張明迪， 白九元， 王 鑫， 羅 梅， 趙 云， 張年輝

(四川大學生命科學學院生物資源與環(huán)境教育部重點實驗室， 成都 610065)

1 引 言

植物營固著生長，當外界環(huán)境中出現(xiàn)不利因素時無法通過逃逸趨利避害，而各種生物和非生物脅迫都會對植物的正常生長造成傷害.其中干旱脅迫是制約植物生長最嚴重的脅迫之一，對植物可造成多方面的傷害，包括種子萌發(fā)和早期營養(yǎng)生長、氣孔開度和光合作用、水分關系、種子品質和植株產量等[1].受水資源短缺和氣候變化的影響，預計干旱在全球范圍內發(fā)生的頻率和范圍還會有進一步增加和擴大的趨勢.據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國西北地區(qū)的農業(yè)干旱災害面積由20世紀50年代的64.1萬公頃增加到21世紀的330.2萬公頃[1](1萬公頃=100 km2)，這嚴重威脅農業(yè)生產和糧食安全.目前也有一些技術和方法用以預防或者緩解干旱：(1) 在農業(yè)生產上倡導節(jié)水農業(yè).如采用滴灌、“赤字”灌溉等代替?zhèn)鹘y(tǒng)的漫灌以優(yōu)化灌溉方式提高水資源利用效率；如通過監(jiān)測植物的表型、光合速率、蒸騰速率和水分利用效率等判斷植物體內水分狀態(tài)為確定植物供水時間提供精準有效的參考等.(2) 通過選育耐旱抗旱品種以從根本上改善植物在干旱環(huán)境中的適應性.如利用雜種優(yōu)勢將具有目標性狀的遺傳群體持續(xù)進行雜交組合直至選育出目標品種的傳統(tǒng)育種策略；或基于轉基因技術將在干旱中起正調控作用的基因過表達或者敲除沉默起負調控作用的基因從而獲得耐旱抗旱新品種的現(xiàn)代育種策略[2-4].但無論是節(jié)水農業(yè)的推進還是新品種的選育，盡管已經并且還將不斷取得進展和突破，然而當真正應用于生產實踐時仍存在著投資成本過高，研究成果難以轉化為實際成果和效益等弊端，干旱脅迫依舊是農業(yè)生產中要面臨的嚴峻挑戰(zhàn).

化感作用是自然界中廣泛存在的一種生物化學調控機制，是一個生物體自身產生的化合物(化感物質)對另一生物體產生的積極或者消極影響[5].植物化感作用常被用于農田雜草的防治.高粱被認為是具有強烈化感作用的植物之一，其水浸提物對于抑制農田雜草的生長十分有效[6].化感作用也可應用于防治植物病蟲害[7].近年來，一些研究者還評估了化感作用在促進植物生長、提高作物抗非生物脅迫方面的潛力[8].例如Munir[9]把5%～10%的高粱浸提物作為外源物質施加到小麥植株上顯著改善了小麥在熱脅迫下的適應性.基于化感物質大多源于植物產生的次級代謝產物，通常價格低廉且簡單易得，相較于推進節(jié)水農業(yè)和選育耐旱抗旱新品種，利用化感作用提高植物的抗旱性具有投資少見效快的特點，同時相對簡單的噴灑處理方式在應用時具有更強的實用性和可操作性.

檸檬醛(3,7-二甲基-2,6-辛二烯，C10H16O)是一種無環(huán)開鏈單萜稀醛類天然活性物質，分子量為152.23，廣泛存在于多種植物中，尤其是具有揮發(fā)性香味的芳香植物，如檸檬草、樟樹和山蒼子等[10].檸檬醛的化感作用已經有過一些研究：如Graa等[11]的研究發(fā)現(xiàn)檸檬醛對農作物和雜草具有毒害效應，并且對雜草的抑制效果遠高于農作物；檸檬醛可以改變擬南芥根和芽中生長素與乙烯的含量以抑制根的生長[12]；檸檬醛會對擬南芥開花和種子形成產生一定的傷害[13].另外，Chaimovitsh等[14]發(fā)現(xiàn)檸檬醛處理可導致小麥根細胞中新形成的細胞壁畸形，同時也影響細胞分裂時期微管的正常形態(tài).但這些研究考察的基本都是較高濃度的檸檬醛(通常≥1000 μmol/L)對受體植物的抑制作用，還沒有涉及到檸檬醛對植物生長及代謝的促進作用.

本研究以較低濃度的檸檬醛處理擬南芥，以探討檸檬醛在誘導植物抗旱性方面的潛力.通過轉錄組測序(RNA-seq)分析檸檬醛處理后誘導的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，并對DEGs進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，分析檸檬醛誘導植物抗旱性增強的可能分子機制，從而為將檸檬醛應用于提高植物的抗旱性打下一定的基礎.

2 材料與方法

2.1 材 料

實驗所用材料為哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)，由本實驗室提供.

檸檬醛(CAS：5392-40-5)購自Sigma公司，反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑購自TaKaRa公司，實驗中所用的其它試劑均為分析純.

2.2 方 法

2.2.1 檸檬醛的施加和干旱脅迫的處理 擬南芥種子經75%乙醇、1%次氯酸鈉消毒后播種在MS培養(yǎng)基上，于4 ℃冰箱春化3 d后放入光照培養(yǎng)箱中生長.生長條件為：溫度22 ℃，相對濕度55%，光照強度120 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h光照8 h黑暗.培養(yǎng)1 w后選取生長一致的幼苗移栽到土壤中.擬南芥幼苗在土壤中生長兩周后，分別將200 μmol/L，400 μmol/L，600 μmol/L和800 μmol/L檸檬醛(配制不同工作濃度檸檬醛所用溶劑為0.1%乙醇)噴灑在擬南芥葉片表面，同時以噴灑水和0.1%乙醇作為實驗的對照組.噴灑時間為每天上午九點，連續(xù)噴灑2 d，噴灑程度以擬南芥葉片上出現(xiàn)水珠且水珠不滴落為宜.噴灑過后用保鮮膜覆蓋以防止檸檬醛揮發(fā)，3 d后揭開保鮮膜并停止?jié)菜_始干旱脅迫處理，期間觀察各處理組擬南芥的生長情況并拍照記錄.干旱2 w后進行復水，3 d后統(tǒng)計各處理組中擬南芥的存活率.

2.2.2 取樣及樣品RNA的提取 葉面噴灑處理結束后，揭開覆膜的同時取0.1%乙醇對照組(CK)和200 μmol/L檸檬醛處理組(Citral)中的擬南芥葉片.CK和Citral分別取3個重復，各組的3個重復混樣后參照本實驗室先前建立的方法進行RNA的提取[15].

2.2.3 測序文庫的構建與測序 提取的RNA經去核糖體RNA處理后，通過六堿基隨機引物合成cDNA第一條鏈，dUTP代替dTTP合成cDNA第二條鏈的方法進行cDNA測序文庫的構建.構建的文庫質檢合格后經Illumina平臺測序.文庫構建和測序工作委托上海生工生物工程有限公司進行.

2.2.4 測序數(shù)據(jù)的質控及評估 測得的原始數(shù)據(jù)(raw reads)有各種雜質和非目的序列的污染.利用FastQC 0.11.2軟件評估原始測序數(shù)據(jù)的質量，同時通過Trimmomatic 0.36軟件對測序接頭、含有不確定堿基(N)的序列以及低質量序列(堿基質量值Q30低于95%)進行過濾后得到有效的可用數(shù)據(jù)(clean reads).

2.2.5 DEGs的篩選 利用String Tie 1.3.3b軟件計算各樣品的轉錄本豐度，統(tǒng)計各自的表達量.利用R Package中的DEGseq 1.26.0篩選DEGs，差異條件的設定閾值為：差異顯著性檢驗值qValue < 0.05，差異倍數(shù)|log2FoldChange| > 2.

2.2.6 DEGs的分析 利用R Package中的topGO 2.24.0進行GO分析，了解差異表達基因可能具有的生物學功能；利用R Package中的Cluster Profiler 3.0.5進行KEGG富集，分析差異表達基因涉及的代謝通路和調控途徑.

2.2.7 DEGs的RT-qPCR驗證 從檸檬醛處理后表達量出現(xiàn)顯著上調的DEGs中篩選4個與熱激蛋白家族基因(heat shock proteins，HSPs)相關的基因進行RT-qPCR驗證，即：AT1G07400，AT2G26150，AT4G25200，AT4G12400.根據(jù)基因序列設計引物，引物序列委托上海生工生物工程有限公司合成(見表1).利用反轉錄試劑盒對RNA進行反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板，以擬南芥中的β-Actin基因作為內參進行RT-qPCR.反應體系為25 μL：12.5 μL TB GreenPremixExTaqⅡ，1 μL引物-F，1 μL引物-R，2 μL cDNA模板，8.5 μL 無菌水.反應程序為：95 ℃，30 s預變性，95 ℃，10 s變性，58.5 ℃，30 s退火，72 ℃，10 s延伸，循環(huán)39次.采用2-ΔΔCt的方法計算差異基因的相對表達量，每個基因包含3次生物學重復和3次技術重復.通過t檢驗分析差異顯著性，利用GraphPad Prism 8.0繪制結果展示圖.

表1 RT-qPCR引物序列信息Tab.1 The information about primer sequence of RT-qPCR

3 結果與分析

3.1 檸檬醛對擬南芥抗旱性的誘導

為了探討不同濃度檸檬醛處理對擬南芥抗旱性能的影響，擬南芥幼苗經葉面噴施不同濃度檸檬醛后進行兩周干旱處理，隨后再復水3 d.圖1表型觀察顯示出，干旱脅迫處理過程中，噴灑水和0.1%乙醇的對照組中擬南芥葉片萎蔫、植株皺縮和死亡較快.噴灑檸檬醛的處理組則出現(xiàn)兩種截然不同的趨勢：400 μmol/L以下低濃度檸檬醛處理后的擬南芥在干旱中的生長狀況更好，與其他組相比葉片仍能保持嫩綠和堅挺，植株也沒有呈現(xiàn)出即死表型；而600 μmol/L和800 μmol/L高濃度檸檬醛處理后，隨著干旱脅迫的進行，植株過早地出現(xiàn)了干枯和死亡.干旱結束復水后統(tǒng)計不同處理組中擬南芥的存活率，發(fā)現(xiàn)各組之間具有顯著差異.如圖2所示，兩個對照組的存活率大約為40%，低濃度檸檬醛處理后顯著提高了擬南芥在干旱脅迫條件下的存活率，尤其在200 μmol/L處理下，存活率接近80%.但是高濃度檸檬醛處理后的擬南芥在干旱條件下的存活率極低，600 μmol/L下的存活率僅有10%～20%，800 μmol/L處理中的擬南芥在面臨干旱時幾乎無一存活.由此可見，200 μmol/L的檸檬醛可以誘導擬南芥產生抗旱性.

圖1 不同處理后擬南芥在不同時期的生長狀態(tài)情況(a)各階段總體表型； (b)干旱14 d單個典型植株的表型Fig.1 The status of Arabidopsis thaliana in different stages induced by different treatments(a) The overall phenotype at each stage； (b) the representative phenotype of a signal plant after drought 14 d

3.2 用于轉錄組測序文庫構建的RNA質量分析

為了揭示檸檬醛處理增強擬南芥幼苗抗旱性的分子機制，我們通過RNA-seq分析了經200 μmol/L檸檬醛處理與未經處理擬南芥幼苗之間的DEGs，以及受到影響的生理過程與代謝通路.為了構建轉錄組分析的測序文庫，我們提取了0.1%乙醇對照組和200 μmol/L檸檬醛處理組中擬南芥葉片總RNA，并利用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測了RNA質量.所得結果表明(圖3)，CK組和Citral組的RNA在5S、18S和25S處有明顯單一的吸收峰，峰值較高并且沒有雜峰，25S條帶的亮度大約是18S的兩倍，提取的RNA具有很好的完整性.表2數(shù)據(jù)顯示提取的RNA濃度均在1000 ng/μL以上，rRNA量的比值25S/18S都大于2，RNA完整性檢驗值RIN全部在8.5以上，說明提取的RNA質量良好，滿足后續(xù)建庫要求.

表2 葉面噴施0.1%乙醇(CK)和噴施200 μmol/L檸檬醛(Citral)的擬南芥葉片RNA質量信息Tab.2 RNA information of Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol (CK) and 200 μmol/L citral (Citral)

圖3 葉面噴施0.1%乙醇(a)和噴施200 μmol/L檸檬醛(b)的擬南芥葉片RNA提取檢測結果Fig.3 RNA test results of Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol (a) and 200 μmol/L citral (b)

Different letters represent the significant difference ofArabidopsisthalianasurvival rate in different treatments (P<0.05)

3.3 測序數(shù)據(jù)的質控評估

對原始測序數(shù)據(jù)的評估和質控統(tǒng)計匯總結果見表3.CK和Citral的數(shù)據(jù)總量相對比較均衡，數(shù)據(jù)過濾比相差無幾，測序數(shù)據(jù)可信度較高.Q30可以作為評估堿基測序質量的優(yōu)秀線，結果顯示所有樣本的Q30值均在95%以上，測序質量良好.同時測序數(shù)據(jù)與擬南芥參考基因組的比對率在95%以上，數(shù)據(jù)符合模式物種的比對率(一般在90%左右，不低于80%).從數(shù)據(jù)的質控結果和評估分析可以判斷出所測數(shù)據(jù)真實有效、可信可用，完全可以用于后續(xù)轉錄組分析.

表3 擬南芥葉面噴施0.1%乙醇對照組(CK)和200 μmol/L檸檬醛處理組(Citral)的測序數(shù)據(jù)質控信息Tab.3 Quality control information about sequencing data of the CK and Citral with Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol and 200 μmol/L citral, respectively

3.4 檸檬醛處理后的DEGs分析

通過計算不同處理樣本的基因表達水平和設定差異條件進行篩選后，得到了檸檬醛處理組和對照組之間的DEGs，結果見圖4可視化散點圖.圖中黑點代表基因表達水平在兩組中沒有差異，紅點表示檸檬醛處理組相較于對照組表達水平上調的基因，綠點代表檸檬醛處理組中下調表達的基因.圖4直觀地反映出與在擬南芥葉片上噴灑0.1%乙醇的對照組相比，處理組中噴灑200 μmol/L檸檬醛后共出現(xiàn)230個DEGs，其中129個上調表達，101個下調表達.

圖4 擬南芥葉面噴施0.1%乙醇對照組(CK)和200 μmol/L檸檬醛處理組(Citral)間的差異表達基因Fig.4 Differentially expressed genes between the CK and Citral with Arabidopsis thaliana leaves sprayed by 0.1% ethanol and 200 μmol/L citral, respectively

3.5 DEGs的GO和KEGG分析

GO功能注釋主要提供有關于生物進程(biological process)、細胞組分(cellular component)以及分子功能(molecular function)三方面的信息.圖5對DEGs的GO分類結果顯示，DEGs在生物進程中主要富集到的條目是：應激反應、多組織進程、生物調控、免疫系統(tǒng)進程、細胞進程等.在細胞組分中富集到的主要為：細胞及細胞組件、其它組織及其組件、細胞器、細胞膜、核苷等.主要富集的分子功能有：結合、蛋白標簽、抗氧化活性、催化活性、酶調節(jié)活性等.

同時，KEGG分析有助于全面了解DEGs所涉及的代謝途徑，對DEGs進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集在52條代謝通路上.按富集因子及顯著性排序，前10條依次為：內質網中的蛋白質加工、抗原處理和遞呈、雌激素信號通路、多物種長壽調節(jié)途徑、植物與病原體互作、MAPK信號通路、NOD-like受體信號通路、胞吞作用、精氨酸和脯氨酸代謝、氮代謝.

3.6 DEGs的RT-qPCR驗證

檸檬醛處理后表達量出現(xiàn)顯著上調的基因許多都與HSPs相關，從中篩選出差異表達倍數(shù)較高的4個基因，即AT1G07400，AT2G26150，AT4G25200，AT4G12400，進行RT-qPCR驗證.圖7結果表明，4個基因在RT-qPCR中的表達水平變化趨勢和轉錄組中分析出的變化情況一致.因此本研究中的測序和差異基因表達分析結果具有良好的可信度和可靠性.

圖7 轉錄組數(shù)據(jù)中差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證(a)轉錄組數(shù)據(jù)分析的差異表達基因相對表達量(以未經檸檬醛處理的對照組CK中基因表達量為1); (b)熒光定量PCR驗證的檸檬醛處理組Citral和對照組CK中差異表達基因相對表達量(以β-Actin的表達量為1)*代表相較于對照組CK的差異顯著水平(*P<0.05，**P<0.01)Fig.7 RT-qPCR verification of DEGs in RNA-seq(a) The relative expression of DEGs analyzed by RNA-seq (take the gene expression level of CK as 1); (b) the relative expression of DEGs in Citral and CK verified by RT-qPCR (take the expression level of β-Actin as 1)The asterisk represents the significant level of difference compared to the CK (*P<0.05, **P<0.01)

4 討 論

Graňa等[13]證明檸檬醛會破壞擬南芥的水分狀態(tài)，檸檬醛處理的擬南芥生長緩慢，適應性變差，種子存活數(shù)量減少，生殖和繁殖也受到了嚴重的抑制，對擬南芥來說是一種有害的刺激物.但需要指出的是Graňa等使用的檸檬醛工作濃度一般都比較高(≥1000 μmol/L)，并且通常采用每天對植物進行葉面噴灑或者每兩天進行一次根部澆灌的連續(xù)處理方式[11-13].本研究通過改變檸檬醛的工作濃度和作用方式以考察檸檬醛是否可以作為誘導物增強擬南芥的抗旱性，并借助轉錄組測序技術深入探討檸檬醛誘導抗旱性的分子機理.

為避免檸檬醛的持續(xù)作用給植物帶來的強烈傷害，本研究處理材料的方式為：將檸檬醛噴灑在擬南芥葉片表面且3 d的處理過程只噴灑兩次.同時，我們還降低了檸檬醛的工作濃度.我們通過設置200 μmol/L，400 μmol/L，600 μmol/L，800 μmol/L四個濃度梯度的檸檬醛工作濃度處理擬南芥幼苗，以尋找檸檬醛誘導擬南芥產生抗旱性的適宜濃度.實驗結果表明，與對照組和較高濃度檸檬醛處理組相比，200 μmol/L低濃度檸檬醛可以誘導擬南芥抗旱性的產生，其處理后明顯改善了擬南芥在干旱環(huán)境中的適應性，最后的存活率高達80%，而未經檸檬醛處理的對照組只有40%左右的存活率(圖2).

大量的研究表明，當植物被病原菌感染，或者根部定植有益微生物，或者經一些天然或人工化合物誘導后，會表現(xiàn)出對隨后的病菌感染、昆蟲咬食、非生物脅迫等更快更強的適應性和抵抗力，這一過程稱為引發(fā)效應(priming)[16].本研究用200 μmol/L檸檬醛處理擬南芥后，使得擬南芥對后續(xù)干旱脅迫的耐受性增強(圖1).因此，從現(xiàn)象上分析，檸檬醛也可以作為一種引發(fā)效應的誘導物，其處理后誘導了擬南芥的引發(fā)效應，從而使擬南芥在后續(xù)的干旱脅迫中表現(xiàn)出了更強的適應性和更好的抵抗能力.

為深入了解檸檬醛處理后基因表達水平的變化，尤其是防御相關基因的表達變化，我們通過RNA-seq分析了經200 μmol/L檸檬醛處理后的DEGs.結果發(fā)現(xiàn)經檸檬醛處理后共有230個DEGs，其中129個上調表達的基因中有許多都是和HSPs相關的基因：如HSP20-like伴侶蛋白編碼基因AT1G07400，熱激蛋白轉錄因子A2(HSFA2)編碼基因AT2G26150，定位于線粒體的小熱激蛋白AT4G25200，還有和HSP90/HSP70共同作為伴侶蛋白發(fā)揮作用的AT4G12400等.隨后設計引物通過RT-qPCR也證實這些基因的確會在檸檬醛處理后出現(xiàn)顯著上調(圖7).HSPs是具有保護作用的應激蛋白，在蛋白質的折疊以及調節(jié)細胞免疫等方面發(fā)揮著重要作用，其存在于所有的植物物種中，因與植物的脅迫有關也被稱為脅迫防御蛋白[17].HSPs通常作為分子伴侶發(fā)揮作用以維持蛋白質的穩(wěn)態(tài).在逆境條件下一些功能蛋白變得不穩(wěn)定會出現(xiàn)部分解折疊，此時HSPs被激活后以一種不消耗能量的方式和部分解折疊的蛋白質結合以防止蛋白質出現(xiàn)不可逆聚集，保護蛋白質使其保持可被正確折疊的狀態(tài).而后，與HSPs結合的功能蛋白通過依賴ATP的方式重新折疊為天然活性構象，進而恢復其正常的生理活性[18].DEGs的GO注釋中富集到最多的功能條目是應激反應(圖5)，KEGG通路富集結果表明DEGs顯著富集在內質網中的蛋白質加工處理(圖6)，這和HSPs參與植物的應激防御以及在檸檬醛處理后表達量升高是一致的[19].

圖6 差異表達基因的KEGG通路富集Fig.6 KEGG pathway enrichment of differentially expressed genes

已有研究表明，HSPs在植物的干旱脅迫中發(fā)揮著重要的功能.例如Kim等[20]發(fā)現(xiàn)過表達AtHSP17.8(AT1G07400)可以增強擬南芥和生菜對脫水的抵抗力；Sun等[21]證實AtHSP17.6A(AT5G12030)的過表達能夠提高擬南芥的耐旱性；Li等[22]發(fā)現(xiàn)Hsp17.6CII(AT5G12020)可以增加過氧化氫酶的活性.過氧化氫酶是一種重要的抗氧化酶，可以清除逆境條件下植物體內產生的活性氧，其活性可作為衡量抗旱能力的指標之一，一般情況下其活性越高，抗旱性越強[22].檸檬醛誘導擬南芥抗旱過程中HSPs相關基因出現(xiàn)大量上調表達，但同時發(fā)現(xiàn)一些具有抗旱作用的功能蛋白編碼基因如抗氧化酶系中的超氧化物歧化酶SOD(AT1G08830)、過氧化物酶POD(AT1G05240)、過氧化氫酶CAT(AT1G19570)等基因的表達量未發(fā)生明顯的變化(數(shù)據(jù)未列).表明檸檬醛的處理并未直接活化抗氧化防御基因的表達，而是在引發(fā)效應的啟動階段通過某種途徑激活了熱激轉錄因子(如HSFA2等)的活性，進而活化HSPs的表達，使得植株處于對后續(xù)干旱脅迫更為敏感的狀態(tài).從而在后續(xù)的干旱脅迫下，通過HSPs的分子伴侶功能使逆境下部分解折疊的抗旱功能蛋白保持生理活性的穩(wěn)態(tài)，顯示出對干旱脅迫更好的適應性和抵抗力[17, 18].

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)檸檬醛在誘導擬南芥抗旱方面的潛力，并通過差異基因分析探討了檸檬醛提高擬南芥抗旱性的可能分子機制.研究結果為進一步挖掘檸檬醛在農業(yè)生產中的潛在應用價值，尤其是開發(fā)植物生長促進劑和植物抗旱保護劑提供了參考，也為提高植物的抗旱性提供了新的思路和方向.