蔡 蔚 劉起立 毛璟弢 黃麗玲 趙太玉 賀 瀟 蔣偉平

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007）

膀胱尿路上皮癌（BLCA）是世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤首位，治療方式主要取決于腫瘤階段及患者一般情況，主要包括手術(shù)、放療、化療或免疫治療等［1-2］。膀胱癌最大的特點(diǎn)是多發(fā)性和極易復(fù)發(fā)，盡管上述方法短期內(nèi)能取得不錯(cuò)的療效，但遠(yuǎn)期療效及患者生存質(zhì)量不盡人意，且治療副作用嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此明確膀胱癌的發(fā)病機(jī)制尤為重要。國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究表明，免疫相關(guān)基因和免疫系統(tǒng)在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3-6］。腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，免疫細(xì)胞有望成為新的生物標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展、預(yù)后，甚至影響腫瘤治療效果［7-8］。本研究基于生物信息學(xué)方法分析膀胱癌差異表達(dá)基因，通過(guò)CIBERSORT算法分析22類免疫細(xì)胞在膀胱癌組及對(duì)照組的含量，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫細(xì)胞臨床相關(guān)性分析，初步探究膀胱癌中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)模式及機(jī)制，提供新的診斷及治療生物標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取整理 通過(guò) TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取所有類型膀胱癌的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)集與臨床數(shù)據(jù)集并進(jìn)行整理，將轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的ensembl ID通過(guò)Ensembl（http：//asia.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，獲得基因名稱，采用R語(yǔ)言limma程序包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正。

1.2 差異分析 矯正后的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)采用R語(yǔ)言edgeR程序包進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)，根據(jù)|logFC|＞1和校正P＜0.05進(jìn)行差異基因分析并繪制差異基因火山圖。

1.3 GO及KEGG富集分析 采用R語(yǔ)言org.Hs.eg.db程序包將基因名稱轉(zhuǎn)換為基因ID，采用R語(yǔ)言DOSE、clusterProfiler、enrichplot程序包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，取顯著富集的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）前10項(xiàng)繪制柱狀圖。采用R語(yǔ)言DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview程序包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，取顯著富集的前30條通路繪制氣泡圖。

1.4 免疫細(xì)胞間相關(guān)性分析及組間差異分析 校正后的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)集采用R語(yǔ)言preprocessCore程序包及CIBERSORT算法計(jì)算22類免疫細(xì)胞在膀胱癌組及對(duì)照組的含量，計(jì)算次數(shù)為100次，獲得樣品中22類免疫細(xì)胞矩陣，篩選矩陣中P＜0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析，繪制各樣本免疫細(xì)胞小提琴圖及相關(guān)性熱圖。

1.5 免疫細(xì)胞臨床相關(guān)性分析 將免疫細(xì)胞矩陣和臨床數(shù)據(jù)生存時(shí)間進(jìn)行合并，分析22類免疫細(xì)胞與生存時(shí)間的關(guān)系，繪制生存曲線。同時(shí)分析22類免疫細(xì)胞與性別、腫瘤分級(jí)、TMN分期的相關(guān)性，繪制相關(guān)性圖。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)獲取 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)集樣本433例，正常組織19例，膀胱癌組織414例，其中408例為尿路上皮癌；獲取412例膀胱癌患者的生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別、腫瘤分級(jí)、TMN分期資料。

2.2 獲得差異表達(dá)基因 通過(guò)差異基因分析獲得差異表達(dá)基因2 514個(gè)，其中上調(diào)基因1 347個(gè)，下調(diào)基因1 167個(gè)，繪制差異基因火山圖（圖1），紅色代表高表達(dá)基因，綠色代表低表達(dá)基因。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Differentially expressed gene volcano map

2.3 GO及KEGG富集分析 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析，得到顯著富集的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞器裂變、核分裂、細(xì)胞周期正調(diào)控、DNA構(gòu)象變化、有絲分裂核分裂、DNA包裝、染色質(zhì)組裝核小體裝配等（圖2A）；得到PI3K/Akt、MAPK、癌癥microRNA、Wnt、p53、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期、膀胱癌等信號(hào)通路（圖2B）。

圖2 GO及KEGG富集分析Fig.2 GO and KEGG enrichment analysis

2.4 免疫細(xì)胞間相關(guān)性分析及組間差異分析結(jié)果 采用CIBERSORT算法獲得樣本中22類免疫細(xì)胞矩陣，篩選矩陣中P＜0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析，得到正常樣本6例，腫瘤樣本210例，繪制免疫細(xì)胞分析小提琴圖（圖3），藍(lán)色代表正常樣本，紅色代表腫瘤樣本，可知巨噬細(xì)胞 M0（P=0.005）、M1（P=0.014）在腫瘤樣本中高表達(dá)，幼稚B細(xì)胞（P=0.007）、記憶B細(xì)胞（P=0.039）、未活化的肥大細(xì)胞（P=0.002）在腫瘤樣本中低表達(dá)；免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖見(jiàn)圖4，CD8 T細(xì)胞與未活化的CD4記憶T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0呈負(fù)相關(guān)，與活化的CD4記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)，未活化的NK細(xì)胞與活化的CD4記憶T細(xì)胞呈正相關(guān)。

圖3 免疫細(xì)胞不同樣本小提琴圖Fig.3 Violin diagram of different samples of immune cells

圖4 免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖Fig.4 Immune cell correlation heat map

2.5 免疫細(xì)胞與生存關(guān)系分析 剔除生存時(shí)間不完整的樣本1例，將免疫細(xì)胞矩陣和臨床數(shù)據(jù)生存時(shí)間合并后獲得有效樣本208例，得出22類免疫細(xì)胞與生存時(shí)間關(guān)系的生存曲線，其中P＜0.05的免疫細(xì)胞為未活化的CD4記憶T細(xì)胞（P=0.035）、活化的CD4記憶T細(xì)胞（P=0.033），生存曲線見(jiàn)圖5。

圖5 免疫細(xì)胞與生存時(shí)間的關(guān)系Fig.5 Relationship between immune cells and survival time

2.6 免疫細(xì)胞臨床相關(guān)性分析 對(duì)免疫細(xì)胞與樣本性別、腫瘤分級(jí)、TMN分期進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞與性別及腫瘤T分期相關(guān)，不同性別中，CD8 T細(xì)胞（P=0.003）、濾泡助手T細(xì)胞（P=0.048）、中性粒細(xì)胞（P=0.037）與性別相關(guān)，男性樣本中，CD8 T細(xì)胞與濾泡助手T細(xì)胞相對(duì)高表達(dá)，中性粒細(xì)胞相對(duì)低表達(dá)（圖6A）；腫瘤T分期中，濾泡助手T細(xì)胞（P=0.015）、樹(shù)突狀靜止細(xì)胞（P=0.045）、巨噬細(xì)胞M0（P=0.046）與T分期相關(guān)，相較于T3和T4期，濾泡助手T細(xì)胞、樹(shù)突狀靜止細(xì)胞在T0、T1和T2期中高表達(dá)，巨噬細(xì)胞M0則相反（圖6B）。

圖6 免疫細(xì)胞與性別、T分期關(guān)聯(lián)圖Fig.6 Correlation diagram between immune cells and gender and T stage

3 討論

非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌占全部膀胱腫瘤的70%以上，其治療通常采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后膀胱內(nèi)灌注卡介苗預(yù)防復(fù)發(fā)，對(duì)于局限性、晚期膀胱癌患者，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療仍是目前首選治療方案［2，9-11］。越來(lái)越多的患者采用新輔助化療聯(lián)合根治性膀胱切除術(shù)治療，但長(zhǎng)期生存率并不理想［12-16］。檢查點(diǎn)抑制劑免疫治療改善了膀胱癌患者預(yù)后［11，16-17］。近年多個(gè)檢查點(diǎn)抑制劑已被FDA批準(zhǔn)用于膀胱癌治療，但僅有約20%患者對(duì)免疫治療有反應(yīng)，總體預(yù)后較差［11，17］。放化療及免疫治療的副作用（如排尿刺激癥狀、血尿、皮疹、關(guān)節(jié)痛、發(fā)燒、流感樣癥狀、貧血、中性粒細(xì)胞減少、疲勞、惡心、嘔吐等）嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且這類藥物的成本也限制了其臨床應(yīng)用［17-19］。因此，開(kāi)發(fā)新的、更有效、更經(jīng)濟(jì)、甚至無(wú)毒副作用的膀胱癌治療策略尤為重要。

本研究基于生物信息學(xué)得到膀胱癌差異表達(dá)基因2 514個(gè)，其中上調(diào)1 347個(gè)，下調(diào)1 167個(gè)，并篩選出 CLEC3B、TCF21、CSRP1、PPP1R12B、TNS1、SCARA5等30個(gè)核心基因，核心基因均在膀胱癌組織中呈低表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，核心基因與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如CLEC3B表達(dá)與肺癌、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌進(jìn)展密切相關(guān)，有可能成為潛在腫瘤生物標(biāo)志物，并為靶向藥物研制提供依據(jù)［20-21］；TCF21 可作為抑癌基因抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移［22-23］；同樣發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中CSRP1、PPP1R12B表達(dá)下調(diào)［24］；但有研究顯示，TNS1上調(diào)能促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展［25］；SCARA5已被證實(shí)在多種癌癥中可作為抑癌基因［26-27］。本研究篩選出的核心基因有望成為新的生物標(biāo)志物用于膀胱癌診斷及治療。

差異表達(dá)基因的GO及KEGG富集分析顯示，膀胱癌差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞周期正調(diào)控、DNA構(gòu)象變化、有絲分裂核分裂等生物學(xué)過(guò)程，關(guān)聯(lián)PI3K/Akt、MAPK、microRNA、Wnt、p53等信號(hào)通路。細(xì)胞外基質(zhì)已被大量研究證實(shí)是癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素［28］。改變細(xì)胞外基質(zhì)能影響膀胱癌細(xì)胞過(guò)程及核基質(zhì)組織，細(xì)胞周期正調(diào)控、DNA構(gòu)象變化、有絲分裂核分裂等生物學(xué)過(guò)程均與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)［29］。研究證實(shí)，PI3K/Akt、MAPK、Wnt、p53等信號(hào)通路在膀胱癌發(fā)生中處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其通路中的核心基因可作為膀胱癌預(yù)后及治療的新靶點(diǎn)［30-32］。近年發(fā)現(xiàn)microRNA可作為膀胱癌細(xì)胞的潛在調(diào)節(jié)劑，主要通過(guò)與其3'非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化或PI3K/AKT、 NF-κB等信號(hào)通路促進(jìn)膀胱癌基因的致癌潛力，有望成為膀胱癌治療的新靶標(biāo)，進(jìn)一步說(shuō)明了本研究預(yù)測(cè)的可靠性［33］。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞M0、M1在腫瘤組織中高表達(dá)，幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞在腫瘤組織中低表達(dá)，能否成為膀胱癌預(yù)后的生物標(biāo)志物有待進(jìn)一步驗(yàn)證。研究表示，巨噬細(xì)胞M0低表達(dá)預(yù)示膀胱癌更好的預(yù)后［34］；腫瘤微環(huán)境中募集的肥大細(xì)胞能促進(jìn)膀胱癌轉(zhuǎn)移［35］。免疫細(xì)胞與臨床生存時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)，CD4記憶T細(xì)胞含量與生存時(shí)間顯著相關(guān)。國(guó)外研究表明，活化的CD4 T細(xì)胞顯著控制結(jié)直腸癌預(yù)后［36］；CD4記憶T細(xì)胞有助于免疫保護(hù)、病理或組織重塑，對(duì)介導(dǎo)有益和致病性免疫應(yīng)答平衡具有潛在作用，CD4 T細(xì)胞具有保留抗原記憶的能力，是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要特征［37］。CD8記憶T細(xì)胞的分子機(jī)制已被許多研究證實(shí)，而CD4記憶T細(xì)胞機(jī)制研究則不夠充分，結(jié)合本研究，CD4記憶T細(xì)胞可能成為新的膀胱癌隨訪生物標(biāo)志物。臨床相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，部分免疫細(xì)胞在不同性別及腫瘤不同T分期中差異表達(dá)，有望為個(gè)體化醫(yī)療提供依據(jù)。

膀胱癌是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，無(wú)論是手術(shù)還是放化療及免疫治療均存在不足，其多發(fā)性與極易復(fù)發(fā)是目前急需解決的問(wèn)題，因此尋找新的更合適的藥物及預(yù)后生物標(biāo)志物十分重要，本研究采用生物信息學(xué)方法分析了膀胱癌免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)模式，為膀胱癌治療與預(yù)后提供了新思路，對(duì)后續(xù)研究具有一定參考價(jià)值。