熊昊杰 申晨晨 馬 艷

砷是廣泛分布于自然界的類金屬元素，多數(shù)流行病學(xué)研究、體內(nèi)及體外細(xì)胞實驗表明，砷暴露具有神經(jīng)毒性。大腦作為砷中毒的靶器官之一，砷可以透過血-腦脊液屏障或胎盤屏障在腦組織中蓄積，長期接觸會導(dǎo)致慢性砷中毒進而增加神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的風(fēng)險[1～4]。由于神經(jīng)細(xì)胞對有毒物質(zhì)較為敏感且不容易再生，使得砷對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性研究顯得尤為重要。目前砷致神經(jīng)發(fā)育毒性的具體機制尚不明確，其多集中在凋亡、氧化應(yīng)激、信號通路改變等方面，而信號通路的交叉融合對砷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及其之間的相互關(guān)系受到廣泛關(guān)注[5～8]。有研究表明，核因子-類胡蘿卜素2相關(guān)因子(nf-e2-related factor 2，Nrf2)、河馬(Hippo)信號通路的激活和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一[9, 10]。而關(guān)于砷致神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的機制研究相對較少，因此，本研究主要研究亞砷酸鈉對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NE-4C細(xì)胞)增殖、Nrf2及Hippo信號通路相關(guān)分子表達(dá)水平的影響，從分子水平上探究砷致神經(jīng)干細(xì)胞損傷的可能機制。

材料與方法

1.細(xì)胞株：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NE-4C細(xì)胞)，購自廣州吉妮歐公司。

2.試劑與儀器：亞砷酸鈉(NaAsO2，分析純)購自北京化學(xué)試劑三廠；胎牛血清購自美國Sigma公司；MEM低糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、谷氨酰胺、PBS緩沖液購自美國HyClone公司；RIPA裂解液、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶公司；兔抗小鼠Nrf2單克隆抗體購自中國萬類生物公司、兔抗小鼠HO-1單克隆抗體購自英國Abcam公司、兔抗小鼠Keap1單克隆抗體購自中國萬類生物公司； Anti-rabbit IgG-HRP購自美國CST公司Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit購自日本TaKaRa公司；高速離心機購自美國Sigma公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司；三色預(yù)染Marker、PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：NE-4C細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM(含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%谷氨酰胺)于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，用0.5%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞開展后續(xù)實驗。藥物干預(yù)時間按照參考文獻(xiàn)及預(yù)實驗結(jié)果確定干預(yù)時長為48h。實驗分組按照亞砷酸鈉干預(yù)細(xì)胞48h的IC50=1.608μmol/L分為0(對照組)、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L組。

4.CCK-8檢測亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞活力的影響：從培養(yǎng)箱中取出處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(NE-4C細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%)，胰酶消化、離心、吸棄上清后，加1ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻制備成細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，吸取一定量的細(xì)胞懸液進行稀釋并將懸液吸取100μl接種至96孔板中，每孔個數(shù)為3×103，每組設(shè)置3個復(fù)孔，放入37℃培養(yǎng)箱過夜，第2天早上吸棄上清，加入不同濃度的亞砷酸鈉溶液，連續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl的CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2h后，酶標(biāo)儀測定450nm吸光度值。

5.Western blot法檢測Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達(dá)：染毒結(jié)束后，收集細(xì)胞于冰上裂解30min。4℃、12000r/min離心10min，取上清進行BCA 蛋白定量。蛋白變性后取20～30μg進行上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次10min，二抗室溫孵育1h，洗膜3次后進行顯影，采用Image J進行灰度值分析。

6.qRT-PCR檢測Hippo信號通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)：染毒結(jié)束后，利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并測定樣品的濃度和純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用Primer-Blast軟件設(shè)計針對 MST1、SAV1、MOB1、LATS1、YAP的熒光定量PCR引物并合成(生工生物工程股份有限公司)，引物序列詳見表1。根據(jù)熒光定量試劑盒說明書建立熒光定量PCR反應(yīng)體系，采用2-ΔΔCt值表示mRNA的相對表達(dá)量。

表1 實驗中所使用mRNA引物序列

結(jié) 果

1.亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞凋亡的影響：不同濃度亞砷酸鈉干預(yù)NE-4C細(xì)胞48h后，CCK-8結(jié)果顯示，與對照組比較，0.2和0.4μmol/L組細(xì)胞活力高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；0.6～1.0μmol/L亞砷酸鈉染毒的細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；1.5～4.0μmol/L亞砷酸鈉染毒的細(xì)胞活力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2，圖1)。

表2 亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞活力的影響

圖1 亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞活力的影響A.細(xì)胞活力柱狀圖；B.細(xì)胞活力曲線圖。與0μmol/L比較，*P<0.05

2.亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達(dá)的影響：不同濃度亞砷酸鈉干預(yù)NE-4C細(xì)胞48h后，Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L組HO-1蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，2.4、3.2μmol/L組Nrf2蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組Keap1蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果詳見表3和圖2。

表3 亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響A.免疫蛋白印跡法結(jié)果；B.蛋白表達(dá)水平柱狀圖。與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3.亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞Hippo信號通路核心分子mRNA表達(dá)的影響：不同濃度亞砷酸鈉干預(yù)NE-4C細(xì)胞48h后，RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，2.4、3.2μmol/L組MST1mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組MOB1mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組SAV1mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，2.4、3.2μmol/L組LATS1mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組YAPmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4，圖3)。

表4 亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞Hippo信號通路核心分子mRNA表達(dá)的影響

圖3 亞砷酸鈉對NE-4C細(xì)胞Hippo信號通路核心分子mRNA表達(dá)的影響與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

討 論

砷及其化合物具有明顯的神經(jīng)發(fā)育毒性，研究證明砷通過誘導(dǎo)凋亡、自噬、壞死等引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡。有研究認(rèn)為，極低劑量砷對人體有益，如刺激造血、促進細(xì)胞增殖等。本研究結(jié)果顯示，極低劑量(0.2μmol/L)砷可促進細(xì)胞的增殖，而隨著亞砷酸鈉濃度的增加活力降低，抑制了細(xì)胞增殖。長期接觸砷對機體中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)造成不同程度的損害，進而影響機體某些神經(jīng)行為功能、子代的神經(jīng)發(fā)育和調(diào)節(jié)系統(tǒng)等[4]。目前，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是砷致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷的重要機制之一，其受控于諸多因素調(diào)節(jié)，如信號通路、酶活性等，但具體機制尚不明確。正常情況下，機體處于氧化-抗氧化的動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)遭受某種有害刺激時，細(xì)胞及機體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)產(chǎn)生過多，氧化程度超出機體的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡被打破，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[11]。

本研究結(jié)果顯示，亞砷酸鈉干預(yù)染毒可以誘導(dǎo)NE-4C細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，提示亞砷酸鈉可引起細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激可激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)?？寡趸磻?yīng)多表現(xiàn)為清除ROS和修復(fù)受損細(xì)胞的生物分子。Nrf2作為細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中的核轉(zhuǎn)錄因子，被Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(recombinant Kelch like ECH associated protein 1，Keap1)錨定在細(xì)胞質(zhì)而被蛋白酶體降解，Keap1作為Nrf2活性的抑制劑，在Nrf2活性的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[12,13]。此外，Keap1也是氧化應(yīng)激的“傳感器”。在發(fā)生氧化應(yīng)激后，Nrf2與Keap1分離后進入細(xì)胞核，激活下游相關(guān)靶基因，如血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)，同時與小Maf(small Maf proteins，sMafs)蛋白結(jié)合成異二聚體，然后結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)，以此來激活下游相關(guān)分子的基因轉(zhuǎn)錄，增強細(xì)胞的解毒及抗氧化能力，維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡[13]。

HO-1蛋白作為熱休克蛋白中的一種，在正常組織中幾乎不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時，HO-1大量產(chǎn)生以提高機體的抗氧化水平，減少機體對氧化應(yīng)激的敏感度，維持機體正常生存并減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。Abiko等[15]將肝癌細(xì)胞暴露于砷中，結(jié)果顯示，HO-1可被持續(xù)激活并伴隨Nrf2激活時間延長，而HO-1基因敲除可降低Nrf2激活時間。同時使用HO-1抑制劑預(yù)處理可增強砷暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，表明HO-1可能是Nrf2激活的正反饋調(diào)節(jié)因子。Reichard等[16]研究認(rèn)為，砷不僅會引起Nrf2的激活而且也會引起HO-1轉(zhuǎn)錄抑制因子Bach1的失活，因此當(dāng)細(xì)胞暴露于砷環(huán)境時，會出現(xiàn)HO-1的持續(xù)激活。本研究結(jié)果顯示，不同濃度亞砷酸鈉作用于NE-4C細(xì)胞后，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)隨亞砷酸鈉濃度的增加而升高，Keap1蛋白的表達(dá)隨亞砷酸鈉濃度的增加而降低，提示亞砷酸鈉激活了NE-4C細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中Nrf2通路以抵抗氧化應(yīng)激損傷。

細(xì)胞的增殖、凋亡并不是受單一信號通路調(diào)控。Hippo 通路中的相關(guān)分子或激酶也通過促進或抑制細(xì)胞內(nèi)很多其他信號通路來發(fā)揮其相應(yīng)的作用，共同調(diào)節(jié)著機體正常的生命活動。哺乳動物Hippo信號通路的核心是一個激酶級聯(lián)，其高度保守且通過調(diào)控細(xì)胞增殖或凋亡來決定器官大小，在生長發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。在此通路中，上游信號活化哺乳動物 STE20 激酶(mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2)后，與Salvador同系物1(Salvador homolog 1，SAV1)蛋白結(jié)合成復(fù)合物，繼而磷酸化下游激酶腫瘤抑制基因1/2(large tumour suppressor 1/2，LATS1/2)，活化的LAST1/2與Mps結(jié)合激酶激活物1(Mps once binder kinase activator-like 1，MOB1)相結(jié)合磷酸化下游核心效應(yīng)分子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)及其旁系同源分子，YAP無法與DNA直接結(jié)合，必須與TEA結(jié)構(gòu)域家族轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional enhancer associate domain family members，TEAD)等轉(zhuǎn)錄因子相互作用才能介導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)調(diào)控。阻斷Hippo信號通路或該通路核心成員缺失將導(dǎo)致YAP入核增加，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD等結(jié)合并誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、存活和遷移有關(guān)的一系列基因的表達(dá)[18,19]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，不同濃度亞砷酸鈉干預(yù)NE-4C細(xì)胞48h后，Hippo信號通路關(guān)鍵分子MST1、MOB1、SAV1、YAP mRNA表達(dá)水平隨亞砷酸鈉濃度的增加而升高。LATS mRNA表達(dá)水平隨亞砷酸鈉濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。表明亞砷酸鈉可激活Hippo信號通路。而經(jīng)典的Hippo信號通路激活之后，YAP入核減少從而降低其表達(dá)，與本研究結(jié)果顯示YAP mRNA表達(dá)增加不一致。以上情況可能跟NE-4C細(xì)胞缺少p53基因有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在p53缺失的小鼠自發(fā)性淋巴瘤中通常表現(xiàn)出YAP的上調(diào)，而YAP的變化與MST1的活性無關(guān)。這似乎證明p53的缺失和YAP的聯(lián)合上調(diào)是通過一種未知的機制獲得了一種選擇性優(yōu)勢[20]。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，砷可誘導(dǎo)染砷小鼠皮膚Hippo信號通路核心分子蛋白表達(dá)增加，且砷可獨立于Hippo信號通路來激活YAP。這與本研究結(jié)果相一致，因此本研究認(rèn)為，亞砷酸鈉可以激活Hippo信號通路，同時也獨立于Hippo信號通路激活YAP，其具體激活機制還有待于深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉可抑制NE-4C細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化分子Nrf2通路激活以抵抗氧化應(yīng)激；同時亞砷酸鈉可誘導(dǎo)Hippo信號通路激活，且可獨立于Hippo信號通路激活YAP，但其具體激活機制尚需開展進一步研究予以證實。