陳 偉，劉曉艷，朱 鐳

（湖北省農業(yè)科學院湖北省生物農藥工程研究中心/國家生物農藥工程技術研究中心/湖北省農業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農藥分中心，武漢 430064）

硫元素循環(huán)是硫元素在地球生命系統(tǒng)與非生命系統(tǒng)間的動態(tài)轉換、遷移過程，是生物地球化學的基礎循環(huán)之一［1］。硫元素循環(huán)的初始驅動是硫酸鹽還原細菌（Sulfate-reducing bacteria，SRB）及古菌在厭氧環(huán)境下利用硫酸鹽代替氧氣作為電子傳遞受體，產生生命活動所需的能量以及硫化氫產物。在地球演化史中，該生命活動的出現(xiàn)更早于氧氣大爆發(fā)事件［2］。SRB廣泛存在于自然界中，尤其是在各類水體的底泥環(huán)境中扮演著推動硫還原的角色。因此，在農業(yè)水產養(yǎng)殖領域，SRB的豐度往往與養(yǎng)殖池塘水質、底泥的惡化相關。當環(huán)境中生物多樣性失去平衡時，隨SRB活躍度提升，其產生的硫化氫將加劇水體和底泥的惡化并造成大量的漁業(yè)經濟損失［3］。

SRB在底泥環(huán)境中的定殖、硫酸鹽還原代謝與其生物被膜形成直接相關［4，5］。細菌生物被膜廣泛存在于各種物質表面，是單個或復合微生物群體形成的聚集物，由細菌細胞分泌多糖、蛋白質、核酸等物質在胞外聚合并將細胞自身包裹其中而形成［6］。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，細菌生物被膜的形成與驅散主要受群體感應（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)以及一系列體內調控網絡控制［7］。QS系統(tǒng)通常指細菌在生長過程中釋放自體誘導物（Autoinducer，AI），并通過受體蛋白感受胞外AI分子濃度，調控體內特定基因表達進而調整自身狀態(tài)［8］。目前已知的自體誘導物主要包括高絲氨酸內酯（N-acyl-L-homoserine lactones，AHLs）、呋喃酮酰硼酸二酯（Furanosyl borate diester，AI-2）等［9］。AHLs信號分子的研究較為深入，其合成由luxI同源基因負責，感受信號并調控下游基因的受體為LuxR家族蛋白。LuxR家族蛋白一般由200～260個氨基酸構成，序列中包含氨基端的信號分子結合域（Autoinducer binding domains）和羧基端的DNA結合結構域（Helix-Turn-Helix）［10］。同時在一些細菌中也發(fā)現(xiàn)存在一類LuxR“solos”蛋白，該類蛋白沒有配套的信號分子合成基因，但與其他LuxR蛋白具有相同的保守結構域以及感受信號分子、調控基因的功能，在細菌間、宿主和細菌間的交流過程中也起到重要作用［11］。

SRB生物被膜在底泥環(huán)境變化［4］、水體重金屬微生物修復［12］以及微生物介導的金屬表面銹蝕［13］等領域均有重要研究價值，但其具體的調控機制尚不清楚。近年來通過基因組數據挖掘，在部分脫硫弧菌中預測出潛在的信號合成及受體蛋白基因同源物，如在D.hydrothermalis、D.salexigens和Desulfotaleapsychrophila中發(fā)現(xiàn)信號分子合成酶同源物編碼基因（luxS），但與大腸桿菌LuxS蛋白的序列一致性較低，為33%～34%［14］，這類基因的具體功能還有待進一步驗證。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)SRB模式菌株D.vulgarisHildenborough（DvH）［15］的生物被膜通過自身胞外糖基水解酶DisH控制［16］，隨后通過對DvH菌株生物被膜時期及浮游生活時期的轉錄組比較分析及試驗驗證，發(fā)現(xiàn)調控蛋白DVU2956負調控生物被膜形成及硫化氫產生［17］，并在上述轉錄組數據分析中發(fā)現(xiàn)類LuxR家族蛋白基因在生物被膜時期有上調。因此，本研究通過生物信息學分析方法對DvH菌株基因組中預測的3個類LuxR家族蛋白的理化性質、二級/三級結構、信號肽及跨膜結構、磷酸化位點、保守功能結構域和系統(tǒng)發(fā)育進行分析和預測，為后續(xù)研究SRB的QS系統(tǒng)及調控生物被膜形成等的分子機制奠定基礎，也為群體感應猝滅劑等SRB控制劑的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 基因序列材料

在KEGG基因數據庫中依據基因編號查找獲得 基 因citB1（dvu2577）、citB2（dvu2675）和citB3（dvua0137）的核苷酸及氨基酸編碼序列，以及分別在美國國家生物技術信息中心（NCBI）蛋白質序列數據庫中的注冊編號：AAS97049（CitB1）、AAS97147（CitB2）和AAS94474（CitB3）。通過文獻查閱以及利用Blastp程序在NCBI蛋白質數據庫進行序列比對（氨基酸一致性超過70%），選擇了17個來自不同種屬菌株的典型LuxR家族蛋白作為參考：脫硫弧菌屬Desulfovibriodesulfuricans（登錄號ACL48718）、Desulfovibrioalaskensis（登錄號MBL3582181.1）、Desulfovibriooxamicus（登錄號MBG3876225.1）、Desulfovibriosp.XJ01（登錄號NHZ46953.1）、Pseudodesulfovibriomercurii（登錄號EGB16317.1）和Solidesulfovibrio alcoholivorans（登錄號WP_029460621.1）；放線菌屬Streptomycescoelicolor（登錄號CAA69209.1）、Streptomycespeucetius（登 錄 號AAD15247.1）、Streptomyces pristinaespiralis（登 錄 號CBW45649.1）、Streptomyces virginiae（登錄號BAF50712.1）和Streptomycesvinaceus（登錄號AAP92509.1）；假單胞菌屬Pseudomonas aeruginosa（登錄號P25084.1）和Pseudomonasfluorescens（登錄號EJZ57917.1）；大腸桿菌Escherichiacoli（登錄號P07026.2）以及麥氏交替單胞菌Alteromonasmacleodii（登錄號VTO40702.1）、哈維氏弧菌Vibrioharveyi（登錄號AAN86705.2）和根瘤菌Sinorhizobiummeliloti（登錄號AFP89744.1）。

1.2 數據分析方法

利 用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線工具分析蛋白質CitB1、CitB2和CitB3的理化性質和親疏水性［18］。利用NetSurfPv.3.0［19］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetSurfP-3.0）和SWISS-MODEL［20］（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測CitB1、CitB2和CitB3蛋白的二、三級結構。利用SignalP 6.0［21］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-6.0）和TMHMM-2.0［22］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）分析CitB1、CitB2和CitB3蛋白的信號肽跨膜區(qū)和可能的跨膜結構。利用NetPhosBac 1.0 server［23］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhosBac-1.0）分析蛋白質磷酸化位點。殘基得分介于0～1，當得分高于0.5時，殘基被預測為磷酸化位點。利用在線工具Clustal Omega［24］（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進 行CitB1、CitB2和CitB3蛋白的氨基酸序列同源性比對分析。結合上述其他同源蛋白，利用Trimal v.1.2［25］（http：//phylemon2.bioinfo.cipf.es/）對齊序列后，使用Mega-X［26］軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結果與分析

2.1 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的氨基酸預測及理化性質分析

利用ProtParam工具分析citB1、citB2和citB3基因編碼蛋白質的基本性質，結果表明，CitB1基因包含一個全長651 bp的完整閱讀框，編碼216個氨基酸，分子式為C1054H1758N296O315S6，分子質量為23 809.71 u，理論等電點為6.40，為弱酸性蛋白，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為33，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為31，不穩(wěn)定指數（Instability index II）為35.95，歸類為穩(wěn)定蛋白。CitB1蛋白中氨基酸含量最高的為亮氨酸（Leu），占比13.0%，其次為丙氨酸（Ala），占比10.6%（圖1）。

CitB2基因全長684 bp，編碼227個氨基酸，分子式為C1071H1754N326O310S9，分子質量為24 446.25 u，理論等電點為7.01，為中性蛋白，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為31，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為31，不穩(wěn)定指數（Instability index II）為36.42，歸類為穩(wěn)定蛋白。CitB2蛋白中氨基酸含量最高的為亮氨酸（Leu），占比14.1%，其次為丙氨酸（Ala），占比為11.5%（圖1）。

CitB3基因全長648 bp，編碼215個氨基酸，分子式為C1015H1642N294O317S7，分子質量為23 260.40 u，理論等電點為4.97，為弱酸性蛋白，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為32，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為23，不穩(wěn)定指數（Instability index II）為29.14，歸類為穩(wěn)定蛋白。CitB3蛋白中氨基酸含量最高的為亮氨酸（Leu），占比14.9%，其次為丙氨酸（Ala），占比10.7%（圖1）。

圖1 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的氨基酸組成

根據ProtScale工具分析citB1、citB2和citB3基因編碼蛋白質的親疏水性，結果表明，CitB1蛋白最小值為-2.789，最大值為1.967；CitB2蛋白最小值為-2.433，最大值為2.100；CitB3蛋白最小值為-1.900，最大值為2.033；均為親水蛋白（圖2）。

圖2 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的親水/疏水分析

2.2 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的二級結構和三級結構分析

利用NetSurfP 3.0分別預測了基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的二級結構。CitB1蛋白中51.85%的氨基酸形成α螺旋，20.37%為無規(guī)則卷曲，5.09%為β片層；CitB2蛋白中47.13%為α螺旋，26.87%為無規(guī)則卷曲，4.41%為β片層；CitB3蛋白中46.51%為α螺旋，26.98%為無規(guī)則卷曲，6.05%為β片層（圖3）。

圖3 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的二級結構預測

利用SWISS-MODEL分別預測了基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的三級結構。CitB1蛋白三維建模最高全局模型質量估計值（GMQE）為0.72，表明結構預測較為可靠（＞0.7）。參考蛋白為調控蛋白VarR（SWISS-MODEL數據庫編號5hev.1.A），兩者氨基酸序列一致性為30.00%。CitB2蛋白三維建模最高GMQE值為0.67，表明結構預測可靠性較低。參考蛋白為雙組份轉錄調控蛋白DevR（SWISSMODEL數據庫編號3c3w.1.A），兩者氨基酸序列一致性為29.67%。CitB3蛋白三維建模最高GMQE值為0.64，表明結構預測可靠性較低。參考蛋白同樣為雙組份轉錄調控蛋白DevR，兩者氨基酸序列一致性為30.85%。如圖4所示，3個蛋白主要結構為α螺旋，與二級結構預測結果一致。

圖4 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的三級結構預測

2.3 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的信號肽跨膜區(qū)及跨膜結構預測分析

利用SignalP-6.0和TMHMM工具分別進行基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的信號肽跨膜區(qū)及跨膜結構分析，結果表明，3個蛋白均不具有信號肽以及跨膜結構（圖5和圖6）。

圖5 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的信號肽跨膜區(qū)分析

圖6 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的跨膜結構域分析

2.4 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質磷酸化位點分析

由圖7可見，CitB1蛋白磷酸化位點有3個，其中，絲氨酸磷酸化位點2個，包括第35位氨基酸（得分：0.506）和第89位氨基酸（得分：0.650）；蘇氨酸磷酸化位點為第213位氨基酸（得分：0.604）。CitB2蛋白磷酸化位點有6個，其中，絲氨酸磷酸化位點5個，包括第31位氨基酸（得分：0.763）、第38位氨基酸（得分：0.570）、第119位氨基酸（得分：0.552）、第130位氨基酸（得分：0.514）和第202位氨基酸（得分：0.698）；蘇氨酸磷酸化位點為第150位氨基酸（得分：0.533）。CitB3蛋白磷酸化位點有8個，其中，絲氨酸磷酸化位點7個，包括第117位氨基酸（得分：0.722）、第134位氨基酸（得分：0.669）、第140位氨基酸（得分：0.522）、第157位氨基酸（得分：0.587）、第165位氨基酸（得分：0.634）、第172位氨基酸（得分：0.512）和第201位氨基酸（得分：0.660）；蘇氨酸磷酸化位點為第205位氨基酸（得分：0.541）。

圖7 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的磷酸化位點分析

2.5 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質保守結構域及同源性比對分析

依據KEGG數據庫中對CitB1、CitB2和CitB3蛋白保守結構域的分析發(fā)現(xiàn)，3個蛋白均包含2個保守結構域：響應調控子信號接收結構域（Response regulator receiver domain）和LuxR家族DNA結合調控結構域（Bacterial regulatory proteins，LuxR family）。其中，信號接收結構域分別在CitB1、CitB2和CitB3蛋白的5～116位、7～117位、16～123位；DNA結合調控結構域分別在3個蛋白的152～207位、155～207位和156～204位（圖8）。上述結果表明，CitB1、CitB2和CitB3均為潛在的雙組份系統(tǒng)應答調控蛋白。通常雙組份調控系統(tǒng)的調控蛋白基因上下游存在對應的組氨酸蛋白激酶基因，但本研究中3種蛋白基因上下游均沒有發(fā)現(xiàn)該類功能基因，因此它們可能是一種“solos”型的應答調控蛋白。

通過氨基酸序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，CitB1、CitB2和CitB3蛋白之間氨基酸一致性分別為37.79%（CitB1和CitB2）、28.99%（CitB1和CitB3）、31.48%（CitB2和CitB3）。氨基端的信號接收結構域變異性較大，保守或類似氨基酸殘基占比43.75%（49/112），而在羧基端的DNA結合調控結構域較保守，保守或類似氨基酸殘基占比60.71%（34/56）（圖8）。非典型應答調控蛋白的信號傳導往往與不同的小分子信號有關，氨基端的變異性較大可能與接收不同信號分子有關。

圖8 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的聚類分析

2.6 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

為了分析CitB1、CitB2和CitB3蛋白與其他物種中同源蛋白的親緣關系，本研究選擇來自不同種屬菌株的典型LuxR家族蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹以最大似然法（Maximum likelihood）構建，檢驗方法為步長檢驗方法（Bootstrap method），檢驗次數1 000次。分析發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌、假單胞菌等來源的LuxR家族蛋白較為保守、親緣關系較近不同，SRB來源的蛋白與其他細菌、放線菌親緣關系較遠，這可能與其不同的氨基端保守結構域有關。CitB1蛋白與其他脫硫弧菌親緣關系最近，CitB3蛋白介于脫硫弧菌與類似菌（如Solidesulfovibrio）之間，CitB2蛋白則相對于其他脫硫弧菌同族蛋白親緣關系較遠（圖9）。該結果暗示在模式菌株DvH中，CitB1和CitB3蛋白發(fā)揮的信號接收方式、下游基因調控功能在SRB群體中具有普遍性，CitB2蛋白的信號接收方式及基因調控可能具有特異性。

圖9 基因citB1、citB2和citB3編碼蛋白質的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 小結與討論

由于SRB在硫元素循環(huán)中的重要作用，以及在人類社會活動中的重大影響，該類細菌的QS系統(tǒng)一直是厭氧細菌基礎研究和應用領域的熱門話題。本研究利用生物信息學分析方法，對SRB模式菌株DvH基因組中的3個類LuxR家族調控蛋白進行了功能、結構的預測和分析，發(fā)現(xiàn)盡管羧基端含有保守的DNA結合結構域，但CitB1、CitB2和CitB3蛋白氨基端的信號接收保守結構域與保守的LuxR家族調控蛋白的自體誘導物結合結構域顯著不同，暗示它們接受的信號分子可能不是已知的AHLs等自體誘導物信號分子。

參考革蘭氏陰性細菌QS系統(tǒng)的AHL信號作用模式，前人通過構建同為革蘭氏陰性菌的脫硫弧菌菌株H2.3jLac的基因組fosmid文庫，在體外鑒定出其可能產生包括C6-AHL、oxo-C6-AHL、C8-AHL、C10-AHL和C12-AHL等AHL信號分子，但合成酶基因以及受體蛋白仍不清楚［27］。另有研究通過體外添加C8-AHL、C10-AHL和C12-AHL等信號分子及相關抑制劑處理，發(fā)現(xiàn)AHLs對DvH菌株細胞生長的影響主要體現(xiàn)于ATP的活躍程度，進一步轉錄組學分析沒有發(fā)現(xiàn)可能的QS調控系統(tǒng)［13］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，DvH菌株的一個2-異丙基蘋果酸合酶基因在體外融合QS信號激活型綠色熒光蛋白共表達時能激活熒光，因此推斷該合成酶產物可與LuxR類QS信號感應受體結合［28］。盡管該酶合成的產物未知，結合本研究結果，該基因產物可能為上述3個類LuxR家族調控蛋白CitB1、CitB2和CitB3接收的上游信號分子之一，暗示SRB可能具有獨特的QS信號分子通訊系統(tǒng)。這可能與SRB處于嚴格厭氧的自然環(huán)境，以硫元素代替氧元素進行生命活動有關。

在應用控制方面，目前多使用廣譜抗生素、殺菌劑，并聯(lián)合投加硝酸鹽及氧化劑等手段減緩SRB生物被膜及硫化氫等產物對地下金屬輸水、輸油管道的銹蝕［29］、油藏的酸化［30］，以及去除引發(fā)河道底泥黑臭的硫化氫來源［31］。同時由于硫化氫能與重金屬離子形成沉淀，SRB的人工利用也是重金屬廢水生物修復技術的熱點研究話題［32］。大量抗生素、殺菌劑的使用往往伴隨巨大的環(huán)境風險，因此研發(fā)綠色環(huán)保的SRB控制技術具有廣闊的應用前景。對SRB的QS系統(tǒng)的深入研究，尤其是對其胞外通訊信號分子以及受體調控蛋白的作用機制研究將有利于特異性的控制劑創(chuàng)制及相關技術的研發(fā)。