廖志銀，霍朝霞，翁登坡，趙魯杭，于曉虹

（浙江大學 醫(yī)學院 基礎醫(yī)學實驗教學中心，浙江 杭州 310058）

凝膠電泳與蛋白質印跡技術是生命科學及基礎醫(yī)學實驗室中常見的實驗技術。鑒于凝膠電泳與蛋白質印跡技術的重要性和實用性，2012年起，浙江大學基礎醫(yī)學實驗教學中心已在“生物化學與分子生物學”“分子醫(yī)學實驗”等課程中增加了這一實驗。以往的實驗中使用的凝膠配方因為凝膠各成分配比和交聯劑的比例沒有達到最優(yōu)，導致學生在制膠過程中頻頻出現問題，部分學生的膠聚合時間較長，需45～60 min；部分學生制的膠不能聚合，需要反復重新配制，浪費了大量時間，導致每組學生的實驗進度不一致；因為實驗課時間有限，部分學生只能做前半部分實驗，后半部分實驗無法繼續(xù)進行。此外，每批學生的實驗結果都不穩(wěn)定，重復性差。為了使學生能順利體驗整個實驗項目，使實驗結果具有更好的重復性，本研究對交聯劑的濃度、交聯劑與丙烯酰胺的比例、催化劑的濃度、膠聚合時間以及制備時的溫度等影響制膠的因素進行了改進，使學生的實驗結果趨于穩(wěn)定，大大提高了實驗效率。同時，本研究通過不斷調整和改進蛋白質印跡技術實驗中所用試劑的濃度和比例，使學生獲取實驗結果更加容易，也使學生較好地理解和掌握了該實驗技術，激發(fā)了學生的學習興趣，培養(yǎng)了學生的科學思維和探究能力[1]。

1 實驗原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法，基本原理：丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）與交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺（N,N’-Methylene Bis Acrylamide，MBA）在催化劑的作用下，經過聚合交聯形成含有親水性酰胺基側鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過亞甲基橋交聯形成三維網狀結構凝膠[2]。聚合的孔徑大小主要由凝膠的質量分數決定[3]，例如7.5%的凝膠孔徑平均為5 nm，30.0%的凝膠孔徑為2 nm左右。但交聯劑對電泳泳動率也有影響，交聯劑質量占總質量的比例越大，電泳泳動率越小[4-6]。

蛋白質印跡技術是分子生物學、生物化學、免疫學和遺傳學等學科研究領域中常用的實驗方法[7-9]，基本原理：用特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，通過分析著色位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息[10]。經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）分離的蛋白質樣品轉移到固相載體聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Difluoride，PVDF）膜上，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的未標記的一抗發(fā)生免疫反應，再與酶或同位素標記的二抗反應，經過底物顯色、化學發(fā)光或放射自顯影，檢測電泳分離的某種特定蛋白成分的存在和含量。

2 實驗步驟

2.1 總蛋白的提取

從20.0～30.0 g小鼠中取肝組織0.5 g，在濾紙上剪碎，放入玻璃勻漿管中，按1∶15的比例加入勻漿緩沖液，取2.00 mL離心管，各加入1.20 mL勻漿液，于4 ℃下13 000轉離心20 min后，取上清液于﹣20 ℃條件下保存，用于SDS-PAGE分離檢測。

2.2 凝膠的制備

2.2.1 分離膠的制備

改進前后SDS-PAGE分離膠各成分用量如表1所示。

表1 改進前后SDS-PAGE分離膠配制用量（10.00 mL）

2.2.2 濃縮膠的制備

改進前后SDS-PAGE濃縮膠各成分用量如表2所示。

表2 改進前后SDS-PAGE濃縮膠配制用量（5.00 mL）

2.3 待測液配制

將上一實驗中取得的蛋白質樣品液與5X蛋白質樣品溶解液按4∶1混合均勻，制作成待測液，另外取出混合后的待測液一份，再用5X蛋白質樣品溶解液稀釋一倍，制成濃度減半的待測液一份。

2.4 電泳與轉膜

在沸水浴中加熱標準蛋白質樣品、Marker、待測樣品液3～5 min；待制膠完成后，用加樣槍頭或微量注射器，在樣品槽內各加入標準蛋白質樣品10 μL和待測樣品液10～15 μL、Marker 5～10 μL，穩(wěn)壓90 V電泳至含溴酚藍指示劑的樣品液泳動到濃縮膠與分離膠結合處，調整電壓至110 V，電泳至指示劑泳動到分離膠下端邊緣1.0～1.5 cm時再停止泳動，時間控制在50～60 min。每個電泳槽內雙面安放兩塊長短玻璃板，其中一面玻璃板中的凝膠在結束本次凝膠電泳后，用考馬斯亮藍R-250染色液染色30 min，之后將凝膠放入150 mm培養(yǎng)皿內，在脫色搖床上搖1～2 h進行脫色；另一面長短玻璃板中的凝膠立即進行轉膜。將電泳好的凝膠放在去離子水中漂洗，按（負極）3層濾紙、凝膠、膜、3層濾紙（正極）的順序進行，90 V恒壓1 h。取下膜后用TBST（用NaCl、KCl、Tris base和吐溫、純凈水及濃鹽酸配制的溶液）淋洗，待PVDF膜晾干后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 封閉、一抗反應

取上述保存好的PVDF膜，甲醇激活，用TBST淋洗后，放入封閉液中，室溫搖床輕搖1 h；取出PVDF膜，用TBST淋洗3遍，加入一抗[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH），1∶2 000]，改進前一抗使用濃度比為1∶5 000。取出PVDF膜后，用TBST漂洗3次，每次10 min。

2.6 二抗反應

將PVDF膜放入用辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記的二抗體溶液中，室溫搖動1 h，仍用TBST洗滌3次，每次10 min。改進前二抗?jié)舛缺葹?∶3 000，改進后按1∶2 000進行稀釋。

2.7 觀察、記錄

打開化學發(fā)光圖像分析儀，預冷20 min以上，使其電荷耦合元件（Charge Coupled Device，CCD）溫度在﹣30 ℃以下，用發(fā)光條進行測試，圖像清晰完整方可用于拍攝。

將增強型化學發(fā)光液（Enhanced Chemiluminescence，ECL）A、B按1∶1等量混合。將PVDF膜從器皿中取出，放到化學發(fā)光圖像分析儀上，在膜上加ECL，使其完全覆蓋膜表面，反應1～3 min后進行測定，讀取數據并保存。

3 結果與討論

3.1 制膠與考馬斯亮藍染色結果分析

用改進前的凝膠配制方案，80.0%以上的學生配制的SDS-PAGE容易出現各種問題，如凝膠內部極易產生氣泡（見圖1），凹槽“梳條”高低不平、不直、易彎曲，凹槽大小不均勻，凝膠聚合時間較長；部分學生的凝膠不能良好地聚合，導致后續(xù)實驗無法進行。

圖1 改進前的制膠結果

凝膠配制質量直接影響后續(xù)實驗。使用改進前的凝膠電泳，用考馬斯亮藍R-250染色后，分離條帶較粗，容易呈彎曲狀，拖尾，清晰度與分辨率均較差。

改進凝膠配方后，將加樣梳從濃縮膠中拔出后，凹槽“梳條”具有良好的韌性，不易彎曲，不易斷裂，凹槽形狀完整（見圖2）；凝膠聚合時間縮短，同時受溫度影響較小，制備成功率高。分離膠與濃縮膠制備均可控制在20～30 min完成。改進后，幾乎所有學生制膠都能成功，學生都能進行后續(xù)相關實驗。

圖2 改進后的制膠結果

用預染Marker觀察電泳的進程和Marker條帶的分離情況[11]，牛血清白蛋白（Bovine Albumin，BSA）67 kD純品作為標準蛋白質，和提取的總蛋白質樣品同時用改進后的凝膠進行電泳?？捡R斯亮藍R-250染色30 min，經2～3次脫色后，分離條帶清晰度與分辨率均極高，稀釋一倍后，雖然顏色變淡，分離條帶仍具有很好的清晰度與分辨率，同時條帶拖尾和彎曲現象明顯減少（見圖3）。改進后，學生可清晰地觀察到蛋白質樣品條帶，根據Marker推算出標準蛋白質（BSA）的相對分子質量。改進前，由于多數學生配制的凝膠質量差，只有少數學生可以清晰地觀察到實驗結果。完成第一步的SDS-PAGE，意味著蛋白質印跡技術能順利應用，是該實驗項目的關鍵步驟。

圖3 改進后的考馬斯亮藍染色結果

3.2 CCD成像檢測結果分析

凝膠配制質量會直接影響后續(xù)實驗，改進前，學生的實驗結果大多不理想，由于跑膠后有些電泳條帶變成斜線或曲線，印記雜交顯影后有的條帶彎曲，有些條帶不清晰或不完整（見圖4A、B）。

此外，抗體濃度對顯影也有很大影響。根據實驗不斷調整和改進抗體的濃度，選擇最合適的濃度很有必要。在實驗中不斷調整和改進抗體濃度，一抗（GAPDH）濃度比由原來的1∶5 000調整為1∶2 000；二抗?jié)舛缺扔?∶3 000調整為1∶2 000。調整前，CCD成像直觀性不理想，背景條帶多而雜，發(fā)光條帶有的亮度過曝，有的顯示不足（見圖4C、D）。調整后，CCD成像合成結果Marker條帶與發(fā)光條帶相當清晰，背景干凈，沒有亮度過曝情況（見圖5）。

圖4 改進前的Western blotting CCD成像結果

圖5 改進后的Western blotting CCD成像合成結果

SDS-PAGE是蛋白印跡雜交技術的關鍵步驟[12-13]，學生如果在這一步出現問題，后續(xù)實驗將無法進行。該實驗自開設以來，因技術步驟較多和操作復雜等，學生在操作過程中出現的問題較多，多數學生在制膠環(huán)節(jié)就失敗，導致實驗不能繼續(xù)進行，或者每批學生的結果都不穩(wěn)定、重復性差，每次實驗結果都不理想。為使學生熟練且穩(wěn)定地掌握該技術，本研究經過長期的摸索和實踐，反復改變實驗條件，最后通過改進凝膠各成分配比方案，有效增強了凝膠配制的時效性，大大提高了凝膠電泳后續(xù)實驗的穩(wěn)定性和成功率[14-15]。通過優(yōu)化蛋白質印跡過程中關鍵試劑的使用濃度、控制ECL加樣時間，確保目標蛋白質條帶清晰、結果理想。改進后的實驗反應時間控制合理，制膠成功率高，印記雜交顯影后非特異性條帶少，可操作性強，學生滿意度較高。

改進后，學生能熟練操作、完整體驗實驗過程，經過蛋白質提取、凝膠電泳、蛋白質印跡技術分段式練習，學生的動手操作能力、實驗結果分析能力和綜合思考能力都得到了有效鍛煉和提高。

4 結語

項目從蛋白質的提取到SDS-PAGE分離檢測，再到蛋白印跡技術，3個部分具有良好的系統性和連貫性，對培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新意識、提高學生的綜合實踐能力和創(chuàng)新能力具有很好的引導作用。因此，不斷改進實驗方法、提高實驗的成功率極其重要。該實驗使學生，特別是本科生得到了較強的實踐鍛煉和較好的操作體驗，得到了系統性的培養(yǎng)，提高了學生對分子醫(yī)學和分子生物學實驗技術的興趣。掌握該實驗的研究方法不僅能更好地為今后所涉及的前沿科學研究項目（如蛋白質組學等研究）服務，也能促進思考與判斷，拓寬學生的科研和創(chuàng)新思路，凸顯教學成效。