門 翔 黨 強 周小果 郭 娜 李 展 尚喜雨

（河南省南陽市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)，南陽 473009）

肺纖維化是嚴重影響人類健康的疾病，以逐漸加重的肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和肺組織纖維化為特征［1］。迄今為止，尚無療效確定的藥物或方法治療肺纖維化，預(yù)后極差，尋找治療肺纖維化的方法迫在眉睫［2］。尼達尼布和吡非尼酮是目前臨床治療肺纖維化的主要藥物，藥物總體有效率不高，尋找治療肺纖維化的有效藥物仍是臨床亟待解決的問題［3］。槲皮素作為一種天然的黃酮類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化作用等多種生理作用［4］。姜宗培等［5］研究發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制TGF-β1表達而發(fā)揮延緩腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。本研究通過檢測槲皮素對博來霉素致小鼠肺纖維化的影響，分析其可能的作用機制，旨在為肺纖維化的臨床研究或治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、儀器 戊巴比妥鈉、博萊霉素購自日本化藥株式會社；槲皮素購自Sigma公司；兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體、羊抗兔二抗IgG、DAB顯色試劑盒均購自上海萬生昊天生物科技有限公司； HYP檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司；RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-Time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；小鼠TGF-β1及β-actin引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計合成；LEICA RM 2135型石蠟切片機、LEICA EG 1140C型組織包埋機均購自德國萊卡公司；OlympusDP71型光學(xué)顯微鏡、CCD病理圖像采集分析處理系統(tǒng)均購自日本Olympus公司；PerkinElmer Lambda 35型全自動紫外分光光度計購自美國PerkinElmer公司；Rotor-Gene RG-3000型PCR熱循環(huán)儀購自澳大利亞Corbett公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及肺纖維化模型建立 健康雄性SPF級Balb/c小鼠（鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供）80只，8周齡，體質(zhì)量18～22 g。采用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分成4組，每組20只。分別為：正常對照組、肺纖維化模型組、槲皮素低劑量干預(yù)組、槲皮素高劑量干預(yù)組。配制1 mg/ml的博來霉素溶液，參照SZAPIEL等［6］方法將除對照組外其余3組的小鼠氣管內(nèi)注射鹽酸博萊霉素溶液（5 mg/kg）復(fù)制肺纖維化小鼠模型。對照組小鼠氣管內(nèi)一次性注入等體積的生理鹽水做正常對照。自造模后第1天起，各組給予同等容積的相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)，1次/d，對照組和模型組給予Nacl（0.1 ml/10 g）灌胃；槲皮素低劑量組給予0.5%槲皮素50 mg/kg（0.1 ml/10 g）灌胃；槲皮素高劑量組給予1%槲皮素100 mg/kg（0.1 ml/10 g）灌胃直至處死。

1.2.2 肺泡灌洗液細胞分類檢測 取10只小鼠于造模14 d、28 d后用注射器向大鼠左肺分3次注射10 ml生理鹽水，回收肺泡灌洗液（回收液＞80%灌洗液），將適量灌洗液3 000 r/min 離心15 min，取沉淀細胞稀釋后乙醇固定切片，HE染色，顯微鏡下計數(shù)細胞總數(shù)，取任一處視野，計數(shù)100個細胞，計算肺泡內(nèi)中性粒細胞比例。

1.2.3 標本收集 于造模后第14、28天各組隨機處死10只小鼠取材，取左肺立即投入液氮罐內(nèi)保存以備做勻漿進行實時熒光定量PCR及HYP的測定；右肺存放于10%中性甲醛溶液中固定以備做HE染色和Masson三色染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 肺組織病理及免疫組織化學(xué)檢查 將經(jīng)甲醛固定后的右肺組織經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋及連續(xù)切片4張后，分別行HE、Masson染色和TGF-β1的免疫組織化學(xué)染色。根據(jù)SZAPIEL等［6］方法用HE染色評定肺組織肺泡炎程度（-～+++），Masson染色評定肺組織纖維化程度（-～+++）。把此計數(shù)資料轉(zhuǎn)換為計量資料：-.計0分；+.計1分；++.計2分；+++.計3分。采用OlympusDP71CCD圖像采集分析系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)染色進行分析。陽性標準為在高倍視野下細胞膜或胞漿上出現(xiàn)棕黃色顆粒。在視野中隨機選取5個區(qū)域進行吸光度（A）值測量，以此5個區(qū)域的平均A值作為該切片的最后結(jié)果。

1.2.5 肺組織HYP含量測定 稱取30～100 mg經(jīng)液氮凍存的肺組織制成組織勻漿后，采用堿水解法測定肺組織中HYP的含量，嚴格按照試劑盒說明書的要求進行操作。

1.2.6 肺組織MDA、MPO、TAC含量測定 取30～100 mg經(jīng)液氮凍存的肺組織制成組織勻漿后，采用比色法測定肺組織中MDA、MPO、TAC的含量，嚴格按照說明書要求進行操作。

1.2.7 肺組織TGF-β1 mRNA的表達 實時熒光定量PCR法檢測肺組織勻漿中TGF-β1 mRNA的表達。取經(jīng)液氮凍存的肺組織80 mg勻漿后提取總RNA，以O(shè)ligo（dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以此為模板擴增，引物序列為：TGF-β1正向引物 5'-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3'，反向引物5'-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3'，擴增片段長度：143 bp。β-actin正向引物：5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，反 向 引 物 ：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'，擴增片段長度：300 bp。擴增條件：95 ℃預(yù)變性持續(xù)30 s，95 ℃變性持續(xù)5 s，60 ℃退火持續(xù)20 s，72 ℃延伸持續(xù)30 s，進行40個循環(huán)后實時連續(xù)測定基因擴增過程中產(chǎn)生的熒光。以β-actin作為內(nèi)參照，正常對照組作為基準，基準值定為1，模型組及各干預(yù)組mRNA的表達量均表達成基準值1的n倍［7］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進行分析，以±s的形式表示，采用單因素方差分析進行多組分比較，兩兩比較采用LSD-t分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液細胞分類 如表1所示，模型組小鼠肺泡灌洗液內(nèi)總細胞數(shù)、中性粒細胞比例均明顯高于正常對照組；槲皮素低、高劑量組小鼠肺泡灌洗液內(nèi)總細胞數(shù)、中性粒細胞比例均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時間段肺泡灌洗液細胞分類（±s，n=10）Tab.1 Classification of alveolar lavage fluid cells in different time periods of rats in each group （±s，n=10）

表1 各組大鼠不同時間段肺泡灌洗液細胞分類（±s，n=10）Tab.1 Classification of alveolar lavage fluid cells in different time periods of rats in each group （±s，n=10）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with pulmonary fibrosis model group，2）P＜0.05.

Groups Normal control Pulmonary fibrosis model Quercetin low-dose Quercetin high-dose F P Total cellular score（1×104 cells/ml）14 d 28 d 34.23±11.54 220.50±20.241）150.38±11.541）2）149.43±14.021）2）261.17 0.000 32.41±9.71 197.08±34.70 1）124.03±22.161）2）120.79±22.661）2）78.87 0.000 Neutrophil count（%）14 d 28 d 1.84±0.78 24.75±4.871）10.40±2.78 1）2）11.20±3.531）2）80.70 0.000 2.38±0.98 15.00±3.71 1）9.55±2.171）2）10.48±3.63 1）2）33.51 0.000

2.2 HE染色結(jié)果 如圖1所示，正常對照組肺組織，光鏡下見肺泡壁薄，結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)無炎癥細胞浸潤及滲出物；肺纖維化模型組肺組織，光鏡下見肺小血管充血明顯，肺泡壁及肺泡間隔明顯增厚，肺間隔及肺泡腔內(nèi)可見大量巨噬細胞及淋巴細胞浸潤，大量成纖維細胞增生及膠原纖維沉著，部分肺泡破壞融合；槲皮素低、高劑量組肺組織，與模型組出現(xiàn)了相似變化，但肺泡炎及纖維化程度均較模型組減輕，炎癥細胞及成纖維細胞均明顯減少。

圖1 造模14天各組小鼠肺組織HE染色Fig.1 HE staining of lung tissue of mice in each group after 14 d of modeling

2.3 Masson染色結(jié)果 如圖2所示，正常對照組肺組織未見代表膠原纖維的藍色沉積，無明顯肺纖維化表現(xiàn)；肺纖維化模型組肺組織可見大量藍色沉積，肺纖維化明顯；槲皮素低、高劑量組肺纖維化程度較肺纖維化模型組顯著減弱。

圖2 造模28天各組小鼠肺組織Masson染色圖Fig.2 Masson staining of lung tissue of mice in each group after 28 d of modeling

2.4 肺泡炎及肺纖維化評分 如表2所示，肺纖維化模型組肺泡炎及肺纖維化評分在2個時間段均明顯高于正常對照組（P＜0.05）；槲皮素低、高劑量組肺泡炎及肺纖維化評分均低于肺纖維化模型組（P＜0.05）。

表2 各組小鼠不同時間段肺泡炎及肺纖維化評分（±s，n=10）Tab.2 Scores of alveolitis and pulmonary fibrosis in mice of each group at different time periods （±s，n=10）

表2 各組小鼠不同時間段肺泡炎及肺纖維化評分（±s，n=10）Tab.2 Scores of alveolitis and pulmonary fibrosis in mice of each group at different time periods （±s，n=10）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05；compared with pulmonary fibrosis model group， 2）P＜0.05.

Groups Normal control Pulmonary fibrosis model Quercetin low-dose Quercetin high-dose F P 14 d 0.00±0.00 2.90±0.321）1.10±0.321）2）1.10±0.321）2）192.33 0.000 Degree of alveolitis 28 d 0.00±0.00 1.90±0.571）0.90±0.321）2）1.10±0.321）2）46.66 0.000 14 d 0.00±0.00 2.10±0.321）1.10±0.321）2）1.10±0.321）2）98.11 0.000 Degree of pulmonary fibrosis 28 d 0.00±0.00 2.90±0.321）1.90±0.571）2）1.90±0.321）2）112.53 0.000

2.5 各組小鼠肺組織HYP含量 如表3所示，模型組小鼠肺組織HYP含量明顯高于正常對照組，而且隨著時間進展有增高趨勢；槲皮素低、高劑量組小鼠肺組織的HYP含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠肺組織HYP含量比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of HYP content in lung tissue of mice in each group （±s，n=10）

表3 各組小鼠肺組織HYP含量比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of HYP content in lung tissue of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05；compared with pulmonary fibrosis model group， 2）P＜0.05.

Groups Normal control Pulmonary fibrosis model Quercetin low-dose Quercetin high-dose F P HYP/（μg·mg-1）14 d 0.20±0.03 0.44±0.041）0.24±0.042）0.25±0.082）48.46 0.000 28 d 0.21±0.05 1.08±0.231）0.45±0.171）2）0.59±0.111）2）56.65 0.000

2.6 各組小鼠肺組織MDA、MPO、TAC水平 如表4所示，模型組小鼠肺組織MDA、MPO含量均明顯高于正常對照組，抗氧化能力低于正常對照組；槲皮素低、高劑量組小鼠肺組織MDA、MPO含量均低于模型組，抗氧化能力高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠肺組織MDA、MPO、TAC水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of MDA， MPO， and TAC levels in lung tissue of mice in each group （±s，n=10）

表4 各組小鼠肺組織MDA、MPO、TAC水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of MDA， MPO， and TAC levels in lung tissue of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with pulmonary fibrosis model group，2）P＜0.05.

Groups Normal control Pulmonary fibrosis model Quercetin low-dose Quercetin high-dose F P MDA 14 d 1.11±0.16 2.21±0.181）1.13±0.19 1）2）1.15±0.191）2）93.68 0.000 28 d 1.00±0.15 3.92±0.211）1.61±0.181）2）1.62±0.151）2）537.28 0.000 MPO 14 d 0.98±0.13 4.38±0.28 1）1.24±0.261）2）1.23±0.261）2）459.94 0.000 28 d 1.07±0.21 3.17±0.66 1）1.13±0.101）2）1.15±0.12 1）2）83.30 0.000 TAC 14 d 13.37±1.80 2.31±0.881）6.15±1.221）2）6.39±1.69 1）2）101.40 0.000 28 d 13.01±1.48 4.25±0.901）8.00±1.021）2）8.75±1.27 1）2）91.51 0.000

2.7 免疫組織化學(xué)結(jié)果 如圖3，在正常對照組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白少量表達；在肺纖維化模型組小鼠肺組織中血管壁、支氣管壁平滑肌細胞、肺間質(zhì)肌成纖維細胞等細胞質(zhì)及細胞核中均可見大量棕色顆粒沉積的TGF-β1蛋白表達，且28 d模型組較14 d模型組表達量明顯增多；槲皮素低劑量組、高劑量組肺組織中TGF-β1蛋白表達均顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖3 造模14 d及28 d天各組小鼠肺組織TGF-β1免疫組化圖Fig.3 TGF-β1 immunohistochemical diagram of lung tissue of mice in each group at after 14 d and 28 d of modeling

2.8 RT-PCR檢測結(jié)果 如表5所示，在2個時間段，槲皮素低、高劑量組肺組織TGF-β1 mRNA表達量較肺纖維化模型組明顯降低，肺纖維化模型組肺組織TGF-β1 mRNA表達量較正常對照組明顯增加（P＜0.05）。

表5 各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和mRNA表達水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of TGF-β1 protein and mRNA expression levels in lung tissue of mice in each group （±s，n=10）

表5 各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和mRNA表達水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of TGF-β1 protein and mRNA expression levels in lung tissue of mice in each group （±s，n=10）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with pulmonary fibrosis model group，2）P＜0.05.

Groups Normal control Pulmonary fibrosis model Quercetin low-dose Quercetin high-dose F P TGF-β1 protein （A）14 d 21.41±1.41 53.24±1.631）35.50±1.601）2）35.39±1.641）2）684.46 0.000 28 d 21.31±1.60 71.17±1.761）47.95±1.761）2）48.10±1.661）2）1 443.50 0.000 TGF-β1 mRNA （2-ΔΔCt）14 d 1.00±0.00 5.72±1.041）2.91±0.881）2）2.81±1.081）2）50.11 0.000 28 d 1.00±0.00 7.29±1.851）3.80±0.791）2）3.79±1.011）2）52.46 0.000

3 討論

槲皮素是一種廣泛存在于植物中的類黃酮化合物，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其具有較強的抗炎、抗氧化及清除自由基的作用，近年來有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗肝纖維化及抗腎間質(zhì)纖維化的作用［6-10］。

郭燕妮等［11］和于文成等［12］研究證明，博來霉素所致鼠肺間質(zhì)纖維化形成過程中炎癥細胞發(fā)揮了重要作用，尤其是肺泡內(nèi)的巨噬細胞以及中性粒細胞。肺泡巨噬細胞是肺內(nèi)合成和分泌功能最旺盛的細胞，能大量分泌前纖維化因子TGF-β1。中性粒細胞在炎癥過程中釋放大量毒性物質(zhì)從而導(dǎo)致肺實質(zhì)損傷及組織結(jié)構(gòu)破壞，是致肺纖維化的重要炎癥細胞［13-14］。本研究結(jié)果也顯示，肺纖維化模型組小鼠各個時期肺泡炎明顯，肺泡內(nèi)細胞總數(shù)及中性粒細胞比例也明顯升高。槲皮素低、高劑量組小鼠各期肺泡炎程度均比博來霉素組明顯降低。提示槲皮素可以減少肺泡炎癥，抑制肺纖維化過程中早期肺內(nèi)的炎癥損傷。氧化應(yīng)激使機體自由基過量，無法被正常清除，導(dǎo)致一種氧化失衡狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)在肺間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要作用［15-17］。本研究結(jié)果也顯示，肺纖維化模型組各時期肺組織中檢出大量脂質(zhì)過氧化物，肺組織總抗氧化能力也明顯低于正常小鼠；槲皮素低、高劑量組小鼠各時期肺組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量比博來霉素組明顯減少，且總抗氧化能力明顯增加，提示槲皮素可能通過抗脂質(zhì)過氧化抑制肺纖維化過程。

TGF-β1可由多種細胞分泌，如肺泡內(nèi)的巨噬細胞、上皮細胞或成纖維細胞等，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的致肺間質(zhì)纖維化因子：首先它是強有力的細胞外基質(zhì)沉積促進劑，能作用于多個環(huán)節(jié)，一方面能夠促進細胞外基質(zhì)蛋白的形成及沉淀，另一方面能夠抑制其分解，從而加速肺間質(zhì)膠原沉積；其次TGF-β1還可以促進成纖維細胞增殖和聚集，同時促進成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞表型。肌成纖維細胞是肺間質(zhì)中的主要細胞成分之一，是肺纖維化中最主要的效應(yīng)細胞，其以胞漿中α-平滑肌肌動蛋為特異性標志物，它能生成膠原蛋白以及彈性蛋白，進一步形成纖維體，分泌糖胺多糖和糖蛋白形成基質(zhì)從而參與細胞外基質(zhì)沉積［18］。AHN等［19］研究發(fā)現(xiàn)通過阻斷TGF-β1信號路徑可以治療肺間質(zhì)纖維化疾病。本研究也發(fā)現(xiàn)肺纖維化模型組小鼠肺組織中TGF-β1的蛋白和基因表達量比正常對照組小鼠顯著增多，而槲皮素低、高劑量干預(yù)組比肺纖維化模型組明顯減少，說明槲皮素拮抗博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的作用可能通過下調(diào)TGF-β1蛋白和mRNA的表達產(chǎn)生，此與GAO等［20］及WANG等［21］研究結(jié)果相似。

總之，本研究結(jié)果表明，槲皮素能夠通過減輕小鼠肺泡炎癥、脂質(zhì)過氧化水平抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化形成，其抑制肺纖維化形成的作用可能通過下調(diào)TGF-β1的表達和HYP合成實現(xiàn)。