李彥軍,竇 欣，2,趙倩楠,張方劍,趙心夢,嚴(yán)維華,邊瑞娜,姚來君,毛跟年*

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽 712000)

敷料是一種對傷口愈合過程保持長期的清潔、殺菌、保護(hù)和提供治愈環(huán)境的止血材料[1]，在人體和動(dòng)物臨床方面具有廣泛的進(jìn)展。常用的傷口敷料有紗布[2-3]、繃帶[4]、泡沫[5]、海綿[6-7]等，但傳統(tǒng)敷料對傷口的愈合只起到保護(hù)免受二次傷害，對傷口愈合沒有較大的促進(jìn)作用。隨著對創(chuàng)傷愈合過程研究的不斷深化，利用天然聚合物多糖材料具有的生物相容性強(qiáng)[8]、易吸收、愈合受傷組織能力[9]、易降解等的特點(diǎn)，在生物敷料工程材料的研制和開發(fā)中都顯示了良好的應(yīng)用前景。

白及多糖(Bletillastriatapolysaccharide,BSP)是一種含有多羥基的甘露聚糖[10]，是從植物白及中提取的主要水溶性多糖，由1,4鏈甘露醇?xì)埢?,4鏈葡萄糖殘基鍵合而成的聚合物[11]。研究發(fā)現(xiàn)BSP具有抗炎[12]、抑菌[13]、清除自由基、抗腫瘤和止血[14]等特點(diǎn)。結(jié)合BSP的藥理學(xué)活性，廣泛的應(yīng)用于新型水凝膠系列生物醫(yī)用敷料，加速愈合的過程[15]。Xiang J等[16]制備了一種基于聚乙烯醇的BSP型水凝膠，以鼠的肝出血和斷尾為模型，在傷口失血量和止血方面表現(xiàn)優(yōu)異的特性。Zhang C等[17]制備了用于修復(fù)小鼠皮膚損傷的白及多糖水凝膠作為創(chuàng)面愈合貼片，以小鼠全切性皮膚創(chuàng)面為試驗(yàn)對象，結(jié)果顯示可顯著改善創(chuàng)面收縮、上皮形成、膠原沉積和炎癥反應(yīng)。然而，單純的BSP止血敷料存在機(jī)械性能差等問題，限制著BSP在該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan,KGM)作為同系列甘露聚糖的一部分，由D-甘露糖和D-葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵鍵合而成[18]，具有良好的凝膠性、成膜性、高吸水性、無毒性和熱穩(wěn)定性。在堿化和加熱處理的條件下，可形成高穩(wěn)定性的不可逆凝膠，該凝膠具有良好的吸濕、保濕功能[19]。利用KGM的生物學(xué)特性，提供基底材料高彈性和高孔隙率，吸附傷口創(chuàng)面的滲出物，提供一個(gè)穩(wěn)態(tài)的環(huán)境，促進(jìn)受傷創(chuàng)面的保濕和創(chuàng)傷表面藥物的釋放[17]。Xie Y等[20]制備一種羧基化的魔芋葡甘聚糖止血海綿，可加速皮膚損傷組織的再生。鑒于BSP和KGM生物材料的優(yōu)勢，將其制備成一種新型凝膠止血敷料，以期提高材料的彈性和抑菌性等性能。本文通過對BSP/KGM凝膠的制備工藝探索，研究凝膠敷料的結(jié)構(gòu)和抑菌性能，以期為BSP/KGM凝膠敷料的制備優(yōu)化提供可靠的支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 魔芋精粉，分子質(zhì)量200 ku～2 000 ku，湖北一致魔芋生物科技有限公司產(chǎn)品；白及(產(chǎn)地云南)，北京同仁堂醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；頭孢曲松鈉，Oxoid產(chǎn)品；氯仿、正丁醇、950 mL/L乙醇、氫氧化鈉(NaOH)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)(CMT4304)，深圳市三思試驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；臺式掃描電鏡(Phenom Pro)，Phenom公司產(chǎn)品；紅外光譜儀(VERTEX70)，Bruker公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)(FD5-2.5)，SIM公司產(chǎn)品；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S)，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 制備方法 將0.5 g白及和魔芋精粉以3∶1加入50 mL蒸餾水中，攪拌均勻，加入NaOH進(jìn)行混合，置于熱水浴中1 h，取出在室溫下放置至常溫后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到制備的BSP/KGM凝膠。

1.2.2 測試方法

1.2.2.1 吸水率測定 取一定量的樣品精密稱定后記為W0，放入盛有9 mg/g生理鹽水的燒杯中，分別在1、3、5、10、20 min時(shí)進(jìn)行稱重，并記為Wt，凝膠樣品吸水率公式為：

吸水率(%)=[(Wt-W0)/W0]×100%

1.2.2.2 機(jī)械強(qiáng)度測定 將樣品裁成啞鈴狀，測量其高度以及厚度后，夾入儀器中進(jìn)行測量。室溫下進(jìn)行測定，每個(gè)樣品平行測定3次。

1.2.2.3 水蒸氣透過量測定 使用100 mL的錐形瓶放入50 mL蒸餾水，稱量瓶子和水的總重記為W1，在瓶口的邊緣涂上凡士林，然后將冷凍干燥后的樣品放在瓶口上并將瓶口周圍纏上保鮮膜后進(jìn)行密封，放在干燥器中24 h后，取下水凝膠樣品，稱量試劑瓶和蒸餾水的總重記為W2，平行測試3次，樣品透氣率公式：

透氣量ε=(W1-W2)/(t·πr2·h)

公式中t表示測試時(shí)間(h)，r表示樣品半徑(m)，h表示樣品厚度(m)。

1.2.2.4 紅外光譜分析 將樣品置于真空干燥箱中干燥，用紅外漫反射的方法在波數(shù)為4 000 cm-1～600 cm-1、分辨率為0.4cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.2.5 X-射線衍射分析 將樣品冷凍干燥后，放于X-射線衍射儀中進(jìn)行分析，掃描角度在10°～70°范圍，掃描速度為4°/min進(jìn)行衍射分析。

1.2.2.6 掃描電子顯微鏡分析 樣品置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h后，將裁剪好的干燥樣品，經(jīng)噴金處理后，用Phenom Pro型掃描電鏡對樣品進(jìn)行掃描。

1.2.2.7 抑菌性能檢查 將樣品用打孔器制成直徑為0.5 cm的圓片，分別放入培養(yǎng)好的大腸埃希氏菌及金黃色葡萄糖菌培養(yǎng)皿中，并放入等大小的頭孢曲松鈉試紙作為陽性對照，在37 ℃下培養(yǎng)36 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 制備工藝優(yōu)化

通過堿濃度、溫度和白及多糖與魔芋葡甘聚糖的用量比例為指標(biāo)來確定BSP/KGM凝膠的最佳制備工藝。

2.1.1 氫氧化鈉濃度的影響 將BSP與KGM以1∶1混合后加入不同濃度的氫氧化鈉，在同一溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，經(jīng)冷凍干燥后對其吸水率、應(yīng)力及透氣量的測定。結(jié)果見圖1，凝膠化時(shí)間隨氫氧化鈉濃度的增加而縮短，說明KGM經(jīng)脫乙酰，加快了凝膠的形成，堿濃度越大，脫乙酰反應(yīng)越迅速。當(dāng)吸水率在堿的濃度為2 mg/g時(shí)，凝膠化效果最好，在氫氧化鈉濃度達(dá)2 mg/g之后，隨著氫氧化鈉濃度的增大，吸水能力逐漸降低。氫氧化鈉的濃度對最大應(yīng)力影響不太大。因此，BSP/KGM凝膠中氫氧化鈉的最佳堿配比為2 mg/g。

圖1 NaOH濃度對凝膠的凝膠化時(shí)間、透氣量、吸水率和最大應(yīng)力的影響

2.1.2 溫度影響 將BSP/KGM凝膠以1∶1混合后加入2 mg/g的氫氧化鈉，在不同溫度下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)，經(jīng)冷凍干燥后對其進(jìn)行吸水率、應(yīng)力及透氣量的測定。結(jié)果見圖2，隨著溫度的增加，凝膠化時(shí)間逐漸縮短，但溫度對其他性能的影響較小，溫度對凝膠體系形成凝膠的時(shí)間有影響。因此，BSP/KGM凝膠最佳凝膠溫度為70 ℃。

圖2 溫度對凝膠的凝膠化時(shí)間、透氣量、吸水率和最大應(yīng)力的影響

2.1.3 BSP與KGM的比例的影響 將BSP與KGM以不同比例混合后加入2 mg/g的氫氧化鈉，在70 ℃下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)后冷凍干燥，得到凝膠并對其進(jìn)行吸水率、應(yīng)力及透氣量的測定。結(jié)果見圖3，當(dāng)BSP與KGM的比例為3∶1時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度最好；BSP與KGM的比例為4∶1時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度最差；可能是BSP/KGM凝膠體系中，其機(jī)械強(qiáng)度來自于KGM，KGM所占比例越大，凝膠體系機(jī)械強(qiáng)度最好，隨著BSP比例的增加，凝膠整體機(jī)械強(qiáng)度逐漸減弱。吸水率及透氣量在BSP與KGM比例1∶3、2∶1與3∶1范圍內(nèi)參數(shù)變化較小。因此，BSP與KGM最佳比例選擇為3∶1。

圖3 BSP與KGM的比例對凝膠的透氣量、吸水率和最大應(yīng)力的影響

2.2 性能表征

2.2.1 結(jié)構(gòu)分析 將KGM、BSP和BSP/KGM凝膠紅外譜圖進(jìn)行對比分析，結(jié)果見圖4，在1 629.78 cm-1處出現(xiàn)了C=0伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的強(qiáng)吸收峰，表明KGM中含有的羥基和羧基親水基團(tuán)，KGM分子的特征峰位于671.2 cm-1和3 589.37 cm-1處，代表了KGM中的基本單元，在1 629.78 cm-1處有特征峰，說明有乙酰基存在，乙?；荎GM所特有的，在1 630 cm-1左右有吸收峰，說明有羧基存在。KGM在3 494.86 cm-1和1 095.52 cm-1處分別出現(xiàn)-OH和C-O的伸縮振動(dòng)峰，兩張圖譜進(jìn)行對照表明，BSP紅外圖譜中C-O的伸縮振動(dòng)峰與KGM中C-O的伸縮振動(dòng)峰位置相同，證明了BSP與KGM有著極其相似的結(jié)構(gòu)。

圖4 KGM、BSP、BSP/KGM凝膠紅外譜圖

將KGM、BSP和BSP/KGM凝膠XRD進(jìn)行對比分析，結(jié)果見圖5，純KGM的2θ在26.984°、42.641°處有很強(qiáng)的干涉，對應(yīng)的面間距d數(shù)值為3.834 0、2.460 2。BSP的2θ在17.723°、23.158°處有較強(qiáng)的干涉，在33.465°、37.248°處有干涉，對應(yīng)的面間距d數(shù)值為5.806 6、4.456 4、3.106 9和2.800 9。BSP/KGM凝膠2θ在13.971°、24.924°處有較強(qiáng)的干涉，27.651°、31.002°有干涉，對應(yīng)的面間距d數(shù)值為7.354 9、4.145 1、3.743 1和3.346 9。與純KGM和BSP相比，BSP/KGM凝膠混合后，可明顯的看到在13.971°時(shí)，有較強(qiáng)的峰，表明在13.971°的峰應(yīng)為NaOH對KGM脫乙酰時(shí)的殘留。BSP衍射特征峰23°左右，但是與KGM的衍射峰重疊，證明了BSP與KGM的結(jié)構(gòu)極為相似。

圖5 KGM、BSP、BSP/KGM凝膠XRD圖

由以上兩項(xiàng)可以證明，BSP與KGM在結(jié)構(gòu)上相似，在進(jìn)行了混合制備凝膠過后，BSP與KGM進(jìn)行互穿形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但本身性質(zhì)未發(fā)生變化。

2.2.2 電鏡掃描分析 KGM凝膠與BSP/KGM混合后的電鏡掃描顯示出孔隙狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖6，由圖6b～d可清晰的看到孔隙的完整結(jié)構(gòu)，最大孔徑300 μm左右，孔的形成是材料具有吸收性及透氣性的前提，孔隙越多，連通性越好，越有利于傷口的愈合?？紫堵矢呒斑B通性能夠使干性凝膠具有更好的吸水性，能夠吸收傷口滲出的液體或傷口出血，將液體吸收在孔隙中，保持創(chuàng)面干燥，防止?jié)B出液污染傷口引起細(xì)菌感染，并能維持傷口的濕潤環(huán)境，讓傷口更容易愈合。從圖6d可以看出，BSP和KGM混合后的干燥凝膠孔隙相對均勻，大小一致，為BSP/KGM凝膠具有良好的吸水性、透氣性提供良好的空間結(jié)構(gòu)。

a.BSP/KGM凝膠實(shí)物圖；b.KGM凝膠；c、d.BSP/KGM凝膠A.BSP/KGM gel physical diagram；b.KGM gel；c，d.BSP/KGM gel

2.2.3 抑菌試驗(yàn)

2.2.3.1 BSP/KGM凝膠對金黃色葡萄球菌抑菌效果 以純KGM作為陰性對照，樣品對金黃色葡萄球菌抑菌結(jié)果見圖7，圖7b無抑菌圈，表明純的KGM對金黃色葡萄球菌無抑菌效果，頭孢曲松鈉作為陽性對照，抑菌效果最為明顯，當(dāng)樣品加入白及后，圖7d出現(xiàn)抑菌圈，表明白及對金黃色葡萄球菌有抑菌效果，抑菌圈直徑為9 mm，且白及的含量越多，抑菌效果越明顯。

A.陽性對照；b.純KGM；c.BSP/KGM 1∶1混合；d.BSP/KGM 4∶1混合A.Positive control；b.Pure KGM；c.BSP/KGM 1∶1 mixed；d.BSP/KGM 4∶1 mixed

2.2.3.2 BSP/KGM凝膠對大腸埃希氏菌抑菌效果 樣品對大腸埃希氏菌抑菌結(jié)果見圖8，頭孢曲松鈉作為陽性對照，抑菌圈直徑25 mm，抑菌效果最明顯，圖8b周圍無抑菌圈，表明純KGM對大腸埃希氏菌并無抑菌效果。當(dāng)樣品加入白及后，圖8d出現(xiàn)抑菌圈，證明白及有抑菌效果，且白及的含量越多，對大腸埃希氏菌抑菌效果越顯著。

a.陽性對照；b.純KGM；c.BSP/KGM 1∶1混合；d.BSP/KGM 4∶1混合A.Positive control；b.Pure KGM；c.BSP/KGM 1∶1 mixed；d.BSP/KGM 4∶1 mixed

結(jié)果表明，純KGM并無抑菌效果，而加入白及之后出現(xiàn)明顯抑菌圈，說明白及有很好的抑菌效果，而且白及對大腸埃希氏菌的抑菌效果明顯優(yōu)于金黃色葡萄球菌。

3 討論

通過凍融制備工藝技術(shù)，采用單因素法確定制備的BSP/KGM凝膠最佳制備工藝，當(dāng)氫氧化鈉用量為2 mg/g，溫度為70 ℃，BSP與KGM質(zhì)量比3∶1時(shí)，凝膠的吸水率、透氣量、機(jī)械強(qiáng)度和抑菌效果等方面均有較理想的結(jié)果。采用此方法制備的凝膠能夠使傷口保持適宜的濕潤度，能夠使?jié)B出液迅速吸收，為制備的BSP/KGM凝膠在止血抑菌敷料的研究和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。