馬敬雪 鞏奇明 潘秀虹 何林檁 尤燕舞 （右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，百色 533000）

目前認為，狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）的 發(fā)生是由于機體的免疫應(yīng)答系統(tǒng)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致抗原抗體免疫復(fù)合物沉積于腎臟，隨之產(chǎn)生趨化因子、黏附因子、促炎癥因子等細胞因子的釋放，引起腎臟組織發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎臟系膜增生和內(nèi)皮細胞損傷。調(diào)節(jié)性T細胞（T regulatory cells，Treg）是一類調(diào)控機體免疫功能的新型T細胞亞群，能維持免疫系統(tǒng)對自身成分的耐受，使機體保持免疫穩(wěn)態(tài)。當(dāng)其功能或數(shù)量發(fā)生異常變化時，會導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生。Treg免疫療法有可能成為治療自身免疫性疾病的新途徑。Fractalkine（FKN）是CX3C-類趨化因子超家族中的唯一成員［1］。近年的研究證實，MRL/lpr小鼠腎皮質(zhì)FKN的表達量較正常對照組明顯升高［2］。同樣，有學(xué)者在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，與健康者對比，SLE患者血清中FKN的水平明顯升高，并且與疾病的活動度呈正相關(guān)，與外周血的Treg細胞計數(shù)呈負相關(guān)［3］。另一項研究顯示，在發(fā)病前或LN早期，輸注了FKN拮抗劑的MRL/lpr小鼠，其腎小球細胞增生、腎小球硬化、新月體形成及血管炎等表現(xiàn)明顯減輕，表明FKN拮抗劑能延緩LN的發(fā)病并改善病情進展［4］。p38MAPK可被趨化因子、炎癥因子和其他外部應(yīng)激激活。p38MAPK信號通路一旦被激活，就可以啟動p53、PAX6、CREB和ATF2等轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生，從而調(diào)控促炎癥或凋亡相關(guān)基因的產(chǎn)生［5］。p38MAPK信號通路大量存在于T細胞和B細胞中，并且參與T細胞和B細胞的許多細胞過程和反應(yīng)［6-9］。許多數(shù)據(jù)表明，p38MAPK活性在炎癥反應(yīng)、正常免疫過程中起關(guān)鍵作用［10］。此外，p38MAPK被激活并參與人類自身免疫性疾病的發(fā)病機制，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡［11-12］。既往的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠系膜細胞的增殖受FKN的影響，在高濃度FKN條件下，p38MAPK信號通路被激活。另外李波［13］研究證實，在單個核細胞中FKN可激活p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)單個核細胞的功能。然而迄今為止，F(xiàn)KN是否可通過p38MAPK信號通路參與Treg細胞功能的調(diào)節(jié)鮮有報道。本研究旨在構(gòu)建LN小鼠模型，探究FKN在LN小鼠腎組織的表達及在LN Treg細胞凋亡中的作用及其分子機制，為闡明LN的發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡的BALB/c雌性小鼠80只，購自湖南長沙天勤實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0014；Pristane（S44062，上海源業(yè)生物科技有限公司）；FKN中和抗體（MAB571，R&D Systems，USA）；用于動物的SB203580（S1076，Selleck，China）；用于動物的U-46619（16450，Cayman，China）；IL-2、TGF-β（中國新生物科學(xué)公司）；用于細胞的U-46619（Santa Cruz Biotechnology，USA）；用于細胞的SB203580（S1863-1，Beyotime Biotechnology，China）；胰蛋白酶、雙抗、PBS、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin V-FITC、PI凋亡試劑檢測盒（BD）；胎牛血清、RPMI1640、紅細胞裂解液、Hanks液（Gibco）；免疫磁珠分選試劑盒（CD4+CD25+Regulatory T Cell Ⅰ solation Kit，No.130-091-014，Miltenyi Biotec）；兔抗 Bax一抗、兔抗Bcl-2一抗、鼠抗Cyt-c一抗、兔抗FKN一抗、兔抗Foxp3一抗、兔抗p38一抗（Abcam）；兔抗phosphop38一抗（Affinity公司）；鼠抗GAPDH（Proteintech）；山羊抗鼠IgG/辣根酶標(biāo)記及山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記（中杉金橋）；SiRNA腺病毒株（上海吉凱公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建及分組 雌性BALB/c小鼠一次性腹腔注射500 μl Pristane，喂養(yǎng)期間小鼠自由飲水及進食。12周后，根據(jù)課題組前期的驗證方法檢測24 h尿蛋白含量、血清抗核抗體表達及PASM染色觀察腎組織病理改變以鑒定LN小鼠模型成功建立［14］。將實驗小鼠隨機分為正常組、Anti-FKN組、SB203580組、U-46619組、模型組、模型+Anti-FKN組、模型+SB203580組、模型+U-46619組、模型+Anti-FKN+SB203580組及模型+Anti-FKN+U-46619組，每組5只小鼠。各組小鼠腹腔注射給藥：①正常組：給予正常小鼠腹腔注射生理鹽水500 μl/（只·d），連續(xù)2周；②Anti-FKN組：給予正常小鼠腹腔注射Anti-FKN 5.0 μg/（只·d），連續(xù)2周；③SB203580組：給予正常小鼠腹腔注射SB203580 2 mg/（kg·d），連續(xù)2周；④U-46619組：給予正常小鼠腹腔注射U-46619 2 mg/（kg·d），連續(xù)2周；⑤模型組：給予模型組小鼠腹腔注射生理鹽水500 μl/（只·d），連續(xù)12周；⑥模型+Anti-FKN組：給予模型小鼠腹腔注射Anti-FKN 5.0 μg/（只·d），連續(xù)2周；⑦模型+SB203580組：給予模型小鼠腹腔注射SB203580 2 mg/（kg·d），連續(xù)2周；⑧模型+U-46619組：給予模型小鼠腹腔注射U-46619 2 mg/（kg·d），連續(xù)2周；⑨模型+Anti-FKN+SB203580組：給予模型小鼠腹腔注射Anti-FKN 5.0 μg/（只·d）及SB203580 2 mg/（kg·d），連續(xù)2周；⑩模型+Anti-FKN+U-46619組：給予模型小鼠腹腔注射Anti-FKN 5.0 μg/（只·d）及U-46619 2 mg/（kg·d），連續(xù)2周。干預(yù)2周后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，摘取腎臟。

1.2.2 免疫組化方法 腎組織石蠟切片進行程序性脫蠟，滴加一抗工作液4 ℃過夜，PBS緩沖液清洗后滴加二抗37 ℃孵育30 min，用二氨基聯(lián)苯胺顯色，然后用蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察腎組織中的FKN、p-p38、Foxp3的蛋白表達情況。

1.2.3 細胞分選及培養(yǎng) 處死LN模型小鼠后浸泡在75%無水乙醇10 min，取出脾臟剪碎后置于200目的篩網(wǎng)過濾網(wǎng)中，用注射器的活塞進行研磨（研磨過程中不斷加入Hank's液，保持脾臟的濕度）濾出單個細胞懸液；離心后加入等量紅細胞裂解液，放入37 ℃搖床5 min，制備RPMI1640培養(yǎng)基脾細胞懸液后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，使貼壁細胞貼壁；用巴氏滴管輕輕吸出懸浮細胞（即總淋巴細胞），并計數(shù)；加入終濃度為10 ng/ml的TGF-β和IL-2促進細胞增殖及分化，培養(yǎng)42 h后開始分選；收集細胞并計數(shù)，每1×107個細胞用40 μl 分選Buffer重懸；每1×107個細胞加入10 μl CD4+CD25+Regulatory T cell BIoTin-Antibody Cocktail，2～8 ℃孵育10 min；每1×107個細胞體系中，加入38 μl 分選Buffer，20 μl Anti-Biotin Microbeads，2 μl CD25-PE Antibody，混勻后 2～8 ℃孵育 15 min；過柱收集不吸附的液體（即CD4+Treg細胞）；液體離心（300 g，5 min），用90 μl分選Buffer重懸，加入10 μl Anti-PE Microbeads，混 勻 后 2～8 ℃ 孵 育 15 min；過柱收集吸附于磁柱上的磁珠細胞（即CD4+CD25+Treg細胞）。收集分選出來的CD4+CD25+Treg細胞轉(zhuǎn)移到RPMI1640完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染及分組 按每孔2×105個/ml在6孔板接種Treg細胞，常規(guī)培養(yǎng)至70%融合時更換無血清培養(yǎng)液，將陽性及陰性載體腺病毒加入無血清無抗生素的培養(yǎng)基中并充分混勻，使病毒終濃度為6×107pfu/ml，于室溫下孵育5 min后轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染成功后24～48 h觀察細胞狀態(tài)，生長狀態(tài)良好時，加入8 μg/ml的嘌呤霉素（Puromycin）選擇轉(zhuǎn)染細胞，直至正常細胞完全死亡，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。并采用Western blot法鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。將LN Treg細胞分為7組：對照組、空載體組、FKN-KD組、U-46619組、SB203580組、FKN-KD+U-46619組及FKN-KD+SB203580組。在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.5 Western blot法 收集各組細胞至離心管離心，棄上清后用預(yù)冷的PBS液洗2次，加入150 μl預(yù)冷PI裂解液，冰浴30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，以二喹啉甲酸（BCA）法測定提取蛋白質(zhì)量濃度。每個樣本取30～50 μg蛋白加入5×SDS上樣緩沖液煮沸變性后，SDS-PAGE電泳，濕式電印跡法300 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜，3%BSA室溫封閉1 h，加TBST洗膜緩沖液洗3次，每次10 min加入一抗孵育4 ℃過夜，加TBST洗膜緩沖液洗3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG（H+L），常溫振蕩孵育1 h，洗滌后采用Chemi-DocXRS 凝膠成像系統(tǒng)Qunatity One軟件采集圖像，灰度值采用NIH Image軟件（National Institute of-Health，Bethesda，Md，USA）測定。以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示其相對含量。重復(fù)試驗3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗。服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析。非正態(tài)分布則以中位數(shù)和極值表示，采用秩和檢驗。每個實驗組重復(fù)3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FKN、 p38MAPK及Foxp3在LN小鼠腎組織中的表達 經(jīng)U-46619干預(yù)后的正常小鼠及模型小鼠均在5～7 d內(nèi)連續(xù)死亡。與正常對照組相比，模型組小鼠腎組織中的FKN及磷酸化p38MAPK的表達明顯上調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)oxp3染色陽性的Treg細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，模型+anti-FKN組和模型+SB203580組腎組織中的FKN及磷酸化p38MAPK的表達明顯下調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)oxp3染色陽性的Treg細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與模型+anti-FKN組和模型+SB203580組相比，模型+anti-FKN+SB203580組腎組織中的FKN及磷酸化p38MAPK的表達進一步下調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)oxp3染色陽性的Treg細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）。然而，模型+anti-FKN組和模型+SB203580組腎組織中的FKN及磷酸化p38MAPK的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 FKN、p38MAPK及Foxp3在LN小鼠腎組織中的表達Fig.1 Expression of FKN ， p38MAPK and Foxp3 in kidney of mice with LN

2.2 細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果的鑒定 根據(jù)腺病毒轉(zhuǎn)染細胞的操作說明書轉(zhuǎn)染Treg細胞24 h后用熒光倒置顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染組細胞可見綠色熒光均勻分布于懸浮Treg細胞內(nèi)（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染后Treg細胞綠色熒光蛋白表達情況Fig.2 Expression of green fluorescent protein in transfected Treg cells

收集細胞并提取總蛋白，采用Western blot檢測正常Treg細胞及敲低FKN的Treg細胞中FKN的表達量。結(jié)果顯示，兩組細胞中均有FKN的表達，轉(zhuǎn)染組細胞中的FKN表達量明顯低于對照組（P＜0.05，圖3）。

圖3 敲低FKN基因后Treg細胞中FKN蛋白表達變化Fig.3 Expression of FKN protein in Tregs cells with FKN knockdown

2.3 FKN通過激活LN Treg細胞中p38MAPK磷酸化抑制Foxp3的表達 與對照組相比，敲低FKN后p38MAPK的磷酸化水平明顯降低，而Foxp3表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與FKNKD組相比，F(xiàn)KN-KD+U-46619組的p38MAPK磷酸化水平明顯升高，而Foxp3表達明顯降低，F(xiàn)KN-KD+SB203580組的p38MAPK磷酸化水平進一步降低，而Foxp3表達進一步增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），然而，SB203580組的p38MAPK磷酸化水平和Foxp3表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組相比，U-46619組的p38MAPK磷酸化水平進一步升高，而Foxp3表達進一步降低；SB203580組的p38MAPK磷酸化水平明顯降低，而Foxp3表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），F(xiàn)KN-KD+U-46619組中的p38MAPK磷酸化和Foxp3的表達水平均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。然而，非磷酸化p38MAPK均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 Western blot檢 測 各 組 Foxp3、p-p38MAPK、p38MAPK相關(guān)蛋白的表達水平Fig.4 Expression levels of Foxp3， p-p38MAPK， p38MAPK protein detected by Western blot

2.4 FKN及p38MAPK信號通路影響相關(guān)凋亡蛋白的表達 與對照組相比，F(xiàn)KN-KD組、SB203580組中的Bax及Cyt-c的表達明顯減少，Bcl-2的表達明顯增加，U-46619組中的Bax及Cyt-c的表達明顯增加，Bcl-2的表達明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與FKN-KD組相比，F(xiàn)KN-KD+U-46619組中Bax及Cyt-c的表達明顯增加，Bcl-2的表達明顯減少，而FKN-KD+SB203580組中Bax及Cyt-c的表達明顯減少，Bcl-2的表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與 U-46619組相比，F(xiàn)KN-KD+U-46619組中Bax及Cyt-c的表達明顯減少，Bcl-2的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與SB203580組相比，F(xiàn)KN-KD+SB203580組中Bax及Cyt-c的表達明顯減少，Bcl-2的表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。然而，與對照組相比，F(xiàn)KN-KD+U-46619組的Bax、Bcl-2及Cyt-c的表達均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與FKN-KD組相比，SB203580組的Bax、Bcl-2及Cyt-c的表達均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖5 Western blot檢測各組Bax、Bcl-2、Cyt-c相關(guān)蛋白的表達水平Fig.5 Expression levels of Bax， Bcl-2， Cyt-c protein detected by Western blot

3 討論

LN是一種自身免疫性疾病，其特征在于T細胞功能障礙，包括Treg細胞的凋亡及損傷［15-16］。Treg細胞具有免疫抑制和維持免疫耐受的功能，它在免疫調(diào)節(jié)和發(fā)育耐受中起著關(guān)鍵性的作用［15，17-19］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)FKN參與細胞黏附、生長調(diào)節(jié)和炎癥免疫反應(yīng)［20］。FKN在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化和腫瘤等免疫炎癥疾病組織中高表達，并且與疾病活動性有關(guān)［21-27］。此外，F(xiàn)KN在LN患者的血清中高表達，并且與LN患者的腎損害程度呈正相關(guān)［4，22］。研究證實，F(xiàn)KN是一種自身免疫性疾病中T細胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵趨化因子。FKN在Treg細胞中過度表達，對Treg細胞具有較強的趨化作用，從而影響Treg細胞的功能，最終導(dǎo)致免疫失衡，加速免疫疾病的進展［28］。因此，本課題組認為趨化因子FKN調(diào)控Treg細胞的功能，從而參與LN的發(fā)生發(fā)展過程。重要的是，本課題組的前期研究已經(jīng)證實，在LN小鼠模型的血液中Treg細胞的比例顯著降低，腎組織中Foxp3表達量也顯著減少［14］。而在本研究中，采用免疫組化法、Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，抑制和（或）敲低FKN的表達后，則可增加LN腎組織及Treg細胞中Foxp3的表達，減少Treg細胞中促凋亡蛋白的表達，增加抗凋亡蛋白的表達［29］。然而，F(xiàn)KN如何調(diào)控Foxp3的表達及誘導(dǎo)Treg細胞凋亡的分子機制至今仍未闡明。

p38MAPK家族的四個主要成員包括p38、MAPK11、SAPK4和SAPK3，它們被趨化因子、炎癥因子、紫外線輻射、熱休克、高滲壓和其他外部應(yīng)激激活。p38MAPK通路一旦被激活，就可以啟動p53、PAX6、CREB和ATF2等轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生，從而調(diào)控促炎癥或凋亡相關(guān)基因的產(chǎn)生［5］。p38MAPK介導(dǎo)重要生物學(xué)反應(yīng)的信號，包括轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化、炎癥細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生［30-31］。LIU等［32］發(fā)現(xiàn)，單核細胞中的p38MAPK信號通路在LN中起重要的致病作用。另一個研究發(fā)現(xiàn)，SLE小鼠的腎臟組織中p38MAPK mRNA水平顯著升高［12］。系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的腎損傷和IgG的產(chǎn)生依賴于p38MAPK的激活，p38MAPK的激活上調(diào)了SLE小鼠的趨化因子和IgG的產(chǎn)生［32］。p38MAPK信號通路是LN炎癥反應(yīng)的一個關(guān)鍵途徑［33-34］。本研究結(jié)果顯示，p38MAPK的磷酸化水平在LN小鼠中的血清和腎臟組織中高表達。大量的研究已經(jīng)表明，p38MAPK信號通路在促炎細胞因子合成前的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中起著至關(guān)重要的作用，這使得p38MAPK信號通路的不同組成部分成為炎癥性疾病和自身免疫性疾病潛在的治療靶點［10，35］。自1993年發(fā)現(xiàn)以來，p38MAPK因其在廣泛的細胞過程中的作用而備受關(guān)注，尤其是適應(yīng)性免疫過程［2，6，36-39］。p38MAPK豐富地存在于T細胞和B細胞中［7-9，40］；因此，p38MAPK信號通路必須在T細胞和B細胞的許多細胞過程和反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有證據(jù)表明激活p38MAPK信號通路可以促進細胞凋亡［41］。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)，LN患者外周血單個核細胞中磷酸化p38MAPK表達水平明顯上調(diào)［32］。在本研究中，抑制和（或）敲低FKN的表達，則減少LN模型小鼠腎組織及Treg細胞中磷酸化p38MAPK的表達；此外，p38MAPK的激活劑可減少Foxp3及抗凋亡蛋白的表達；然而，p38MAPK的抑制劑則可逆轉(zhuǎn)上述因子的表達。這說明，F(xiàn)KN可通過激活p38MAPK信號通路誘導(dǎo)Treg細胞的凋亡，減少Foxp3的表達。

綜上所述，F(xiàn)KN可能通過激活p38MAPK信號通路參與Treg細胞的凋亡過程，從而參與LN的發(fā)生和發(fā)展。