董經(jīng)茹 白云鶴 何 京 趙紅崢 張金艷 （河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050011）

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）是一種高度致命的惡性腫瘤，近年來(lái)在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率都在提高，其高病死率歸因于PAAD生物學(xué)、早期診斷困難以及在評(píng)估可疑胰腺腫塊方面缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的國(guó)際指南［1-2］。及時(shí)準(zhǔn)確地診斷PAAD可以改善其不良預(yù)后，但目前PAAD的診治現(xiàn)狀依然嚴(yán)峻，大多數(shù)患者起病隱匿且早期癥狀不典型在診斷時(shí)已為晚期或轉(zhuǎn)移性疾病，因此PAAD關(guān)鍵基因?qū)υ\斷、治療及提示預(yù)后具有重大價(jià)值［3］。

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine protease inhibitor，CSTs）通過(guò)與半胱氨酸蛋白酶相結(jié)合，抑制蛋白酶發(fā)生水解反應(yīng)，其表達(dá)的變化影響腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段，包括腫瘤的生長(zhǎng)、凋亡以及侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成［4］。CSTs主要分為3個(gè)亞型：Ⅰ型為Stefins，結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單，主要是無(wú)二硫鍵的細(xì)胞內(nèi)非糖基化多肽，包括Stefin A（CSTA）和Stefin B（CSTB）；Ⅱ型為胱抑素，與Stefins不同的是其包含2個(gè)保守的二硫鍵和1個(gè)信號(hào)序列，使它們能夠分泌到細(xì)胞外，主要成員有SN（CST1）、SA（CST2）、C （CST3）、S（CST4）、D（CST5）、E/M（CST6）和 F（CST7）等；Ⅲ型為激肽原，是大型多功能血漿蛋白，包含3個(gè)Ⅱ型胱抑素樣結(jié)構(gòu)域［5］。半胱氨酸蛋白酶抑制劑 S（Cystatin S，CST4）又稱唾液酸性蛋白1，是Ⅱ型半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，是由141個(gè)氨基酸殘基組成的分泌型蛋白，包含2個(gè)特殊的二硫鍵。研究表明，CST4 mRNA和蛋白在胃腸道腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，CST4通過(guò)調(diào)節(jié)ELFN2信號(hào)增強(qiáng)胃癌的侵襲力［6-7］。CST4在胃腸道腫瘤的診斷及預(yù)后中提供了重要信息，但在PAAD中的意義尚不清楚。因此，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，綜合分析CST4在PAAD中的表達(dá)情況，為臨床中PAAD的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與預(yù)處理 基因表達(dá)匯編（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/）是由國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）建立和維護(hù)的國(guó)際公共存儲(chǔ)庫(kù)，用于存放研究界提交的高通量微陣列和下一代序列功能基因組數(shù)據(jù)集。GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）是一種基于R的在線分析工具，可幫助用戶分析GEO數(shù)據(jù)，識(shí)別和可視化差異表達(dá)基因（DEGs）［8］。本研究選取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE15471和GSE16515基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集為研究對(duì)象。利用GEO2R比較PAAD及癌旁正常組織的基因表達(dá)差異，以P＜0.05且|log2FC|＞1為DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 CST4 mRNA在泛癌中的表達(dá)情況 GEDS（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GEDS/）是一個(gè)用于搜索和可視化mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的綜合資源，可在癌癥類(lèi)型、正常組織和細(xì)胞系中顯示用戶輸入的人類(lèi)基因表達(dá)［9］。在GEDS的mRNA面板輸入CST4，以箱式圖的形式顯示其在癌癥基因組圖譜（TCGA）和腫瘤細(xì)胞系CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)的表達(dá)情況。

1.3 CST4在消化系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)分析 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中某些腫瘤正常對(duì)照組織量較少，應(yīng)用GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）匹配TCGA和基因型-組織表達(dá)（GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)后進(jìn)一步分析，獲得CST4基因在消化系統(tǒng)腫瘤組織與相應(yīng)正常組織之間表達(dá)差異的箱式圖，以P＜0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 CST4生存預(yù)后分析 Kaplan-Meier plotter（https：//kmplot.com/analysis/）是一款在線預(yù)后分析網(wǎng)站，常規(guī)在線提供了包括GEO、EGA和TCGA腫瘤特定基因的分組生存分析以及RNA測(cè)序和miRNA的表達(dá)基因的生存分析［10］。利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)分析平臺(tái)繪制TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中177例PAAD患者CST4 mRNA表達(dá)的生存曲線，限定條件分別為總生存期（overall survival，OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間（relapse free survival，RFS），生存時(shí)間統(tǒng)計(jì)最長(zhǎng)為60個(gè)月。腫瘤病理類(lèi)型、分期及患者性別等其他條件不做限制，從而評(píng)估CST4 mRNA表達(dá)與PAAD患者五年總生存率及無(wú)復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系，結(jié)果以P＜0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 CST4與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)分析的關(guān)系 腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與癌癥的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。免疫浸潤(rùn)分析數(shù)據(jù)庫(kù) TIMER2（http：//timer.cistrome.org/）是用于系統(tǒng)分析各種癌癥類(lèi)型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的綜合資源［11］。利用TIMER2數(shù)據(jù)庫(kù)的“Gene”模塊，分析PAAD患者CST4表達(dá)量與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的相關(guān)性。通過(guò)TIMER、CiberSort、CiberSort-ABS、QuanTIseq、XCell、MCP-COUNTER 和 EPIC 算法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)評(píng)估，經(jīng)純度調(diào)整的Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)得到P值和Rho值。數(shù)據(jù)以熱圖和散點(diǎn)圖的形式可視化，結(jié)果以P＜0.05作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 構(gòu)建CST4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及富集分析 蛋白質(zhì)功能的完整描述需要了解與之特異性結(jié)合的所有伴侶蛋白質(zhì)，功能蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（STRING，https：//string-db.org/）是包含已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括從基因組分析、高通量試驗(yàn)及共表達(dá)研究中獲得的物理和功能的關(guān)聯(lián)［12］。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的“Protein by name”模塊輸入CST4，選擇物種“Homo sapiens”，獲得CST4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及GO功能注釋分析結(jié)果。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，運(yùn)用cytohubba插件篩選出與CST4相互作用連接度較高的基因。

2 結(jié)果

2.1 PAAD與正常組織中差異表達(dá)基因的篩選GSE15471包括36對(duì)PAAD和正常組織樣本，GSE16515包括36個(gè)腫瘤樣本和16個(gè)正常樣本。GEO2R分別對(duì)2個(gè)芯片進(jìn)行分析，篩查出差異倍數(shù)達(dá)2倍以上的顯著DEGs，log2FC＞1為上調(diào)基因，log2FC＜-1為下調(diào)基因。通過(guò)韋恩圖獲得2個(gè)GEO數(shù)據(jù)芯片DEGs的交集，選定關(guān)鍵基因CST4。

2.2 CST4 mRNA在各種腫瘤組織中的表達(dá) 應(yīng)用GEDS分析CST4 mRNA在TCGA不同腫瘤類(lèi)型中的表達(dá)情況，從左至右以中位數(shù)為參照，CST4 mRNA表達(dá)量依次降低（圖1A）。CST4在PAAD、直腸癌（rectum adenocarcinoma，READ）、結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）、胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD）消化系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)相對(duì)較高。同時(shí)根據(jù)CCLE可知CST4在胰腺細(xì)胞系中高表達(dá)（圖1B）。

圖1 CST4 mRNA在TCGA（A）和CCLE（B）數(shù)據(jù)庫(kù)各種腫瘤組織的表達(dá)Fig.1 Expression of CST4 mRNA in various tumor tissues in TCGA （A） and CCLE （B） database

2.3 CST4在消化系統(tǒng)腫瘤組織的表達(dá)差異 加入GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的正常組織作為對(duì)照，進(jìn)一步評(píng)估了CST4在消化系統(tǒng)腫瘤與正常對(duì)照組織中的表達(dá)（圖2）。CST4在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達(dá)存在顯著差異（P＜0.05），腫瘤組織CST4表達(dá)水平相對(duì)較高。

圖2 CST4 在消化系統(tǒng)腫瘤組織的表達(dá)Fig.2 Expression of CST4 in digestive system tumor tissues

2.4 CST4表達(dá)與PAAD患者生存預(yù)后的關(guān)系CST4 mRNA表達(dá)水平與PAAD患者的五年總體生存率、無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)（P＜0.05）。根據(jù)CST4 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將PAAD患者分為低水平組69例和高水平組108例，CST4高表達(dá)患者的OS明顯縮短（圖3A）。無(wú)復(fù)發(fā)生存患者低水平組39例和高水平組30例，高表達(dá)組生存率較低（圖3B）。

圖3 CST4 在PAAD中的Kaplan-Meier生存曲線Fig.3 Kaplan-Meier curve of CST4 in PAAD

2.5 CST4表達(dá)與PAAD患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的關(guān)系 TIMER2數(shù)據(jù)庫(kù)顯示CST4表達(dá)與PAAD不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平存在潛在聯(lián)系（P＜0.05）?；贓PIC算法，PAAD中CST4的表達(dá)水平與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)（圖4A）；基于XCell算法，與CD4+T細(xì)胞免疫浸潤(rùn)情況呈正相關(guān)（圖4B）；基于QUANTISEQ算法，與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)存在正相關(guān)（圖4C、D）。

圖4 在PAAD中CST4表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系Fig.4 Relationship between CST4 expression and immune cell infiltration in PAAD

2.6 CST4相關(guān)蛋白及GO分析 為進(jìn)一步了解CST4在人體內(nèi)的功能機(jī)制，應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了CST4相關(guān)功能蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)（圖5A），發(fā)現(xiàn)10個(gè)蛋白與CST4相互作用密切，設(shè)置最低相互作用分值為0.7。通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，CST1、CSTA、CSTB、CTSB、CTSL與CST4相互作用連接度較高。根據(jù)每個(gè)基因的連接度排序，由紅至黃，顏色越深代表其在整個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)中的作用越顯著（圖5B）。GO功能注釋結(jié)果顯示，這些蛋白主要參與生物學(xué)過(guò)程（biological processes，BP）為蛋白質(zhì)水解的負(fù)調(diào)控、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控等；主要參與細(xì)胞組成（cell composition，CC）為細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外泌體等；主要參與分子功能（molecular function，MF）為CATs的活性、蛋白酶結(jié)合等。

圖5 CST4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein interaction network of CST4

3 討論

PAAD具有起病隱匿、早期診斷困難、進(jìn)展迅速、化學(xué)治療不敏感等特點(diǎn)，大多數(shù)患者在確診時(shí)已喪失治療的最佳時(shí)機(jī)，因此預(yù)后較差［13］。目前，關(guān)于PAAD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，同時(shí)缺乏有效的系統(tǒng)治療手段。高通量測(cè)序技術(shù)及基因芯片技術(shù)日趨成熟，深入了解PAAD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中潛在的分子機(jī)制是改善PAAD患者預(yù)后的重要途徑之一［14］。

基因芯片結(jié)合生物信息學(xué)方法能夠有效分析與PAAD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異表達(dá)基因，并分析DEG在腫瘤中的表達(dá)及生物學(xué)功能?；赥CGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)分析證實(shí)了與正常胰腺組織相比，CST4在PAAD組織中表達(dá)明顯增高。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PAAD患者生存預(yù)后信息的分析，可以發(fā)現(xiàn)CST4的表達(dá)水平明顯影響患者的預(yù)后，高表達(dá)組的患者五年總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著低于低表達(dá)組，這使得CST4有望成為評(píng)估PAAD的預(yù)后指標(biāo)。

PAAD的腫瘤微環(huán)境包括CAFs、細(xì)胞外基質(zhì)，各種免疫細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子，與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)［15］。為了確定CST4的表達(dá)與PAAD中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，利用TIMER2對(duì)CST4 mRNA表達(dá)水平與不同的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)含量進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，CST4表達(dá)與CAF、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)含量呈正相關(guān)。但是，基于不同算法得到的結(jié)論不同，每種算法都具有獨(dú)特的屬性和優(yōu)勢(shì)。其中EPIC和QuanTISEQ是推薦的通用算法，提供代表細(xì)胞的絕對(duì)分?jǐn)?shù)［16］。CAF是腫瘤增生基質(zhì)的細(xì)胞成分，會(huì)導(dǎo)致纖維化和促結(jié)締組織增生，有助于腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移［17］。研究表明，CST4在卵巢癌（ovarian cancer，OC）患者中高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)，而免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)影響了OC患者的生存［18］。因此，推測(cè)高表達(dá)CST4通過(guò)某種機(jī)制促進(jìn)PAAD中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，影響腫瘤的侵襲及預(yù)后。

利用STRING構(gòu)建CST4蛋白功能互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)出10種功能蛋白與CST4相互作用，其中CST1、CSTA、CSTB、CTSB、CTSL與CST4關(guān)聯(lián)密切且已被證實(shí)與PAAD的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。CST1、CSTA和CSTB均屬于CSTs家族，CTSB、CTSL為半胱氨酸組織蛋白酶。YANG等［19］研究了Ⅱ型CSTs在PAAD組織中的表達(dá)，與正常組織相比，CST1、CST2、CST4、CST6和CST7的表達(dá)上調(diào)，CST3和CST5 mRNA水平下調(diào)。此外，CST1過(guò)表達(dá)有助于增殖相關(guān)蛋白表達(dá)、體外集落形成和異種移植物發(fā)育等，在PAAD中CST1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖［20］。CSTA在腫瘤組織中上調(diào)，達(dá)到一定水平可抵消過(guò)度表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白水解活性。CSTA和CTSB在PAAD的腫瘤組織和腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，CSTA表達(dá)與局部腫瘤組織中的炎癥狀態(tài)有關(guān)，CTSB的表達(dá)與PAAD患者預(yù)后和復(fù)發(fā)有關(guān)［21］。研究表明，CSTB在PAAD中表達(dá)上調(diào)并與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，高表達(dá)時(shí)患者總生存率低［22］。CSTB可調(diào)節(jié)細(xì)胞核中CTSL的蛋白水解活性，保護(hù)轉(zhuǎn)錄因子免受水解從而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控［23］。血漿CTSL水平可作為判斷PAAD預(yù)后的潛在指標(biāo)，該蛋白酶在PAAD組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，可能是腫瘤侵襲的原因之一［24］。

生物信息學(xué)分析是使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)收集和分析大量生物數(shù)據(jù)的技術(shù)，缺少試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持驗(yàn)證，存在一定的局限性。未來(lái)可以從臨床角度對(duì)CST4與腫瘤病理類(lèi)型、腫瘤病理分級(jí)、術(shù)后預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析驗(yàn)證，也可以從基因的角度敲低CST4后研究PAAD細(xì)胞系的侵襲遷移情況。CST4有望成為PAAD診斷治療及患者不良預(yù)后評(píng)估的潛在靶點(diǎn)，在PAAD發(fā)生與進(jìn)展中的具體機(jī)制及生物學(xué)作用仍待進(jìn)一步研究。