滕俞希， 王晶金， 陳逸菲， 彭 婕， 范維強(qiáng)， 唐 琳

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065；2.阿壩藏族羌族自治州食品藥品檢驗(yàn)所， 阿壩 624000)

1 引 言

藥材川貝母是百合科多種植物包括川貝母(Fritillariacirrhosa)、暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)和其變種瓦布貝母(FritillariaunibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis)等的干燥鱗莖[1].川貝母的活性成分主要有西貝母堿、貝母辛等多種甾體生物堿，具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消痛的功效[2].由于川貝母生長周期長，種子休眠期長，自然萌發(fā)率低，長期被濫采濫挖等原因，川貝母資源嚴(yán)重匱乏.

為了解決川貝母的市場供應(yīng)需求，現(xiàn)已進(jìn)行川貝母、暗紫貝母和瓦布貝母的人工栽培和研究，經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn)，瓦布貝母是最適合人工種植的種類，且瓦布貝母的總生物堿含量普遍高于其它基源的川貝母[3].然而，瓦布貝母的最佳采挖期為3～5年[4]，栽培周期較長，人工栽培的瓦布貝母還易受到季節(jié)與地域的限制，不能在全國范圍內(nèi)廣泛推廣，因此，人工栽培不能完全有效地解決川貝母的供應(yīng)難題.

組織培養(yǎng)技術(shù)不受季節(jié)等條件的限制，可實(shí)現(xiàn)短時(shí)期內(nèi)迅速擴(kuò)大植物的數(shù)量，獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益.近年來，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，組培藥用植物的使用價(jià)值也在不斷提升.Su等[5]將組培得到的瓜蔞生根苗，移至田間種植，短時(shí)間內(nèi)能夠收獲成熟塊根.研究表明，利用水仙組培技術(shù)體外合成加蘭他敏(Galanthamine)被認(rèn)為是可替代生產(chǎn)的一種方法[6]. Bhattacharyya等[7]在探究藥用蘭科植物繁殖的模式組織培養(yǎng)途徑中，發(fā)現(xiàn)再生植株的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如酚、生物堿、類黃酮等都有較高的活性水平.Zhao等[8]研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)是批量生產(chǎn)用于制藥業(yè)的川貝母類固醇生物堿的一種有效策略.目前，以瓦布貝母為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究還未見報(bào)導(dǎo).本研究利用組織培養(yǎng)體系生產(chǎn)再生鱗莖，提取并研究其活性成分，為川貝母藥用價(jià)值研發(fā)提供資料.

2 材料與方法

2.1 材 料

瓦布貝母由四川新荷花川貝母生態(tài)藥材有限公司提供，由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院唐琳教授鑒定.

2.2 方 法

2.2.1 植物材料預(yù)處理 選取瓦布貝母鮮鱗莖(3年生，直徑約1.5 cm)，切除根系，用自來水沖洗、去除泥污.再將鱗片剝開，用刷子輕輕刷洗，洗凈泥污.去掉最外面一層腐爛、褐化的鱗片.放入洗衣粉溶液中浸泡 10～15 min，最后自來水下沖洗2 h.

2.2.2 外植體滅菌方法 取預(yù)處理后的瓦布貝母鮮鱗莖，分別選擇兩種消毒方式進(jìn)行滅菌：

(A) 75%酒精約10 s,無菌水沖洗3次，0.1%升汞15 min，無菌水沖洗，無菌水浸泡10 min后沖洗3次，滅菌濾紙吸干.

(B) 75%乙醇浸泡約10 s ,無菌水沖洗2～3次,再用10%次氯酸鈉浸泡20 min,無菌水沖洗,無菌水浸泡 10 min 后沖洗3次，滅菌濾紙吸干.

將兩種方法滅菌后的鱗莖切成約0.5 cm的小塊，無菌接種于MS[9]培養(yǎng)基中.將上述材料放4 ℃冰箱2 d，再轉(zhuǎn)移至組培室培養(yǎng)，控制溫度在22～24 ℃，光照培養(yǎng)，記錄30 d內(nèi)外植體污染率，比較得出鱗莖外植體最佳滅菌方式，A處理每次接種外植體約29塊，B處理每次接種外植體約6塊，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

污染率=(被污染的外植體數(shù)/接種的總外植

體數(shù))×100%

2.2.3 植物激素對(duì)鱗莖外植體啟動(dòng)率及生長情況的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，0.1 g/L活性炭，添加不同種類和濃度的激素，pH為5.8，共配制10種培養(yǎng)基(見表2).配制完成后，置于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，冷卻待用.將已經(jīng)滅菌處理的鱗莖外植體接種至培養(yǎng)基進(jìn)行啟動(dòng)誘導(dǎo)，每種培養(yǎng)基接種約25塊，放置組培室培養(yǎng)，控制溫度在22～24 ℃，每日光照16 h，光照強(qiáng)度2500～3500 lx.在40 d后觀察瓦布貝母鱗莖外植體啟動(dòng)率和生長狀況.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2.2.4 瓦布貝母總生物堿的測定 參照藥典[1]，測定各樣品(生長期為4個(gè)月的再生鱗莖和3年生瓦布貝母鱗莖)總生物堿含量，每組混合3個(gè)樣品.本品按干燥品計(jì)算，總生物堿以西貝母堿計(jì)，不得少于0.050%.測得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，按照單因素ANOVA檢驗(yàn)判斷顯著性差異，顯著水平0.05.

3 結(jié)果與分析

3.1 植體滅菌方法

組培30 d后，鱗莖外植體的污染狀況見表1，結(jié)果顯示采用B(75%酒精約10 s+10% NaClO 20 min)消毒方式處理后，污染率較高，而選擇A(75%酒精約10 s+0.1%升汞15 min)消毒方式處理后，污染率低，處理效果較好.

表1 兩種滅菌方法處理外植體30 d污染率Tab.1 Pollution rate of explants treated by two sterilization methods for 30 d

3.2 植物激素對(duì)鱗莖外植體啟動(dòng)率及生長狀況的影響

不同培養(yǎng)基條件下鱗莖外植體40 d后啟動(dòng)率和生長狀況見表2.從表2中發(fā)現(xiàn)，2,4-D和NAA配合使用雖然可以誘導(dǎo)鱗莖外植體啟動(dòng)，但是在此培養(yǎng)基條件下鱗莖外植體的生長狀態(tài)不佳，存活數(shù)量較少.NAA與6-BA配合使用有助于誘導(dǎo)鱗莖外植體啟動(dòng)或分化，但是較高濃度的NAA會(huì)抑制鱗莖外植體的生長.培養(yǎng)基中NAA和6-BA濃度分別控制在0.5～2 mg/L，瓦布貝母鱗莖外植體后續(xù)生長狀況良好，有芽、小鱗莖和少量愈傷組織形成(見圖1).

表2 不同激素對(duì)外植體啟動(dòng)率和生長狀況的影響Tab.2 Effects of different hormones on initiation rate and growth of explants

圖1 瓦布貝母外植體生長情況注：(a)～(h)分別為2號(hào)～9號(hào)培養(yǎng)基植物生長情況Fig.1 Growth of Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis explantsNote：(a)～(h) are the growth of plants in medium 2～9 respectively

3.3 瓦布貝母總生物堿的測定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(見圖2)，不同培養(yǎng)條件下即隨著激素濃度的改變，瓦布貝母再生鱗莖的總生物堿含量存在顯著性差異，說明激素能夠影響瓦布貝母鱗莖生物堿的積累.再生鱗莖中除5號(hào)和6號(hào)培養(yǎng)基中再生鱗莖的總生物堿含量測定值較低外，其余培養(yǎng)基的再生鱗莖總生物堿含量均高于2015年版中國藥典的規(guī)定要求.

圖2 不同培養(yǎng)條件瓦布貝母總生物堿含量比較(n=3)a～h表示組間有顯著性差異(P<0.05)注：虛線表示藥典規(guī)定“總生物堿含量不少于0.050%”Fig.2 Comparison of total alkaloid content of Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis in different culture conditions(n=3)a～h indicates there have significant difference (P<0.05) between the groupsNote: Fictitious line indicates that pharmacopoeia stipulates “total alkaloid content is not less than 0.050%”

4 討 論

4.1 瓦布貝母的組織培養(yǎng)

瓦布貝母是名貴川產(chǎn)道地藥材川貝母的基源種[3].瓦布貝母成功引種栽培，較為有效地緩解了川貝母資源難題，然而栽培瓦布貝母的栽培時(shí)間太長[10]，栽培品的產(chǎn)量、質(zhì)量與無機(jī)鹽[11]等外源環(huán)境條件也有關(guān).因此，栽培瓦布貝母不能完全有效地解決市場矛盾.本研究希望構(gòu)建有效的瓦布貝母組織培養(yǎng)體系，以滿足生產(chǎn)要求.初步研究結(jié)果顯示，外源激素種類、濃度和不同激素組配比能夠影響外植體的生長狀況，與先前研究結(jié)果一致[12]，但具體激素培養(yǎng)方案有一定差異. 川貝母組織培養(yǎng)過程中易發(fā)生褐變現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)采取低溫預(yù)處理外植體和在培養(yǎng)基中添加活性炭的方法[13]來緩解此現(xiàn)象.后期除優(yōu)化激素種類和濃度的最佳配比外，還將研究其它因素如光照、溫度以及外源化合物等對(duì)組織培養(yǎng)物生長的影響，實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化[14].

4.2 瓦布貝母再生鱗莖生物堿含量測定

生物堿是瓦布貝母重要的活性成分.本試驗(yàn)顯示，6種組培方案的瓦布貝母總生物堿含量達(dá)到藥典規(guī)定要求，說明再生鱗莖具有藥用潛力.而5號(hào)和6號(hào)培養(yǎng)基再生鱗莖總生物堿含量較少，可能與外源激素有關(guān)，金青等[15]研究發(fā)現(xiàn)外源激素通過改變內(nèi)源激素水平直接或間接調(diào)控生物堿積累.此外，光照[6]和外源化合物[16]等均能影響生物堿的積累，還有研究顯示非生物脅迫有利于植物次生代謝物的產(chǎn)生[17]，因此在組培過程中，可以添加多種外源因素，提高有效成分的體外產(chǎn)量.目前，有關(guān)瓦布貝母生物堿合成的相關(guān)酶和基因的研究資料較少，后續(xù)可開展功能基因的研究以探究調(diào)控過程.

栽培瓦布貝母鱗莖中含有多種生物堿成分[18].但相比栽培鱗莖，組培鱗莖的生物堿成分是否發(fā)生變化，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證.同時(shí)，如果組培鱗莖中確有增加或減少的生物堿成分，那么藥物活性是否會(huì)被影響，也有待研究.后期將繼續(xù)完善實(shí)驗(yàn)體系，為組培瓦布貝母市場化提供可能性.