH3-的彎曲震動(dòng)，616 cm-1處為硫酸鹽的不對(duì)稱變形。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌和粗壯脈紋孢菌進(jìn)行結(jié)合發(fā)酵豆渣，發(fā)酵前后多糖的吸收波段與本研究相似，發(fā)酵后結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，造成上述發(fā)酵后多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生差異的原因，可能是與不同菌種在發(fā)酵中所產(chǎn)生酶的種類、酶活力和發(fā)酵過程中的持續(xù)性等因素有關(guān)。

2.3.4 單糖組成分析 通過GC-MS對(duì)豆渣和發(fā)酵豆渣中多糖的單糖組分進(jìn)行定性定量分析。圖4為混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。從圖5～圖6中可以看出豆渣和發(fā)酵豆渣中主要含有鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，U-SRP中含量最高的是半乳糖（42.80%），其次是阿拉伯糖、巖藻糖等，其各單糖含量比為Rham:Ara:Fuc:Man:Glc:Gal 為6.62:23.6:9.53:5.66:7.63:42.80；發(fā)酵豆渣中葡萄糖含量最高（26.83%），其次是阿拉伯糖、半乳糖等，各單糖組成百分比Rham:Ara:Fuc:Man:Glc:Gal為13.5:20.02:10.81:10.11:26.83:16.74。從表2中可以得知，豆渣多糖中含量相對(duì)較高的是半乳糖，有研究發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞壁有很多植物纖維，半纖維素是植物膳食纖維的其中一個(gè)主要構(gòu)成組分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中分子鏈較短，有些糖單元如 4-氧-甲基葡萄糖醛酸和半乳糖等有時(shí)以支鏈連接到主鏈上，經(jīng)水解后可產(chǎn)生多種中性糖。而葡萄糖的合成主要是來自纖維素和淀粉的水解，發(fā)酵后由于纖維素的水解使得葡萄糖的含量最高。Romero等[37]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣可高產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶，發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶可能水解豆渣中的纖維素產(chǎn)生葡萄糖，這與張瑋等[27]研究的發(fā)酵糖中對(duì)單糖的分析相似，水解產(chǎn)物中大部分單糖為葡萄糖，本文的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過粗壯脈紋孢菌發(fā)酵后各單糖的組成重新排布，大部分單糖為葡萄糖。分析上述結(jié)果表明，發(fā)酵后多糖中的大部分單糖組分均在未發(fā)酵豆渣的基礎(chǔ)上增加，這是由于發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶會(huì)破壞纖維素，并使細(xì)胞壁產(chǎn)生破壁現(xiàn)象，將一些難溶或不溶性的組分進(jìn)行水解，使細(xì)胞壁多糖和胞內(nèi)多糖可溶性組分溶出，如果膠和一些可溶性中性糖等，使得發(fā)酵后多糖各組分含量增加，由于細(xì)胞壁纖維中葡萄糖組分最多，所以發(fā)酵后葡萄糖含量較高。

圖4 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 GC-MS chromatogram of mixed monosaccharide standards

圖5 未發(fā)酵豆渣多糖色譜圖Fig.5 GC-MS Chromatogram of U-SRP

圖6 發(fā)酵豆渣多糖色譜圖Fig.6 GC-MS Chromatography of F-SRP

表2 發(fā)酵前后豆渣多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of soybean dregs polysaccharides before and after fermentation

2.3.5 熱穩(wěn)定性 用熱重分析評(píng)價(jià)樣品的熱穩(wěn)定性，通過觀察多糖樣品隨溫度的變化而發(fā)生物理或化學(xué)的變化[38]。測(cè)量結(jié)果如圖7所示，樣品均呈多步熱分解，熱分解過程可以劃分為兩個(gè)階段，第一階段是200 ℃以前為初始熱分解階段，U-SRP在200 ℃之前失重為7.86%，F(xiàn)-SRP失重為10.4%。在100 ℃左右F-SRP損失比U-SRP多，在此期間是由于吸收水的蒸發(fā)和半水合物的脫水而失重，200 ℃時(shí)兩者失重率相同。第二階段發(fā)生在200～400 ℃，兩者曲線都較陡，說明樣品失重急劇降低，說明是樣品中碳水化合物的降解所致，U-SRP比F-SRP失重較快，兩者殘余質(zhì)量都有降低，但F-SRP殘余質(zhì)量相對(duì)較高，說明F-SRP比U-SRP具有較高的熱穩(wěn)定性。從圖7中可以看出無論是U-SRP還是F-SRP在高溫下質(zhì)量都會(huì)有一定的損失。因此，建議食品加工溫度應(yīng)低于200 ℃，以避免改變樣品的物理性能指標(biāo)。

圖7 發(fā)酵前后豆渣多糖熱重分析Fig.7 TGA of soybean residue polysaccharides before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用粗壯脈紋孢菌發(fā)酵豆渣可以提高豆渣中多糖的含量，并且各理化組分含量都明顯升高。根據(jù)掃描電鏡和X-射線圖譜，F(xiàn)-SRP較疏松分散、不聚團(tuán)，發(fā)酵會(huì)破壞SRP的晶體結(jié)構(gòu)。傅里葉紅外光譜圖可以看出發(fā)酵后含有多糖特征吸收峰，有β-型糖苷鍵存在，發(fā)酵對(duì)SRP化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)沒有顯著影響。通過GC-MS對(duì)多糖中單糖組分進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果表明豆渣多糖中含量最高的是半乳糖，發(fā)酵豆渣中葡萄糖含量最高，發(fā)酵在酶的催化下使各種單糖組分發(fā)生改變，根據(jù)熱重分析得到，發(fā)酵豆渣多糖比豆渣多糖具有較高的熱穩(wěn)定性。

本研究通過探究發(fā)酵前后豆渣中的組成變化，以及對(duì)發(fā)酵前后豆渣中多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，表明發(fā)酵后豆渣組成成分得到提高，多糖的微觀結(jié)構(gòu)得到了改善，具有作為優(yōu)質(zhì)膳食纖維的潛力。為粗壯脈紋孢菌發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的植物多糖的實(shí)際應(yīng)用研究提供了科學(xué)理論基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)一步的應(yīng)用研究以及今后開發(fā)出具有科學(xué)針對(duì)性的多種有機(jī)功能性保健食品起到了重要的研究指導(dǎo)意義。