滕俞希, 王晶金, 陳逸菲, 彭 婕, 范維強, 唐 琳
(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 成都 610065;2.阿壩藏族羌族自治州食品藥品檢驗所, 阿壩 624000)
藥材川貝母是百合科多種植物包括川貝母(Fritillariacirrhosa)、暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)和其變種瓦布貝母(FritillariaunibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis)等的干燥鱗莖[1].川貝母的活性成分主要有西貝母堿、貝母辛等多種甾體生物堿,具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消痛的功效[2].由于川貝母生長周期長,種子休眠期長,自然萌發(fā)率低,長期被濫采濫挖等原因,川貝母資源嚴重匱乏.
為了解決川貝母的市場供應(yīng)需求,現(xiàn)已進行川貝母、暗紫貝母和瓦布貝母的人工栽培和研究,經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn),瓦布貝母是最適合人工種植的種類,且瓦布貝母的總生物堿含量普遍高于其它基源的川貝母[3].然而,瓦布貝母的最佳采挖期為3~5年[4],栽培周期較長,人工栽培的瓦布貝母還易受到季節(jié)與地域的限制,不能在全國范圍內(nèi)廣泛推廣,因此,人工栽培不能完全有效地解決川貝母的供應(yīng)難題.
組織培養(yǎng)技術(shù)不受季節(jié)等條件的限制,可實現(xiàn)短時期內(nèi)迅速擴大植物的數(shù)量,獲得較高的經(jīng)濟效益.近年來,隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,組培藥用植物的使用價值也在不斷提升.Su等[5]將組培得到的瓜蔞生根苗,移至田間種植,短時間內(nèi)能夠收獲成熟塊根.研究表明,利用水仙組培技術(shù)體外合成加蘭他敏(Galanthamine)被認為是可替代生產(chǎn)的一種方法[6]. Bhattacharyya等[7]在探究藥用蘭科植物繁殖的模式組織培養(yǎng)途徑中,發(fā)現(xiàn)再生植株的次級代謝產(chǎn)物,如酚、生物堿、類黃酮等都有較高的活性水平.Zhao等[8]研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)是批量生產(chǎn)用于制藥業(yè)的川貝母類固醇生物堿的一種有效策略.目前,以瓦布貝母為材料進行組織培養(yǎng)的研究還未見報導(dǎo).本研究利用組織培養(yǎng)體系生產(chǎn)再生鱗莖,提取并研究其活性成分,為川貝母藥用價值研發(fā)提供資料.
瓦布貝母由四川新荷花川貝母生態(tài)藥材有限公司提供,由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院唐琳教授鑒定.
2.2.1 植物材料預(yù)處理 選取瓦布貝母鮮鱗莖(3年生,直徑約1.5 cm),切除根系,用自來水沖洗、去除泥污.再將鱗片剝開,用刷子輕輕刷洗,洗凈泥污.去掉最外面一層腐爛、褐化的鱗片.放入洗衣粉溶液中浸泡 10~15 min,最后自來水下沖洗2 h.
2.2.2 外植體滅菌方法 取預(yù)處理后的瓦布貝母鮮鱗莖,分別選擇兩種消毒方式進行滅菌:
(A) 75%酒精約10 s,無菌水沖洗3次,0.1%升汞15 min,無菌水沖洗,無菌水浸泡10 min后沖洗3次,滅菌濾紙吸干.
(B) 75%乙醇浸泡約10 s ,無菌水沖洗2~3次,再用10%次氯酸鈉浸泡20 min,無菌水沖洗,無菌水浸泡 10 min 后沖洗3次,滅菌濾紙吸干.
將兩種方法滅菌后的鱗莖切成約0.5 cm的小塊,無菌接種于MS[9]培養(yǎng)基中.將上述材料放4 ℃冰箱2 d,再轉(zhuǎn)移至組培室培養(yǎng),控制溫度在22~24 ℃,光照培養(yǎng),記錄30 d內(nèi)外植體污染率,比較得出鱗莖外植體最佳滅菌方式,A處理每次接種外植體約29塊,B處理每次接種外植體約6塊,實驗重復(fù)3次.
污染率=(被污染的外植體數(shù)/接種的總外植
體數(shù))×100%
2.2.3 植物激素對鱗莖外植體啟動率及生長情況的影響 以MS為基本培養(yǎng)基,30 g/L蔗糖,8 g/L瓊脂,0.1 g/L活性炭,添加不同種類和濃度的激素,pH為5.8,共配制10種培養(yǎng)基(見表2).配制完成后,置于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌20 min,冷卻待用.將已經(jīng)滅菌處理的鱗莖外植體接種至培養(yǎng)基進行啟動誘導(dǎo),每種培養(yǎng)基接種約25塊,放置組培室培養(yǎng),控制溫度在22~24 ℃,每日光照16 h,光照強度2500~3500 lx.在40 d后觀察瓦布貝母鱗莖外植體啟動率和生長狀況.實驗重復(fù)3次.
2.2.4 瓦布貝母總生物堿的測定 參照藥典[1],測定各樣品(生長期為4個月的再生鱗莖和3年生瓦布貝母鱗莖)總生物堿含量,每組混合3個樣品.本品按干燥品計算,總生物堿以西貝母堿計,不得少于0.050%.測得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行方差分析,按照單因素ANOVA檢驗判斷顯著性差異,顯著水平0.05.
組培30 d后,鱗莖外植體的污染狀況見表1,結(jié)果顯示采用B(75%酒精約10 s+10% NaClO 20 min)消毒方式處理后,污染率較高,而選擇A(75%酒精約10 s+0.1%升汞15 min)消毒方式處理后,污染率低,處理效果較好.
表1 兩種滅菌方法處理外植體30 d污染率Tab.1 Pollution rate of explants treated by two sterilization methods for 30 d
不同培養(yǎng)基條件下鱗莖外植體40 d后啟動率和生長狀況見表2.從表2中發(fā)現(xiàn),2,4-D和NAA配合使用雖然可以誘導(dǎo)鱗莖外植體啟動,但是在此培養(yǎng)基條件下鱗莖外植體的生長狀態(tài)不佳,存活數(shù)量較少.NAA與6-BA配合使用有助于誘導(dǎo)鱗莖外植體啟動或分化,但是較高濃度的NAA會抑制鱗莖外植體的生長.培養(yǎng)基中NAA和6-BA濃度分別控制在0.5~2 mg/L,瓦布貝母鱗莖外植體后續(xù)生長狀況良好,有芽、小鱗莖和少量愈傷組織形成(見圖1).
表2 不同激素對外植體啟動率和生長狀況的影響Tab.2 Effects of different hormones on initiation rate and growth of explants
圖1 瓦布貝母外植體生長情況注:(a)~(h)分別為2號~9號培養(yǎng)基植物生長情況Fig.1 Growth of Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis explantsNote:(a)~(h) are the growth of plants in medium 2~9 respectively
實驗發(fā)現(xiàn)(見圖2),不同培養(yǎng)條件下即隨著激素濃度的改變,瓦布貝母再生鱗莖的總生物堿含量存在顯著性差異,說明激素能夠影響瓦布貝母鱗莖生物堿的積累.再生鱗莖中除5號和6號培養(yǎng)基中再生鱗莖的總生物堿含量測定值較低外,其余培養(yǎng)基的再生鱗莖總生物堿含量均高于2015年版中國藥典的規(guī)定要求.
圖2 不同培養(yǎng)條件瓦布貝母總生物堿含量比較(n=3)a~h表示組間有顯著性差異(P<0.05)注:虛線表示藥典規(guī)定“總生物堿含量不少于0.050%”Fig.2 Comparison of total alkaloid content of Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis in different culture conditions(n=3)a~h indicates there have significant difference (P<0.05) between the groupsNote: Fictitious line indicates that pharmacopoeia stipulates “total alkaloid content is not less than 0.050%”
瓦布貝母是名貴川產(chǎn)道地藥材川貝母的基源種[3].瓦布貝母成功引種栽培,較為有效地緩解了川貝母資源難題,然而栽培瓦布貝母的栽培時間太長[10],栽培品的產(chǎn)量、質(zhì)量與無機鹽[11]等外源環(huán)境條件也有關(guān).因此,栽培瓦布貝母不能完全有效地解決市場矛盾.本研究希望構(gòu)建有效的瓦布貝母組織培養(yǎng)體系,以滿足生產(chǎn)要求.初步研究結(jié)果顯示,外源激素種類、濃度和不同激素組配比能夠影響外植體的生長狀況,與先前研究結(jié)果一致[12],但具體激素培養(yǎng)方案有一定差異. 川貝母組織培養(yǎng)過程中易發(fā)生褐變現(xiàn)象,本實驗采取低溫預(yù)處理外植體和在培養(yǎng)基中添加活性炭的方法[13]來緩解此現(xiàn)象.后期除優(yōu)化激素種類和濃度的最佳配比外,還將研究其它因素如光照、溫度以及外源化合物等對組織培養(yǎng)物生長的影響,實現(xiàn)對培養(yǎng)條件的優(yōu)化[14].
生物堿是瓦布貝母重要的活性成分.本試驗顯示,6種組培方案的瓦布貝母總生物堿含量達到藥典規(guī)定要求,說明再生鱗莖具有藥用潛力.而5號和6號培養(yǎng)基再生鱗莖總生物堿含量較少,可能與外源激素有關(guān),金青等[15]研究發(fā)現(xiàn)外源激素通過改變內(nèi)源激素水平直接或間接調(diào)控生物堿積累.此外,光照[6]和外源化合物[16]等均能影響生物堿的積累,還有研究顯示非生物脅迫有利于植物次生代謝物的產(chǎn)生[17],因此在組培過程中,可以添加多種外源因素,提高有效成分的體外產(chǎn)量.目前,有關(guān)瓦布貝母生物堿合成的相關(guān)酶和基因的研究資料較少,后續(xù)可開展功能基因的研究以探究調(diào)控過程.
栽培瓦布貝母鱗莖中含有多種生物堿成分[18].但相比栽培鱗莖,組培鱗莖的生物堿成分是否發(fā)生變化,還需要進一步驗證.同時,如果組培鱗莖中確有增加或減少的生物堿成分,那么藥物活性是否會被影響,也有待研究.后期將繼續(xù)完善實驗體系,為組培瓦布貝母市場化提供可能性.