張春玲 梁 超 王寶愛 徐玉婷 （海口市中醫(yī)醫(yī)院，?？?570216）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種具有高病死率和顯著致殘率的常見病，一直以來備受關(guān)注［1-2］。ICH以中老年人多發(fā)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，其占全世界新增200萬腦部疾病患者的10%～15%。作為一種老年人多發(fā)病癥，其致病機(jī)制尚不完全明晰，且缺乏有效的臨床治療手段［3］。研究表明，腦組織水腫和炎癥反應(yīng)過程是導(dǎo)致ICH的重要原因［4-6］。因此如何有效、大程度地抑制ICH后的炎癥反應(yīng)成為近年的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，在發(fā)生ICH后，血腫成分會(huì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致炎癥通路打開，在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）在機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮了不容忽視的作用，其被激活后可通過調(diào)控核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路促使大量促炎細(xì)胞因子生成并釋放，此外，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protern，HMGB1）基因表達(dá)上調(diào)會(huì)激活巨噬細(xì)胞HMGB1過度胞外釋放，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［7-11］。大黃素作為一種含有多個(gè)酚羥基的中藥，具有十分有效的抗氧化、抗炎作用［12-13］。但其在腦血管疾病中的作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以老年大鼠腦組織為研究對(duì)象，探討大黃素對(duì)老年ICH模型炎癥因子的影響，并分析其作用機(jī)制，以期為大黃素在ICH疾病方面的臨床應(yīng)用開發(fā)提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只24月齡健康雄性SD大鼠購自山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，體質(zhì)量（250±30） g。于（21±2） ℃、40%～70%濕度和12 h光/暗循環(huán)下飼養(yǎng)。本研究嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

1.1.2 主要儀器 KH-45A電熱恒溫干燥箱（康恒儀器有限公司）；THZ-98A恒溫振蕩器（廣州錦卓儀器設(shè)備有限公司）；HC-2062高速離心機(jī)（武漢華科達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KD1508輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（鄭州博邦儀器有限公司）；CK-300電子顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（Bio Tek公司）；NB-215C壓縮式霧化器（江蘇鹿得醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司）。

1.1.3 主要試劑 大黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞96%）、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，桂林益天成生物科技有限公司）；NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH 抗體（Cell Signalling公司）；HMGB1、TLR4（Santa Cruz公司）；蛋白裂解液（西安飛揚(yáng)生物科技有限公司）；化學(xué)分光底物、HE染色液（Origene公司）；ICAM-1單克隆抗體（Proteintech公司）；BCA Protein Assay Kit（上海炎熙生物科技有限公司）；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及建模后干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為Control組、Model組、EL組、EH組及PDTC組，每組10只。除Control組外，其他組大鼠構(gòu)建急性ICH模型，建模方法［14］：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，抽自身血50 μl待用。35 g/L CCl3CH（OH）2溶液麻醉大鼠，固定大鼠并進(jìn)行開顱手術(shù)。從大鼠頭部中心處動(dòng)刀展現(xiàn)顱骨，以前顱為基準(zhǔn)線，在前顱后4 mm、中線左3 mm處用牙科鉆開一個(gè)直徑約1 mm的小孔，然后以20 μl/min將50 μl血液注入大鼠腦組織，30 min后取出注射針，最后對(duì)鉆孔進(jìn)行封閉處理并縫合大鼠傷口。Control組不注入血液。大鼠腦組織注射自體鼠尾動(dòng)脈血液后，可發(fā)現(xiàn)大鼠立即表現(xiàn)出行動(dòng)能力和神經(jīng)功能失常，具體反映為應(yīng)答緩慢、毛發(fā)黯淡、無精打采、食欲不振，多數(shù)大鼠對(duì)側(cè)肢體不能行動(dòng)，走路東倒西歪，更有甚者無法站立或行動(dòng)極其困難；少數(shù)大鼠有呆滯、沉睡現(xiàn)象，大鼠行為失常程度與出血量存在明顯關(guān)聯(lián)。腦組織中可發(fā)現(xiàn)清晰血腫。結(jié)合大鼠造模3 d后的神經(jīng)功能評(píng)分，1～3分表示造模成功。造模成功后，EL組、EH組分別對(duì)應(yīng)灌胃大黃素40、80 mg/（kg·d），PDTC組以同種方式給予PDTC 10 mg/（kg·d），共給藥14 d，給藥期間Control組和Model組給予相同劑量的溶劑（體積分?jǐn)?shù)5%C2H5OH）。給藥結(jié)束后，以100 g/L CCl3CH（OH）2麻醉大鼠，采血，斷頭取腦，分離血腫部分，置于-10 ℃環(huán)境中待用。

1.2.2 腦水腫、腦指數(shù)及神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠處死后，取出大腦，稱重，計(jì)為W1，然后將大腦置于80 ℃烘箱中烘烤至恒定重量，稱重，計(jì)為W2，計(jì)算腦組織含水量與腦指數(shù)。腦組織含水量（%）=（W1-W2）/W1×100%。腦指數(shù)（%）=W1/體質(zhì)量×100%。神經(jīng)功能評(píng)分采用單盲法（實(shí)驗(yàn)分組并未告知參評(píng)人員）。采用Longa的5分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［15］：0分為無癥狀；1分為無法全部展開對(duì)側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自行行走，意識(shí)喪失。1～3分表明造模成功，0分、4分表明造模失敗。

1.2.3 HE染色觀察腦組織病理形態(tài) 腦組織采用體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋、切片后對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和HE染色，光鏡下（×200）觀察腦組織病理形態(tài)。

1.2.4 Western blot檢 測 HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達(dá) 取血腫組織，剪碎后加入蛋白裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，檢測其中總蛋白濃度。以10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。50.0 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH一抗（稀釋濃度為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯示條帶，所得條帶采用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 ELISA檢測血清炎癥因子水平 收集大鼠血清，將其加入反應(yīng)孔，孵育45 min。PBS清洗3次。加入生物素標(biāo)記的抗體反應(yīng)30 min。洗滌，加入鏈霉親和素-HRP抗體反應(yīng)30 min。加入顯色劑顯色15 min。最后加入終止液，于450 nm處測吸光度。

1.2.6 免疫組化法檢測腦組織ICAM-1水平 腦組織經(jīng)切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)后加入ICAM-1一抗（1∶200），4 ℃過夜，PBS清洗3次。加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，DAB顯色液染色，蘇木素染核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于倒置顯微鏡40倍視野下觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 8.0和SPSS22.0軟件，多重比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù) 如表1所示，與Control組相比，Model組腦含水量大幅度提升，神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)也明顯提高（P＜0.05）；與Model組相比，EL、EH及PDTC組腦含水量明顯降低，神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

表1 大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)（±s，n=10）Tab.1 Brain water content， neurological function score and brain index of rats （±s，n=10）

表1 大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)（±s，n=10）Tab.1 Brain water content， neurological function score and brain index of rats （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with Model group， 2）P＜0.05.

Groups Control Model EL EH PDTC Brain water content/（p/%）72.51±9.76 90.03±9.851）81.21±7.632）76.02±11.382）78.06±12.022）Neurological function score/（s/point）0.00±0.00 2.70±0.481）1.80±0.422）1.00±0.472）1.20±0.422）Brain index 0.32±0.05 0.74±0.061）0.51±0.062）0.35±0.082）0.42±0.042）

2.2 大鼠腦組織病理變化比較 HE染色結(jié)果顯示，Control組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)齊全，神經(jīng)細(xì)胞完整規(guī)則，排列方式較為規(guī)律，各細(xì)胞染色情況較好；Model組腦組織結(jié)構(gòu)則十分糟糕，神經(jīng)細(xì)胞間有較大空隙，且排列不整齊，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)凝集、核固縮現(xiàn)象；EL、EH及PDTC組形態(tài)結(jié)構(gòu)異常程度較模型組輕，但仍有部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)凝集、核固縮表現(xiàn)，EL、EH及PDTC組腦組織結(jié)構(gòu)與神經(jīng)細(xì)胞較Model組有一定程度恢復(fù)。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理比較Fig.1 Pathological comparsion of rats brain tissues in each group

2.3 大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的激活情況 與Control組相比，Model組HMGB1、TLR4表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65明顯升高（P＜0.05）；與Model組相比，EL、EH及PDTC組HMGB1、TLR4表達(dá)及p-NF-κB p65/NF-κB p65均明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路激活情況Fig.2 Activation of HMGB1/TLR4/NF-κB p65 pathway in rats brain tissues

2.4 大鼠血清中炎癥因子水平比較 如表2所示，與Control組相比，Model組血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10水平上調(diào)（P＜0.05）；與Model組相比，EL、EH及PDTC組IL-6、TNF-α、IL-1β水平下調(diào)，IL-10水平繼續(xù)上調(diào)（P＜0.05）。

表2 血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10水平（±s，n=10）Tab.2 Levels of serum IL-6， TNF-α， IL-1β， IL-10 （±s，n=10）

表2 血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10水平（±s，n=10）Tab.2 Levels of serum IL-6， TNF-α， IL-1β， IL-10 （±s，n=10）

Note：Compared with Control group， 1）P＜0.05； compared with Model group， 2）P＜0.05.

Groups Control Model EL EH PDTC IL-6 22.39±4.43 90.08±12.021）57.04±7.362）36.25±6.362）41.56±7.922）TNF-α 36.47±5.02 187.02±24.011）105.43±11.272）62.98±8.852）77.45±9.232）IL-1β 18.86±4.11 116.08±17.161）72.12±8.492）40.77±5.632）49.27±6.262）IL-10 2.15±0.22 3.46±0.291）6.25±0.372）12.16±1.222）9.27±0.562）

2.5 大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)比較 如圖3、圖4所示，Control組細(xì)胞無特異染色。與Control組相比，Model組細(xì)胞中ICAM-1陽性表達(dá)增強(qiáng)（棕黃色），ICAM-1陽性表達(dá)細(xì)胞增多（P＜0.05）；與Model組相比，EL、EH及PDTC組細(xì)胞ICAM-1陽性表達(dá)明顯減弱，細(xì)胞ICAM-1陽性表達(dá)率隨之降低（P＜0.05）。

圖3 腦組織ICAM-1表達(dá)Fig.3 ICAM-1 expression in brain tissue

圖4 ICAM-1陽性細(xì)胞占比Fig.4 Proportion of ICAM-1 positive cells

3 討論

本研究建立老年大鼠ICH模型，通過不同劑量大黃素干預(yù)，檢測各組大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB通路的激活情況及血清炎癥因子水平，結(jié)果顯示，HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路細(xì)胞內(nèi)HMGB1和TLR4水平及NF-κB p65磷酸化與大黃素對(duì)老年ICH大鼠炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。此外，課題組還對(duì)介導(dǎo)神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)的ICAM-1表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在有大黃素干預(yù)的ICH大鼠中，ICAM-1表達(dá)率降低。提示大黃素可通過阻礙HMGB1/TLR4/NF-κB通路降低老年ICH大鼠的炎癥因子水平。

急性ICH在我國臨床疾病中比較常見，其發(fā)生有很大概率會(huì)造成患者肢體癱瘓，更有甚者直接導(dǎo)致患者死亡，由于ICH具有發(fā)病較為迅速、病因不盡相同、患者處境危險(xiǎn)、預(yù)后比較糟糕等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為臨床上的一大難題。ICH可引起一系列隨之而來的神經(jīng)損傷，如腦水腫等，其也是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的主要原因［16］。本實(shí)驗(yàn)通過模擬急性ICH狀態(tài)建立老年急性ICH大鼠模型，并對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，Model組大鼠腦含水量、神經(jīng)行為評(píng)分及腦指數(shù)均高于Control組。將大鼠腦組織染色后比較發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Model組大鼠腦組織有明顯損傷，神經(jīng)細(xì)胞間隔增大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，表明老年急性ICH大鼠模型建立成功。經(jīng)大黃素干預(yù)后，ICH大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)均得到一定程度的下降，神經(jīng)細(xì)胞損傷也得到一定程度的恢復(fù)，且高劑量大黃素效果更加明顯。

炎癥反應(yīng)在ICH病理生理中的重要性被醫(yī)療人員廣泛關(guān)注。ICH炎癥反應(yīng)是ICH后引起神經(jīng)損傷的重要原因［17］。本研究對(duì)大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10水平定量，結(jié)果顯示Model組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量均明顯高于 Control組。提示急性ICH可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，使免疫應(yīng)答活化；相較于Model組，EL、EH及PDTC組血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平降低，IL-10水平繼續(xù)升高，提示大黃素能夠調(diào)節(jié)老年急性ICH大鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

ICAM-1是一種黏附因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在較多，其存在與白細(xì)胞黏附、活化具有一定關(guān)聯(lián)，還能參與神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)［18］。有研究顯示，急性ICH患者機(jī)體炎癥反應(yīng)劇烈，炎癥因子能夠穿越血腦屏障達(dá)到腦，進(jìn)一步促進(jìn)ICAM-1表達(dá)上升［19］。本研究免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，Model組細(xì)胞中ICAM-1陽性表達(dá)較正常對(duì)照組增強(qiáng)，表明急性ICH可誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)；EL、EH及PDTC組中細(xì)胞ICAM-1陽性表達(dá)較模型對(duì)照組明顯減弱，提示大黃素能夠減輕老年急性ICH大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。

HMGB1是一種新型促炎因子，可加強(qiáng)其他炎癥因子釋放，導(dǎo)致炎癥更加劇烈［20］。HMGB1與晚期糖基化終產(chǎn)物受體及TLR4等受體結(jié)合活化有關(guān)信號(hào)，從而導(dǎo)致NF-κB被激發(fā)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［21-22］。NF-κB p65是NF-κB通路的一種轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路被打開可致使白細(xì)胞黏附分子增多，促使細(xì)胞產(chǎn)生更多TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子，最終演變?yōu)楦訃?yán)重的炎癥反應(yīng)［23］。有研究認(rèn)為通過阻礙HMGB1及其下游通路的活化可明顯降低ICH導(dǎo)致的神經(jīng)損傷［24］。本研究結(jié)果顯示，Model組HMGB1、TLR4表達(dá)及NF-κB p65磷酸化較Control組明顯升高，表明急性ICH可引起腦組織HMGB1/TLR4/NF-κBp65通路活化，炎癥通路被打開。EL、EH及PDTC組HMGB1、TLR4表達(dá)及NF-κB p65磷酸化較Model組降低，表明大黃素能夠抑制急性ICH大鼠腦組織HMGB1/TLR4/ NF-κB通路，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建老年SD大鼠急性ICH模型，發(fā)現(xiàn)大黃素可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路，進(jìn)而抑制大鼠神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)，從而減輕急性ICH。抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路的活化可能作為治療老年ICH的一種方式。本研究為大黃素的運(yùn)用及開發(fā)提供了一定參考。