徐潤灝， 鄒 琛， 曹 蕓， 陳 風(fēng)， 劉怡菁， 張舒林， 張 潔

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗科，上海 200001；2.上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，上海 200062；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025）

2020年，我國肺癌新發(fā)病例約為81.5萬，新增死亡病例約為71.5萬，分別較5年前增長了3.6%和11.9%[1]，其中85.0%為非小細(xì)胞肺癌患者（non-small cell lung cancer，NSCLC），有64.6%的患者確診時已處于晚期（臨床Ⅲ～Ⅳ期）[2]。肺癌患者的5年生存率會隨著肺癌的進(jìn)展而降低，Ⅰ期患者的5年生存率可達(dá)92.4%，Ⅱ期為73.7%[3]，而Ⅲ期和Ⅳ期患者的生存率急劇下降，一些地區(qū)Ⅳ期肺癌患者的5年生存率僅為5.3%[4]。因此，早期診斷NSCLC對提高肺癌患者的整體生存率具有重要意義。

氨基酸代謝是肺癌患者血清差異表達(dá)代謝物富集最顯著的通路之一[5]，部分氨基酸有成為NSCLC診斷標(biāo)志物的潛能。有研究結(jié)果顯示，NSCLC患者和健康人多種血清氨基酸水平有差異[6-11]。但這些研究未參照臨床分期對NSCLC患者進(jìn)行區(qū)分，也未對早期和中晚期NSCLC患者的血清氨基酸水平進(jìn)行比較。莫靚等[12]的研究結(jié)果顯示，不同臨床分期的NSCLC患者血清中包括氨基酸在內(nèi)的多個小分子代謝物存在明顯差異。為此，本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)檢測NSCLC患者5類共14種氨基酸[非極性蛋白氨基酸：包括丙氨酸（alanine，Ala）、甘氨酸（glycine，Gly）、亮氨酸（leucine，Leu）、脯氨酸（proline，Pro）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、纈氨酸（valine，Val）、蛋氨酸（methionine，Met）；極性中性蛋白氨基酸，即酪氨酸（tyrosine，Tyr）；酸性蛋白氨基酸，即谷氨酸（glutamic acid，Glu）；堿性蛋白氨基酸：包括精氨酸（arginine，Arg）、組氨酸（histidine，His）、賴氨酸（lysine，Lys）；非蛋白氨基酸：包括瓜氨酸（citrulline，Cit）、鳥氨酸（ornithine、Orn）]水平，探討氨基酸在早期NSCLC輔助診斷中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年7月—2021年1月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院確診的早期NSCLC患者64例（早期NSCLC組，其中男34例、女30例，年齡27～82歲；臨床分期Ⅰ期55例、Ⅱ期9例）、中晚期NSCLC患者55例（中晚期NSCLC組，其中男29例、女26例，年齡29～82歲；臨床分期Ⅲ期23例、Ⅳ期32例）。入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)和組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性NSCLC，未經(jīng)放療、化療和手術(shù)治療。另選取同期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院確診為社區(qū)獲得性肺炎等肺部良性疾病患者65例（肺良性疾病組），其中男35例、女30例，年齡25～86歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床診斷排除肺部惡性腫瘤可能，且無其他臟器重大疾病。以2020年10月—2021年1月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院健康體檢者80名為正常對照組，其中男43名、女37名，年齡24～81歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)檢查肺部未見明顯病變，無其他重大疾病，血糖、血脂、肝功能、腎功能等常規(guī)指標(biāo)均無異常。所有研究對象均未服用免疫抑制劑和氨基酸類藥物，各組間年齡和性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)號：2017205），所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理 采用促凝管采集所有對象空腹靜脈血4 mL，30 min內(nèi)2 685×g離心10 min，分離血清。在24 h內(nèi)進(jìn)行檢測的血清樣本冷藏（2～8 ℃）保存；無法及時檢測的樣本，吸取血清裝入離心管，冷凍（-80 ℃及以下）保存。

1.2.2 儀器和試劑 采用API3200MD三重四級桿質(zhì)譜儀（美國ABSciex公司）、LC-20A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）和氨基酸代謝譜分析試劑盒（上?？闪γ匪镝t(yī)藥科技有限公司）檢測Ala、Gly、Leu、Pro、Phe、Val、Met、Tyr、Glu、Arg、His、Lys、Cit、Orn，試劑盒中含氨基酸內(nèi)標(biāo)液、流動相添加劑A（主要成分為甲酸）、流動相添加劑B（主要成分為甲酸銨）、氨基酸轉(zhuǎn)化液（主要成分為正丁醇）、樣本稀釋液等。按試劑盒說明書配制內(nèi)標(biāo)提取液、流動相A（含0.3%流動相添加劑A和0.1%流動相添加劑B）、流動相B（95%甲醇，美國MERCK公司）。

1.2.3 樣本預(yù)處理 吸取20 μL待測血清樣本至離心管中，加入80 μL樣本稀釋液，16 000×g離心5 min。取10 μL稀釋后的樣本，加入內(nèi)標(biāo)提取液100 μL，渦旋混勻5 min，16 000×g離心5 min。取上清液50 μL，加入96孔板，50 ℃氮?dú)獯蹈?。加入氨基酸轉(zhuǎn)化液500 μL，置于微孔板恒溫振蕩器中，60 ℃振蕩衍生反應(yīng)30 min，60 ℃氮?dú)獯蹈?。加入?fù)溶液100 μL，繼續(xù)振蕩混勻10 min，直接進(jìn)樣檢測。

1.2.4 氨基酸檢測條件 （1）色譜條件：分析柱為ACE Excel3 C18（3.0 mm×100 mm，英國ACE公司），柱溫40 ℃，梯度洗脫，流速為550 μL/min。（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描，離子源參數(shù)為霧化氣壓力50 psi、輔助加熱器壓力50 psi、氣簾氣壓力30 psi、碰撞氣壓力6 psi；離子源電壓5 000 V；離子源溫度500 ℃；使用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行掃描分析。

1.2.5 腫瘤標(biāo)志物檢測 采用cobas e801全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）檢測血清糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）和鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）水平。參考區(qū)間參照試劑說明書：CA 19-9為0～27 U/mL，CEA為0～4.7 ng/mL，CYFRA 21-1為0～3.3 ng/mL，SCC-Ag為0.5～2.7 ng/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件及GraphPad 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用K-S檢驗評估數(shù)據(jù)的正態(tài)性。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用二元Logistic回歸分析（逐步法）擬合出各項指標(biāo)的最佳診斷組合，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價各項指標(biāo)單項檢測和聯(lián)合診斷早期NSCLC的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間血清14種氨基酸水平比較

與正常對照組相比，早期NSCLC組血清His、Lys水平降低（P＜0.05），血清Ala、Pro、Val、Glu、Cit、Orn水平升高（P＜0.05）。與肺良性疾病組比較，早期NSCLC組血清Ala、Leu、Pro、Val、Glu、His、Lys、Cit、Orn水平升高（P＜0.05）。與早期NSCLC組比較，中晚期NSCLC組血清Ala、Leu、Val、Glu、Lys水平降低（P＜0.05）。見表1。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果的比較見表2。

表1 各組間血清14種氨基酸水平的比較

表2 本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果比較

2.2 各組間血清CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1、SCC-Ag水平比較

與正常對照組比較，早期NSCLC組血清CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1水平升高（P＜0.01）。與肺良性疾病組比較，早期NSCLC組血清CA 19-9、CYFRA 21-1水平升高（P＜0.01）。各組間血清SCC-Ag水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組間4種血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的比較

2.3 各項指標(biāo)單項檢測和聯(lián)合檢測診斷早期NSCLC的效能

早期NSCLC組與正常對照組之間、早期NSCLC組與肺良性疾病組之間血清Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn水平均發(fā)生相同變化，因此將正常對照組和肺良性疾病組合并為非腫瘤組。ROC曲線分析結(jié)果顯示，在早期NSCLC組與非腫瘤組之間有差異的6種氨基酸（Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn）和3種腫瘤標(biāo)志物（CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1）中，單項診斷早期NSCLC效能最高的項目為Cit，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.709，敏感性為81.25%，特異性為53.10%。采用二元Logistic回歸分析（逐步法）從9項指標(biāo)中擬合出的最佳組合為Glu+Val+Cit+CYFRA 21-1，聯(lián)合檢測模型為：Y=1/[1+e-Logit（P）]，式中Logit（P）=0.006×Glu+0.007×Val+0.061×Cit+0.519×CYF RA 21-1-7.79。聯(lián)合檢測模型診斷早期NSCLC的AUC為0.808，敏感性為64.56%，特異性為88.28%。見表4、圖1。

表4 各項指標(biāo)單項檢測和聯(lián)合檢測診斷早期NSCLC的效能

圖1 各項指標(biāo)單項檢測和聯(lián)合檢測診斷早期NSCLC的ROC曲線

3 討論

本研究結(jié)果顯示，相對于正常對照者，早期NSCLC（臨床Ⅰ期和Ⅱ期）患者血清中非極性蛋白氨基酸Ala、Pro、Val和酸性氨基酸Glu水平較高（P＜0.05），堿性氨基酸His、Lys水平較低（P＜0.05）。目前，已有學(xué)者對NSCLC患者血液蛋白氨基酸譜進(jìn)行了分析[6-10]，但結(jié)果相互矛盾（表2）。由于這些研究中各期NSCLC患者的比例不盡相同，且未對各期NSCLC進(jìn)行分組比較，因此造成結(jié)果矛盾的原因可能是在NSCLC的不同階段，患者血液中的氨基酸水平發(fā)生不同變化所致；也可能與血液樣本的其他成分有關(guān)。KALUARACHCHI等[13]認(rèn)為，受血小板的影響，血漿樣本中的部分氨基酸會大量丟失或發(fā)生組分改變。

本研究結(jié)果還顯示，早期NSCLC患者血清中非蛋白氨基酸Cit、Orn水平較高。Cit和Orn是尿素循環(huán)的關(guān)鍵氨基酸，在多種不同部位的腫瘤患者血液中明顯升高[14-15]，其原因尚不明確。POILLET-PEREZ等[16]認(rèn)為細(xì)胞的自噬作用可以通過尿素循環(huán)維持腫瘤的生長，這可能會導(dǎo)致Cit和Orn水平代償性增高。同時高水平的Cit能更快地激活中性粒細(xì)胞，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)的形成[17]，從而誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。

值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，中晚期NSCLC組多數(shù)氨基酸水平低于早期NSCLC組（P＜0.05）。這可能是在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖過程中，蛋白質(zhì)及氨基酸被大量消耗導(dǎo)致的[19]。肺部腫瘤不僅會影響人體的呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，還會引起人體能量代謝的改變，使機(jī)體氨基酸表達(dá)異常；在肺部腫瘤患者體內(nèi)，氨基酸為腫瘤細(xì)胞的增殖提供能量，構(gòu)建其生長所需的蛋白質(zhì)，并參與腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的免疫逃逸[19]。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，在早期NSCLC組與正常對照組、肺良性疾病組發(fā)生相同改變的6種氨基酸（Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn）中，診斷效能最高的是Cit（0.709），其A U C甚至高于3種經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物（CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1）。這可能是因為早期NSCLC患者血清Cit水平較高，而肺部良性疾病患者Cit水平無明顯變化；腫瘤標(biāo)志物水平不僅在NSCLC中較高，在肺部良性疾病患者中同樣也較高。相對于健康對照者，肺炎等肺部良性疾病患者血中CEA水平可升高2～3倍[20]，CYFRA 21-1可升高50%[21]，有50%以上的肺部良性疾病患者CA 19-9等也會有不同程度的升高[22]。另外，本研究采用二元Logistic回歸分析對早期NSCLC組與非腫瘤組之間有差異的6種氨基酸（Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn）和3種腫瘤標(biāo)志物（CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1）進(jìn)行擬合，篩選出診斷早期NSCLC效能最高的指標(biāo)組合（Glu+Val+Cit+CYFRA 21-1），其AUC為0.808，敏感性為64.56%，特異性為88.28%。目前，由于外周血腫瘤標(biāo)志物的敏感性或特異性并不高，且忽視了除經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物外的其他指標(biāo)，如補(bǔ)體4[23]、各類載脂蛋白[24]等蛋白組學(xué)指標(biāo)和miR-124a、miR-449a等轉(zhuǎn)錄組學(xué)指標(biāo)[25]在NSCLC患者中的變化，因此早期NSCLC的準(zhǔn)確診斷尚存在一定的困難。隨著各類機(jī)器學(xué)習(xí)算法的發(fā)展，最佳指標(biāo)組合的概念日趨成熟[26]，通過算法將各類差異指標(biāo)進(jìn)行擬合，可得到由最佳指標(biāo)組合建立的診斷模型，納入的指標(biāo)類型越全面、維度越廣，模型的診斷效能越高。

綜上所述，血清氨基酸譜的變化與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。由Glu、Val、Cit和CYFRA 21-1組成的最佳指標(biāo)組合對早期NSCLC有較好的輔助診斷效能。但由于本研究樣本量較小，因此結(jié)論尚需大樣本、多中心研究加以驗證。