李大命 劉洋 唐晟凱 劉燕山 蔡永久 谷先坤 殷稼雯 蔣琦辰 張彤晴

(1 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210017；2 南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210046； 3 中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210008)

翹嘴鲌(Culteralburnus)、達(dá)氏鲌(Culterdabryi)、蒙古鲌(Cultermongolicus)均隸屬于鯉形目(Cypriniformes)，鯉科( Cyprinidae)，鲌亞科(Culterinae)，鲌屬(Culter)[1]。鲌魚在我國分布廣泛，是內(nèi)陸水域中重要的經(jīng)濟(jì)魚類，在很多湖泊及水庫中的漁獲量較大[2-4]。鲌魚肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，富含多種氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[5]。作為湖泊和水庫生態(tài)系統(tǒng)中主要的頂級消費(fèi)者，鲌魚的種群變動(dòng)對于魚類及其他生物群落都具有重要影響，在水生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)價(jià)值[6-7]。近年來，由于過度捕撈、棲息地改變、水質(zhì)污染等人為因素影響，鲌魚天然資源急劇衰退，并呈現(xiàn)出低齡化、小型化的趨勢，保護(hù)鲌魚種質(zhì)資源刻不容緩[8-10]。

國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)是為了實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)種質(zhì)資源及其生存環(huán)境的保護(hù)和合理利用，依法予以特殊保護(hù)和管理的水產(chǎn)種質(zhì)資源主要生長繁殖區(qū)域。滆湖鲌類國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)位于江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)西南處滆湖水域的北端，保護(hù)區(qū)面積為1 520 hm2，其中核心區(qū)面積509 hm2，實(shí)驗(yàn)區(qū)面積1 011 hm2，保護(hù)期為全年，主要保護(hù)對象為翹嘴鲌、蒙古鲌及達(dá)氏鲌。多年來，受氣候變化、過度捕撈、環(huán)境污染、工程建設(shè)等因素的影響，水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)的保護(hù)對象生存受到巨大威脅，同時(shí)，對其遺傳狀況也缺乏了解[11]。

遺傳多樣性是評價(jià)物種資源狀況的1個(gè)重要指標(biāo)，也是物種適應(yīng)周圍環(huán)境變化、維持生存和進(jìn)化的基礎(chǔ)，研究物種的遺傳多樣性對于評估物種資源現(xiàn)狀、制定野生種群保護(hù)策略以及合理利用種質(zhì)資源等方面具有重要意義[12-13]。魚類的線粒體基因組是1種雙鏈DNA分子，具有分子小、結(jié)構(gòu)簡單、編碼效率高、母系遺傳、重組率低、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，已成為群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究的重要分子標(biāo)記[14-15]。細(xì)胞色素b(cytochromeb,Cytb)基因長度適宜，進(jìn)化速度適中，有通用引物便于擴(kuò)增，因而是研究魚類遺傳變異的良好的分子標(biāo)記[16-18]。本研究采用Cytb基因序列，首次對滆湖鲌類國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)主要保護(hù)對象的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，研究結(jié)果一方面用于評估保護(hù)區(qū)對象的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，另一方面可為魚類種質(zhì)資源的科學(xué)保護(hù)及合理利用提供基礎(chǔ)資料及參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 魚類樣品采集和處理

2019年7月至11月和2020年5月、9月，在滆湖鲌類國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)開展?jié)O業(yè)資源調(diào)查。利用3層刺網(wǎng)采集魚類樣本，刺網(wǎng)網(wǎng)長125 m，網(wǎng)高1.5 m，網(wǎng)目長度為2～14 cm。魚類種類鑒定依據(jù)《江蘇魚類志》[2]，共采集翹嘴鲌25尾，蒙古鲌18尾，達(dá)氏鲌50尾?，F(xiàn)場剪取樣本的肌肉組織，置于無水乙醇中保存。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

采用TakaraBio公司的廣譜性基因組試劑盒提取魚類肌肉組織的基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA完整性，并利用紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度。

利用通用引物L(fēng)14724和H15915[19]擴(kuò)增Cytb基因序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 2 μL，剩余體積用超純水補(bǔ)足。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，將條帶清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 序列分析

利用BioEdit 7.0軟件[20]讀取序列，進(jìn)行編輯和比對，并輔以人工校正。利用DnaSP 5.0軟件[21]分析序列的變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)、單一信息位點(diǎn)，計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性(haplotype diversity,h)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)以及平均核苷酸差異數(shù)(K)。使用MEGA 6.0軟件[22]計(jì)算序列的堿基組成、種群內(nèi)及種群間的遺傳距離，以鯉為外類群，選用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建鲌魚的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Arlequin 3.11軟件[23]進(jìn)行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)，并開展核苷酸不配對分布檢測，進(jìn)行種群動(dòng)態(tài)分析。

2 結(jié)果

2.1 線粒體Cytb基因序列堿基組成

經(jīng)分析和比對，獲得3種鲌魚的線粒體Cytb基因全序列，其全長為1 141 bp，所有序列均無堿基插入或缺失。3種鲌魚的堿基組成相似，種類之間差異很小。3種鲌魚堿基A、T、C、G的平均含量分別為28.9%、27.5%、28.8%和14.8%，A+T的含量(56.4%)高于G+C的含量(43.6%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性。A+T含量的排列順序由高到低依次為達(dá)氏鲌(56.8%)、蒙古鲌(56.4%)和翹嘴鲌(56.0%)(見表1)。

表1 3種鲌魚線粒體Cytb基因序列的堿基組成

2.2 遺傳多樣性和單倍型組成

翹嘴鲌的線粒體Cytb基因序列有16個(gè)變異位點(diǎn)，其中9個(gè)單一信息位點(diǎn)，7個(gè)簡約信息位點(diǎn)，單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.907和0.002 4；蒙古鲌Cytb基因序列有8個(gè)變異位點(diǎn)，全部是簡約信息位點(diǎn)，其單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.863和0.002 4；達(dá)氏鲌Cytb基因序列有10個(gè)變異位點(diǎn)，其中3個(gè)單一信息位點(diǎn)，7個(gè)簡約信息位點(diǎn)，其單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分別為0.573和0.001 2(見表2)。單倍型多樣性(h)從高到低依次為翹嘴鲌、蒙古鲌和達(dá)氏鲌，核苷酸多樣性(π)從高到低依次為蒙古鲌、翹嘴鲌和達(dá)氏鲌。

表2 3種鲌魚線粒體Cytb基因的遺傳多樣性參數(shù)

翹嘴鲌群體由14種單倍型(QH1～QH14)組成，單倍型QH2的數(shù)量最多，有10個(gè)樣本，QH4和QH8各有2個(gè)樣本，其余單倍型各有1個(gè)樣本；蒙古鲌群體由6種單倍型(MH1～MH6)組成，單倍型MH1的數(shù)量最多，有10個(gè)個(gè)體，單倍型MH2、MH3和MH4各有2個(gè)個(gè)體，單倍型MH5和MH6各有1個(gè)個(gè)體；達(dá)氏鲌群體由7種單倍型(DH1～DH7)組成，單倍型DH1的數(shù)量最多，有31個(gè)個(gè)體，單倍型DH6有11個(gè)個(gè)體，單倍型DH3、DH5和DH7各有2個(gè)個(gè)體，其余單倍型各有1個(gè)個(gè)體(見表2)。

2.3 遺傳距離

3種鲌魚的種內(nèi)遺傳距離顯示(見表3)，達(dá)氏鲌、翹嘴鲌和蒙古鲌群體內(nèi)的平均遺傳距離分別為0.001、0.002和0.002。3種鲌魚群體間的遺傳距離為0.053～0.072，其中翹嘴鲌和蒙古鲌間的遺傳距離最大，翹嘴鲌和達(dá)氏鲌間的遺傳距離最小。

表3 3種鲌魚的群體內(nèi)(對角線)及群體間(下三角)遺傳距離

以鯉為外類群，基于鄰接法(NJ)構(gòu)建3種鲌魚的單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖1)。結(jié)果顯示，3種鲌魚均形成獨(dú)立的進(jìn)化分支，分支置信限水平均為100%，鯉單獨(dú)聚為一支，說明Cytb基因是區(qū)分和鑒別3種鲌魚的有效分子標(biāo)記。

圖1 基于鄰接法的3種鲌魚系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 種群進(jìn)化歷史

對3種鲌魚進(jìn)行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示(見表4)，中性檢驗(yàn)的D值和Fs值均為負(fù)值，且翹嘴鲌F(tuán)s值統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著性(P<0.05)，說明3種鲌魚在進(jìn)化過程中偏離了中性選擇。另外，3種鲌魚的歧點(diǎn)分布圖(見圖2)呈較明顯的單峰型，結(jié)合中性檢驗(yàn)結(jié)果，表明3種鲌魚在歷史上經(jīng)歷了種群擴(kuò)張。

表4 3種鲌魚的中性檢驗(yàn)結(jié)果

圖2 3種鲌魚Cytb基因序列錯(cuò)配堿基分布

3 討論

3.1 3種鲌魚的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，也是評價(jià)生物種質(zhì)資源狀況及制定種質(zhì)資源保護(hù)措施的重要依據(jù)。通常選用單倍型多樣性(h)及核苷酸多樣性(π)兩個(gè)參數(shù)用于評價(jià)群體的遺傳多樣性水平，h和π值越大，表示群體的遺傳多樣性越豐富[24-25]。本研究結(jié)果顯示，滆湖鲌類保護(hù)區(qū)3種鲌魚的單倍型多樣性為0.573～0.907，核苷酸多樣性0.001 2～0.002 4，其中翹嘴鲌和蒙古鲌的遺傳多樣性水平較高，達(dá)氏鲌的遺傳多樣性水平較低，說明保護(hù)區(qū)內(nèi)3種鲌魚的遺傳多樣性存在較大差異。同樣，其他水域不同種類的鲌魚群體遺傳多樣也有明顯差異[26-28]?；贑OI序列的三峽庫區(qū)翹嘴鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0～0.990 5和0～0.014 1，蒙古鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0.866 7～1.0和0.002 2～0.002 4，達(dá)氏鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0～1和0～0.071 5[26]；基于COI序列的長江中下游5個(gè)達(dá)氏鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0.412 3(0～0.600)和0.001 1(0～0.001 5)[27]，5個(gè)蒙古鲌群體的單倍型和核苷酸多樣性分別為0.664(0～0.800)和0.002(0～0.003)[28]。根據(jù)Grant和Bowrn[29]提出的魚類遺傳多樣性大小標(biāo)準(zhǔn)，即單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別以0.5和0.005為界值，本研究中3種鲌魚的遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式，這種遺傳多樣性模式是魚類受瓶頸效應(yīng)后種群數(shù)量迅速擴(kuò)張導(dǎo)致的。由于核苷酸多樣性所需的時(shí)間比積累單倍型所需的時(shí)間漫長，因而形成高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。另外，這種遺傳多樣性模式暗示，3種鲌魚群體在進(jìn)化歷史上經(jīng)歷過群體擴(kuò)張事件。3種鲌魚的中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Tajima’sD值和Fu’sFs值均為負(fù)值，且翹嘴鲌統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著性，同時(shí)，3種鲌魚的歧點(diǎn)分布圖呈現(xiàn)較明顯的單峰型，表明3種鲌魚在進(jìn)化歷史上經(jīng)歷過種群擴(kuò)張過程[30-32]，與其遺傳多樣性模式相對應(yīng)。

3.2 3種鲌魚的遺傳結(jié)構(gòu)

研究表明，基于mtDNA序列的魚類種內(nèi)遺傳變異在10%以內(nèi)[33]。Hebert等[34]基于COI序列對動(dòng)物間的遺傳變異進(jìn)行研究，結(jié)果表明，種內(nèi)遺傳距離大多在2%以下，種間遺傳距離比種內(nèi)遺傳距離大10倍以上。本研究結(jié)果顯示，3種鲌魚的種內(nèi)遺傳距離在0～0.006，種內(nèi)遺傳變異遠(yuǎn)小于2%，表明3種鲌魚的種內(nèi)遺傳變異較小。這是因?yàn)楸Ｗo(hù)區(qū)面積相對較小，沒有地理隔離限制，3個(gè)群體的種內(nèi)個(gè)體間具有廣泛的基因交流。從群體的遺傳組成來看，群體的遺傳結(jié)構(gòu)趨于單一化，單個(gè)單倍型占群體的比例較高。比如，翹嘴鲌由14種單倍型組成，單倍型QH2有10個(gè)，占比為40.0%；蒙古鲌由6種單倍型組成，單倍型MH1有10個(gè)，占比為55.6%；達(dá)氏鲌由7種單倍型組成，單倍型DH1的數(shù)量為31個(gè)，占比高達(dá)62.0%。可能是因?yàn)?種鲌魚的有效群體數(shù)量較小，導(dǎo)致遺傳結(jié)構(gòu)受遺傳漂變的影響較大，因而形成單一化的遺傳結(jié)構(gòu)模式[35]。

3.3 種質(zhì)資源管理和保護(hù)建議

鲌魚具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營養(yǎng)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，但近年來，其種群資源量急劇下降，并呈現(xiàn)出小型化、低齡化的趨勢。本研究結(jié)果顯示，保護(hù)區(qū)3種鲌魚的單倍型多樣性較高，而核苷酸多樣性較低，遺傳結(jié)構(gòu)趨于單一化。結(jié)合滆湖生態(tài)環(huán)境和鲌魚的生物學(xué)特征，需要采取針對性措施恢復(fù)鲌魚資源，提高鲌魚群體的遺傳多樣性水平。建議：(1)開展鲌魚增殖放流，增加魚類種群數(shù)量，優(yōu)化魚類遺傳結(jié)構(gòu)；(2) 控制滆湖環(huán)境污染，治理藍(lán)藻水華，改善魚類棲息環(huán)境；(3)建設(shè)人工魚巢，構(gòu)建水域生態(tài)牧場，增加鲌魚產(chǎn)卵和孵化的基質(zhì)和空間；(4)嚴(yán)格漁業(yè)執(zhí)法，嚴(yán)厲打擊非法捕撈行為，保護(hù)魚類繁殖和生長。