申 杰，李 剛，黃 濤，皮勁松，龔炎長(zhǎng)，潘愛鑾，吳 艷，張 昊，付 明，梁振華

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心/動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.湖北農(nóng)墾對(duì)外經(jīng)濟(jì)交流中心，武漢 430064；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

雞肝臟在能量代謝、消化和免疫方面發(fā)揮著多種作用，易受到氧化應(yīng)激，如急性熱應(yīng)激和空腹應(yīng)激［1-4］，直接影響其生產(chǎn)性能?？缰|(zhì)分子層膜蛋白（Tran membrane protein，TMEMs）代表一類橫跨脂質(zhì)雙分子層的膜蛋白［5］，可以在各種細(xì)胞膜上擴(kuò)散，包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和高爾基體膜，并控制特定物質(zhì)在生物膜上的運(yùn)輸。因此，TMEMs參與細(xì)胞的生理生化過程，對(duì)細(xì)胞功能的維持具有重要作用。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)TMEMs可作為癌癥生物標(biāo) 志 物（如TMEM45A、TMEM116、TMEM207和TMEM213）［6］，也可作為抑癌基因（如TMEM25和TMEM7）［7，8］，還可作為促癌基因（如TMEM158和TMEM14A）［9，10］。TMEMs在 腫瘤 研 究領(lǐng) 域 相對(duì) 較多，且具有重要功能。本研究利用前期雞肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［11］，挑選了8個(gè)TMEMs基因，檢測(cè)其在肝臟中的表達(dá)變化，預(yù)測(cè)及鑒定其上游轉(zhuǎn)錄因子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

將海蘭褐隨機(jī)分為限飼組（n=10）和自由采食組（n=10）。對(duì)于限飼組，每只雞每天投料量40～50 g，而對(duì)于自由采食組，料槽不斷料。飼養(yǎng)的肉仔雞和蛋仔雞在6周齡時(shí)處死，采集肝臟組織保存。

1.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol試 劑（Invitrogen公司，Carlsbad，CA）提取總RNA。通過ND-2000型分光光度計(jì)（Nano-Drop公司）和1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA濃度和純度。使用Prime Script RTReagent Kit（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）反轉(zhuǎn)錄，1μg總RNA與1.0μL gDNA Eraser和2μL 5×gDNA Eraser緩沖液混合，42℃孵育2 min，以消除基因組DNA。將1μL Prime Script RT酶混合物、4μL 5×Prime Script緩沖液、1μL RT引物混合物和4μL Raze-free水加到混合物中，37℃保溫15 min，85℃保溫5 s，然后4℃終止反應(yīng)。cDNA產(chǎn)物保存于-20℃。

1.3 RT-qPCR

在Bio-Rad CFX96系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）上使用SuperReal PreMix（SYBR Green）（天根生化科技（北京）有限公司）分析基因的表達(dá)水平，所設(shè)計(jì)引物見表1。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，以雞GAPDH基因?yàn)閰⒄眨褂?-ΔΔCT方法計(jì)算表達(dá)量。

表1 RT-qPCR檢測(cè)的引物序列

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)

雞胚原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［12，13］。孵育15 d的雞胚30個(gè)，取出肝臟并切碎，用1×PBS溶液洗滌，然后用膠原酶IV（BIOFROX公司）在37℃消化20 min。100目和500目篩過濾細(xì)胞，室溫下800 r/min離心5 min，每次過濾后用1×PBS溶液洗滌3次。在細(xì)胞中添加10%胎牛血清（FBS）（AusGeneX公司）和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL，細(xì)胞鋪板后，37℃下5%CO2培養(yǎng)。

DF1細(xì)胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)，在37℃下5%CO2孵育。

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

利用Q5高保真DNA聚合酶擴(kuò)增TMEM86A啟動(dòng)子區(qū)（NC_006092.4）不同長(zhǎng)度DNA片段（P1-P5），分別插入熒光素酶報(bào)告載體pGL3-BasicNheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將ARNT（NM_204200.1）、CREB1（NM_204450.2）和SP1（NM_204604.1）基因的編碼序列分別克隆到pcDNA3.1載體中，重組載體引物見表2。使用LipofectamineTM3000（Invitrogen公司）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。對(duì)于24孔板（2.5×105個(gè)/孔）培養(yǎng)的細(xì)胞，在LipofectamineTM3000中，加入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒500 ng、pcDNA3.1重組質(zhì)粒500 ng和pRLTK質(zhì)粒50 ng轉(zhuǎn)染細(xì)胞。處理48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光比值。所有結(jié)果均來(lái)自至少3次獨(dú)立試驗(yàn)。

表2 用于重組載體構(gòu)建的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 TMEMs基因在肝臟中的表達(dá)

選取8個(gè)TMEMs基因，分別檢測(cè)在蛋雞和肉雞肝臟中的表達(dá)水平。由圖1可知，TMEM45A、TMEM51、TMEM86A、TMEM97和TMEM154基因在肉雞中的表達(dá)量顯著（P＜0.05）高于蛋雞，表明2種類型雞的肝臟內(nèi)細(xì)胞代謝狀態(tài)存在差異。此外，為比較相同品種的不同采食方式對(duì)TMEMs基因的表達(dá)影響，設(shè)置了自由采食組和限飼組，檢測(cè)結(jié)果見圖2。與自由采食組相比，限飼組肝臟TMEM135、TMEM199和TMEM214表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。與自由采食組相比，限飼組只有TMEM86A基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），提示饑餓狀態(tài)可能是導(dǎo)致TMEM86A基因上調(diào)表達(dá)的原因。

圖1 TMEMs基因在蛋雞和肉雞肝臟中表達(dá)水平

圖2 TMEMs基因在自由采食組和限飼組肝臟中的表達(dá)水平

2.2 TMEM86A基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控區(qū)域的鑒定

將雞TMEM86A基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)作為+1，將其5′側(cè)啟動(dòng)子序列作為調(diào)控區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并截短為5個(gè)片段構(gòu)建pGL3重組載體。在雞胚肝臟細(xì)胞中，熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示pGL3-P5到pGL3-P3的熒光素酶活性相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)截短到pGL3-P2時(shí)，其熒光素酶活性明顯下降，表明-906 bp至-615 bp之間的序列中存在重要轉(zhuǎn)錄因子；當(dāng)再次截短后pGL3-P1的熒光素酶活性上升，表明在-615 bp至-296 bp之間的序列中存在抑制性的轉(zhuǎn)錄因子。推測(cè)TMEM86A基因的啟動(dòng)子受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控（圖3）。

圖3 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)TMEM86A基因啟動(dòng)子活性

2.3 靶向TMEM86A基因轉(zhuǎn)錄因子的篩選與驗(yàn)證

根據(jù)Jaspar和TRANSFAC軟件的結(jié)果，預(yù)測(cè)7個(gè)靶向TMEM86A啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子，分別為SP1、CREB1、E2H4、EGR1、ASCL1、HIF1A和ARNT。通過RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在自由采食組和限飼組之間的表達(dá)水平，表明SP1、CREB1和ARNT在兩組中表達(dá)存在差異（圖4）。限飼處理促進(jìn)了SP1和ARNT的表達(dá)，抑制了CREB1 mRNA的表達(dá)。在DF1細(xì)胞中利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)TMEM86A基因表達(dá)活性的影響，結(jié)合超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和共轉(zhuǎn)染pGL3-P5試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SP1顯著促進(jìn)pGL3-P5熒光素酶活性（圖5a），CREB1顯著促進(jìn)pGL3-P5的相對(duì)熒光素酶活性（圖5b），但ARNT對(duì)pGL3-P5熒光素酶活性變化不顯著（圖5c）。

圖4 預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在限飼組與自由采食組間的mRNA表達(dá)

圖5 超表達(dá)SP1、CREB1和ARNT檢測(cè)p GL3-P5片段的熒光活性

3 小結(jié)與討論

本研究從TMEMs基因在雞肝臟中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)限飼處理會(huì)促進(jìn)TMEM86A基因上調(diào)表達(dá)，提示該基因可能參與饑餓應(yīng)激。給小鼠喂食高脂肪食物可以降低脂肪組織溶酶漿原水平，并增加跨膜蛋白TMEM86A含量，當(dāng)TMEM86A基因被敲除以后，線粒體氧化代謝增強(qiáng)，能量消耗提高，表明其是參與能量代謝的重要基因［14］。蛋雞在日常生產(chǎn)過程中，經(jīng)常因?yàn)槲沽喜痪?、過少造成能量攝入不足，從而導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間停產(chǎn)或減產(chǎn)，因此探究TMEM86A基因的生物功能具有重要意義。

根據(jù)TMEM86A基因上游序列，使用Jaspar網(wǎng)站和TRANSFAC網(wǎng)站預(yù)測(cè)了7個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子，在自由采食組和限飼組中RT-qPCR結(jié)果顯示，ARNT、SP1和CREB1 3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子存在差異表達(dá)。CREB通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中的糖原和脂質(zhì)代謝，在脂肪組織和肝臟中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［15］。與生長(zhǎng)緩慢的雞相比，生長(zhǎng)迅速的雞肝臟中CREB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著（P＜0.05）升高［16］，高脂肪飼料喂養(yǎng)的雄性大鼠肝臟中CREB1表達(dá)上調(diào)［17］。限飼組肝臟中CREB1的表達(dá)下調(diào)，CREB1通過靶向TMEM86A基因的啟動(dòng)子，調(diào)控TMEM86AmRNA的表達(dá)水平。除了CREB1，發(fā)現(xiàn)SP1能影響TMEM86A的啟動(dòng)子活性，轉(zhuǎn)錄因子SP1在多種組織中廣泛表達(dá)，在細(xì)胞黏附、侵襲、遷移和血管生成中發(fā)揮重要作用［18］。本研究表明在肝臟細(xì)胞中SP1和CREB1通過靶向TMEM86A基因，共同參與雞肝臟的能量代謝過程。