袁博 張娜 景明 天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 （天津 300384）

內(nèi)容提要： 目的：對(duì)納米銀抗菌凝膠進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。方法：試驗(yàn)選用L929小鼠成纖維細(xì)胞，通過MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)，對(duì)被測(cè)物進(jìn)行研究。結(jié)果：MTT試驗(yàn)的LC50為0.047g/mL，LDH試驗(yàn)的LC50為0.048g/mL。結(jié)論：納米銀離子會(huì)破壞細(xì)胞線粒體和細(xì)胞膜完整性。

納米銀材料具有高比表面積、廣譜抗菌性能等優(yōu)良特性，在醫(yī)用抗菌敷料、生殖健康、手術(shù)器械等醫(yī)療器械方面具有廣闊的應(yīng)用前景。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局已將納米生物材料類醫(yī)療器械（如納米金屬銀材料制成的醫(yī)療器械）明確規(guī)定為第三類醫(yī)療器械管理，并重點(diǎn)關(guān)注其在細(xì)胞毒性、基因毒性等生物相容性方面的研究。納米材料本身會(huì)引起細(xì)胞線粒體功能障礙，使細(xì)胞膜通透性改變與破損，起到殺菌抗菌的作用同時(shí)會(huì)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，檢測(cè)被測(cè)物接觸細(xì)胞后細(xì)胞發(fā)生生長(zhǎng)抑制、功能改變、溶解、死亡或其他毒性反應(yīng)，是醫(yī)療器械或醫(yī)用材料生物學(xué)評(píng)價(jià)體系中最重要的檢測(cè)指標(biāo)之一，在國(guó)內(nèi)外生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中均將細(xì)胞毒性試驗(yàn)列為首選項(xiàng)目[1,2]。本試驗(yàn)選用L929小鼠成纖維細(xì)胞，通過MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)，對(duì)被測(cè)物進(jìn)行研究。

1.材料與方法

1.1 一般材料

實(shí)驗(yàn)起止時(shí)間為：2021年6月～2022年10月。

試驗(yàn)材料：納米銀婦女外用抗菌凝膠（來源：市售，規(guī)格：3支/盒，標(biāo)識(shí)有效成分含量：納米銀含量>400μg/g）。

細(xì)胞株：L929小鼠成纖維細(xì)胞（來源：中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。

主要試劑與材料：胎牛血清（來源：Gibco公司）、MEM培養(yǎng)基干粉（來源：Gibco公司）、四唑鹽（MTT，來源：Solarbio公司）、二甲基亞砜（DMSO，來源：Merck公司）、高密度聚乙烯薄膜（來源：上?？肆秩R塑料有限公司保鮮袋）、對(duì)乙酰氨基酚（來源：國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司）、Triton-X-100（來源：Amresco公司）、LDH試劑盒（來源：Roche）。

儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：Nu-5500E）、電子天平（型號(hào)：JJ600）、倒置顯微鏡（型號(hào)：TS100）、酶標(biāo)儀（型號(hào)：TECAN SUNRISE TS）。

1.2 方法

選用L929小鼠成纖維細(xì)胞作為試驗(yàn)體系，以納米銀抗菌凝膠為測(cè)試對(duì)象，將納米銀婦女外用抗菌凝膠直接稀釋于含10%血清細(xì)胞培養(yǎng)基中，按0.1g/mL稀釋原液、70%、60%、50%、40%、30%稀釋液設(shè)立濃度，同時(shí)設(shè)空白、陰性、陽性對(duì)照組，接觸細(xì)胞24h后分別進(jìn)行細(xì)胞毒性的MTT測(cè)定和LDH測(cè)定，計(jì)算LC50。

1.2.1 試驗(yàn)液制備

試驗(yàn)樣品稀釋液制備：取樣品2.90g，加入29.0mL含10%血清培養(yǎng)基，震蕩混合均勻后，用含10%血清培養(yǎng)基配制成70%、60%、50%、40%、30%稀釋液。

空白對(duì)照組的設(shè)立：含10%血清培養(yǎng)基于（37±1）?C下放置（24±2）h，于（37±1）?C下放置（24±2）h。

陰性對(duì)照組的設(shè)立：取1張表面積為24cm2的無菌高密度聚乙烯薄膜，按6cm2/mL的比例加4mL的含10%血清培養(yǎng)基，于（37±1）?C下放置（24±2）h。

陽性對(duì)照組的設(shè)立：用含10%血清培養(yǎng)基配制濃度為30mmol/L的對(duì)乙酰氨基酚，用于MTT試驗(yàn)的陽性對(duì)照。用含10%血清培養(yǎng)基配制濃度為1%的Triton-X-100，用于LDH試驗(yàn)的陽性對(duì)照。

1.2.2 試驗(yàn)方法

細(xì)胞準(zhǔn)備：取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度約為1×105/mL，制成細(xì)胞懸液。在每塊96孔板上板設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照、各組稀釋液、對(duì)乙酰氨基酚陽性對(duì)照和Triton-X-100陽性對(duì)照。每組共6孔，其中前5孔各接種100μL細(xì)胞懸液，后1孔設(shè)立各相應(yīng)無細(xì)胞空白對(duì)照，加入100μL不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。在96孔板外圍一圈加入100μL培養(yǎng)基。置37?C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，以使細(xì)胞達(dá)到近匯合狀態(tài)，保證細(xì)胞恢復(fù)、貼壁并增殖到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

MTT測(cè)定：除陽性對(duì)照組外，棄去各組原培養(yǎng)基，依次加入100μL相應(yīng)制備液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。24h后，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，棄去陽性對(duì)照組孔內(nèi)的液體，加入100μL 1% Triton-X-100。室溫下放置10min，700g離心3min后，從初始96孔板中取出各組液體，50μL/孔，轉(zhuǎn)移至另一塊96孔板，準(zhǔn)備進(jìn)行LDH試驗(yàn)。棄去初始96孔板內(nèi)的所有液體，每孔加200μL的新鮮培養(yǎng)基，每孔再加入50 μL的MTT溶液，37?C下孵育4h。取出96孔板，700g離心3min，棄去培養(yǎng)基和MTT溶液，每孔加200 μL DMSO，再添加25 μL甘氨酸緩沖液，置振蕩器上混勻10min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)650nm。

LDH測(cè)定：各組與細(xì)胞接觸24h后，從初始96孔板中取出各組液體，每孔中吸出50μL，轉(zhuǎn)移至另一塊96孔板（按原來模板的樣品分布分別轉(zhuǎn)移），暫放4?C保存，盡快取出已有轉(zhuǎn)移出50μL液體的96孔板，按照LDH測(cè)定試劑盒說明書的要求進(jìn)行試驗(yàn)。每孔加入50μL反應(yīng)混合液后混勻。室溫下避光孵育30min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)650nm。

2.結(jié)果

每組測(cè)試各重復(fù)5個(gè)孔，計(jì)算時(shí)扣除其相應(yīng)的無細(xì)胞空白組的吸光值后，依次計(jì)算MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)的結(jié)果，見表1。結(jié)果顯示陰性和陽性對(duì)照均在預(yù)期范圍內(nèi)，進(jìn)一步將各稀釋濃度和MTT增殖率、LDH釋放率分別進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，得到濃度-反應(yīng)曲線，見圖1～2，分別計(jì)算出MTT試驗(yàn)的LC50為0.047g/mL，LDH試驗(yàn)的LC50為0.048g/mL。

圖1.MTT試驗(yàn)劑量-反應(yīng)曲線

圖2.LDH試驗(yàn)劑量-反應(yīng)曲線

表1.LDH試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)各組結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

3.討論

納米銀抗菌凝膠多由納米銀和醫(yī)用高分子凝膠構(gòu)成。納米銀抗菌凝膠外用于皮膚后，通過凝膠作為藥物緩釋載體，能夠緩釋放出納米銀顆粒，抑制并殺滅與之接觸的病菌，同時(shí)，凝膠為傷口提供濕潤(rùn)、封閉環(huán)境，促進(jìn)傷口愈合?，F(xiàn)有研究表明，納米銀具有廣譜抗菌作用，納米銀可以在細(xì)菌內(nèi)膜中積聚，增加膜通透性，并與細(xì)菌細(xì)胞壁中的含硫蛋白質(zhì)相互作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌壁破裂。同時(shí)也可以進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)部，與細(xì)菌DNA和蛋白質(zhì)中的硫或磷基團(tuán)、以及酶中硫醇基團(tuán)相互作用從而誘導(dǎo)活性氧和自由基產(chǎn)生，激活凋亡途徑[3]。但納米銀本身能夠改變與破壞細(xì)胞膜的通透性，穿透細(xì)胞膜的特點(diǎn)也可以使其裂解正常細(xì)胞，從而引起正常細(xì)胞線粒體功能障礙，因此，納米銀起到殺菌抗菌的作用同時(shí)會(huì)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，同時(shí)有研究表明，納米銀的細(xì)胞毒性與濃度呈劑量依賴關(guān)系，并且與直徑呈負(fù)相關(guān)[4]。因此，醫(yī)療器械在研制開發(fā)應(yīng)中結(jié)合其可能導(dǎo)致的細(xì)胞毒性合理使用納米銀材料。

本試驗(yàn)選用L929小鼠成纖維細(xì)胞，通過MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)，對(duì)被測(cè)物進(jìn)行研究。兩個(gè)方法均是檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在活細(xì)胞中，通過有機(jī)溶劑復(fù)溶細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與存活細(xì)胞數(shù)成正比?；罴?xì)胞的胞漿內(nèi)含有乳酸脫氫酶LDH，正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞的殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外，當(dāng)LDH氧化乳酸形成丙酮酸鹽后，丙酮酸鹽和四唑鹽反應(yīng)轉(zhuǎn)化成甲臜，該甲臜染料可溶于水，并可通過酶標(biāo)儀在490nm處檢測(cè)吸光度值用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性，LDH的釋放量與存活細(xì)胞數(shù)成反比。

隨著納米科技的發(fā)展，人們對(duì)納米銀材料的研究越來越深入，銀在納米狀態(tài)下可以緩慢地、長(zhǎng)時(shí)間釋放銀離子，具有極強(qiáng)的殺菌、抗菌作用。目前納米銀作為抗菌材料在醫(yī)療器械領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，因而非常有必要對(duì)常見的納米銀醫(yī)療器械進(jìn)行生物安全性研究。納米銀醫(yī)療器械表現(xiàn)的細(xì)胞毒性和其本身的特性有著密切的關(guān)系，可以通過利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方式來評(píng)價(jià)生物材料和醫(yī)療器械或其浸提液中潛在的細(xì)胞毒性，納米銀粒子比較容易透過細(xì)胞膜上的孔隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或進(jìn)入包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基體和細(xì)朐核等細(xì)胞器內(nèi)，并且和生物大分子發(fā)生結(jié)合或催化化學(xué)反應(yīng)，使生物大分子和生物膜的正常立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞毒性。因此在開發(fā)研制納米銀醫(yī)療器械過程中，利用其具有抗菌抑菌的高效性的同時(shí)，還要看它是否對(duì)正常組織細(xì)胞是否有較低的毒性，具有較好的生物相容性，確保納米銀醫(yī)療器械在臨床安全有效的使用。

為完善科學(xué)合理的評(píng)價(jià)方法和樣品制備方法，本試驗(yàn)參考ISO 10993-5:2009、ISO 10993-12:2012和美國(guó)ASTM/E2526-08的細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法（MTT試驗(yàn)、LDH試驗(yàn)）的要求[5,6]，對(duì)納米銀抗菌凝膠進(jìn)行樣品制備并評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性。

3.1 方法的選擇

結(jié)合納米銀材料本身會(huì)引起細(xì)胞線粒體功能的影響及對(duì)細(xì)胞膜的損傷的特點(diǎn)，為排除產(chǎn)品自身可能對(duì)MTT試驗(yàn)產(chǎn)生的一定干擾因素，本次細(xì)胞毒性研究增加了LDH試驗(yàn)方法，用以評(píng)價(jià)納米顆粒對(duì)細(xì)胞膜的損傷，以獲得準(zhǔn)確全面的結(jié)果。

根據(jù)納米銀材料不同的細(xì)胞毒性機(jī)制來選擇相應(yīng)的陰性，陽性對(duì)照材料。高密度聚乙烯具有較好的生物相容性，是常用于生物學(xué)評(píng)價(jià)中的陰性對(duì)照品?；贏PAP的細(xì)胞毒性機(jī)制為通過提高ROS因子的含量，進(jìn)而破壞細(xì)胞線粒體的功能，最后導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，這點(diǎn)與納米材料的細(xì)胞毒性機(jī)制相似，故選擇該材料作為MTT試驗(yàn)陽性對(duì)照材料。Triton-X-100的細(xì)胞毒性機(jī)制為破壞細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致乳酸脫氫酶的大量釋放，這點(diǎn)與納米材料的另一細(xì)胞毒作用機(jī)制相符，故選擇該材料為L(zhǎng)DH試驗(yàn)的陽性對(duì)照材料。

3.2 試驗(yàn)條件的選擇

不同的浸提介質(zhì)和浸提條件可能會(huì)影響納米顆粒的表面特性，如：顆粒的大小、顆粒的聚集特性、表面電荷的變化、蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的吸附、離子的釋放等，進(jìn)而影響納米材料的細(xì)胞毒性反應(yīng)。根據(jù)目前的認(rèn)知水平，可以使用含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基做溶解介質(zhì)。

3.3 結(jié)果分析

有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，納米銀顆粒隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞毒性逐漸增加，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)性[7]。本次試驗(yàn)選擇0.1g/mL作為初始濃度，稀釋后進(jìn)行MTT試驗(yàn)和LDH試驗(yàn)，設(shè)細(xì)胞增殖率在10%以下的對(duì)應(yīng)濃度為最大毒性濃度，設(shè)細(xì)胞增殖率在90%以上的對(duì)應(yīng)濃度為最小稀釋濃度，結(jié)果顯示，納米銀含量在30%～60%稀釋范圍內(nèi)，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)反應(yīng)。同時(shí)通過對(duì)各稀釋濃度和MTT增殖率、LDH釋放率進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，制得到濃度-反應(yīng)曲線，找到該測(cè)試物的LC50在0.047～0.048g/mL的范圍內(nèi)，同時(shí)具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

細(xì)胞毒性被認(rèn)為是細(xì)胞功能的損傷，包括但不局限于質(zhì)膜完整性破壞、細(xì)胞器功能的干擾和細(xì)胞骨架破壞，本次研究?jī)H通過從納米銀破壞細(xì)胞線粒體和破壞細(xì)胞膜完整性的不同角度來評(píng)價(jià)納米銀抗菌凝膠的細(xì)胞毒性，缺乏從分子水平進(jìn)行機(jī)制方面的研究。同時(shí)醫(yī)療器械和醫(yī)用材料對(duì)使用者健康的影響因素也是非常復(fù)雜的，僅對(duì)納米銀醫(yī)療器械進(jìn)行細(xì)胞毒性的檢測(cè)與評(píng)價(jià)也是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，仍需要大量而全面的生物學(xué)評(píng)價(jià)方法對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究。