李寶瑩 運晨霞

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種發(fā)病原因多樣、發(fā)病機制復雜，臨床表現(xiàn)以關(guān)節(jié)持續(xù)性炎癥和不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞等為主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究表明，RA發(fā)病關(guān)鍵的風險因素是遺傳易感性，其中主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)決定著機體免疫應答和免疫穩(wěn)態(tài)的相互關(guān)系，在自身免疫病的發(fā)生中起著重要的作用[2]。人類MHC被稱為人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)復合體，HLA-Ⅱ類基因的DR區(qū)與RA的易感有關(guān)，其中HLA-DRB1基因是RA已知的易感基因[3]。通過檢測具有HLA-DRB1基因的RA患者對早期免疫抑制治療有積極的作用[4]。

為深入開展和了解RA的致病過程，RA動物模型是必不可少的工具。嚙齒類動物因其成本低、遺傳背景明確和操作方便等優(yōu)點而得到廣泛應用。目前常選嚙齒類中的大鼠和小鼠作為模式動物，本文就5種常用刺激劑誘導的嚙齒類動物RA模型的特征、不同品系的大鼠、小鼠對刺激劑的易感性及動物模型構(gòu)建時需要注意的關(guān)鍵問題進行概述。

一、佐劑誘導性關(guān)節(jié)炎(adjuvant induced arthritis, AIA)模型

佐劑可分為弗氏完全佐劑(complete Freund′s adjuvant, CFA)和弗氏不完全佐劑(incomplete Freund adjuvant, IFA)，兩者主要區(qū)別在于CFA添加了熱滅活的結(jié)核桿菌。用 CFA制備AIA模型時，由于結(jié)核桿菌含有與關(guān)節(jié)滑膜上糖蛋白分子結(jié)構(gòu)相似的分子結(jié)構(gòu)，可誘發(fā)交叉免疫反應，激活T淋巴細胞過度增殖并攻擊關(guān)節(jié)軟骨中的C抗原成分，產(chǎn)生大量的腫瘤壞子因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素(interleukin,IL)-1β等炎性細胞因子導致持續(xù)性炎癥發(fā)生，如壞死性肉芽腫[5]。用IFA制備AIA模型時，由于佐劑缺乏結(jié)核桿菌細胞壁成分或其他含有多肽成分，誘導的關(guān)節(jié)炎是慢性、關(guān)節(jié)特異性的，受T淋巴細胞和MHC基因調(diào)節(jié)。不同的是，CFA中含有熱滅活的結(jié)核桿菌能誘導強烈的偏向Th1型的細胞免疫應答；IFA主要引起體液免疫應答，偏向Th2型反應。

本模型的造模方法是通過將佐劑注射到動物的尾根部來刺激激活遠端四肢等關(guān)節(jié)炎癥，由于注射部位遠離發(fā)生炎癥的部位，可完全排除注射刺激導致的非特異性炎癥的干擾[6]。動物發(fā)病時炎癥首先出現(xiàn)在注射部位，繼發(fā)在身體其他部位出現(xiàn)關(guān)節(jié)的腫脹、足趾紅腫且進行性加重導致行動不便等現(xiàn)象，病理表現(xiàn)可見滑膜增殖、淋巴細胞浸潤和軟骨退化等改變，這些表現(xiàn)與人RA相似。

在動物選擇方面，較多選用大鼠，大鼠在構(gòu)建AIA模型時受遺傳背景中的MHC和非MHC基因控制，因此了解不同品系大鼠的遺傳背景有助于提高AIA模型構(gòu)建時的易感性。一般AIA模型構(gòu)建時多采用Wistar、LEW(Lewis)和SD(Sprague-Dawley)大鼠，誘導10～14天可觀察到關(guān)節(jié)炎的癥狀。但造模過程中大鼠的細胞免疫應答方面出現(xiàn)明顯異常，而體液免疫應答不明顯，這與RA患者大多表現(xiàn)為體液免疫應答與細胞免疫應答方面皆異常的表現(xiàn)有明顯區(qū)別，是AIA模型的不足之一。小鼠也可經(jīng)CFA誘導成AIA模型，但小鼠AIA模型病程持續(xù)時間較短。

二、膠原誘導性關(guān)節(jié)炎模型

Trentham等[7]利用Ⅱ型膠原蛋白免疫小鼠誘導產(chǎn)生了自身免疫性關(guān)節(jié)炎，因其許多與人RA相似的病理和免疫學特征而被廣泛研究。臨床研究表明，血清中抗天然Ⅱ型膠原蛋白抗體具有軟骨降解的作用，與關(guān)節(jié)炎侵蝕損害程度有關(guān)。Ⅱ型膠原蛋白可從多種動物(大鼠、小鼠、牛、人、豬和雞)中獲得，不同種屬間Ⅱ型膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)存在保守性，導致不同種屬來源的Ⅱ型膠原蛋白能與自身抗體發(fā)生交叉反應[8]。

本模型在制備時常將Ⅱ型膠原蛋白乳化在CFA或IFA中，對易感的嚙齒類動物(大鼠和小鼠)進行皮內(nèi)免疫，Ⅱ型膠原蛋白進入體內(nèi)后會經(jīng)抗原遞呈細胞加工、分解成多個多肽片段被MHC-Ⅱ類分子提呈給T淋巴細胞，T淋巴細胞活化后產(chǎn)成大量的炎性細胞因子引發(fā)CIA的病理進程[9]。同時，活化的T淋巴細胞可輔助B淋巴細胞活化分泌IgM型Ⅱ型膠原蛋白抗體，該抗體與Ⅱ型膠原蛋白形成免疫復合物沉積在關(guān)節(jié)滑膜部位，激活補體系統(tǒng)進一步使炎性細胞活化從而引起關(guān)節(jié)滑膜的炎癥和軟骨的損傷，動物通常在免疫1～2周后就開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)的腫脹[10]。免疫過程具體分為兩個階段，第1階段注射Ⅱ型膠原蛋白與CFA混合物；第2階段注射Ⅱ型膠原蛋白與CFA混合物，炎癥表現(xiàn)較為強烈；若采用Ⅱ型膠原蛋白與IFA混合物則骨侵蝕破壞更明顯。后期炎性反應開始逐步減弱或消退時可進行再次免疫延長炎癥。不同的是，第2階段的加強免疫大鼠多選擇在7～10天，小鼠多選擇在第21天左右進行[11]。

膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型在免疫學及病理學上的變化與人RA有一些共同的臨床和組織病理學特征，如關(guān)節(jié)腫脹明顯，關(guān)節(jié)病理染色可觀察到增殖性滑膜炎以及侵蝕性血管翳等炎癥特征，體內(nèi)可檢測到抗Ⅱ型膠原蛋白抗體、皮膚遲發(fā)型超敏反應和關(guān)節(jié)降解表現(xiàn)[12]。

在動物選擇方面，大鼠在構(gòu)建CIA模型時多選用鼠齡7～8周、對CIA高度易感的SD、Wistar、BB(Bio-Breeding)、LEW、DA(Dark Agouti)等，其中在CIA研究中雄性大鼠占78.69%[13]。不同的是，同源性大鼠Ⅱ型膠原蛋白易誘導DA大鼠發(fā)生多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，異源性雞Ⅱ型膠原蛋白能誘導DA、BB、LEW等品系大鼠發(fā)生較強的炎性反應[14]。小鼠CIA模型多選用鼠齡7～8周、品系為DBA/1、BALB/C、C57BL/6和B10.RIII的小鼠和異源性Ⅱ型膠原蛋白來誘導。DBA/1小鼠和B10.RIII小鼠因擁有的H-2q和H-2r基因，使其易受到T淋巴細胞的抗原識別導致CIA敏感度很高，兩者皆對牛和豬來源的Ⅱ型膠原蛋白較敏感[15]；不同的是，DBA/1小鼠對雞Ⅱ型膠原蛋白可誘導較強的血清反應，B10.RIII小鼠對雞Ⅱ型膠原蛋白反應較差[16]。BALB/C小鼠對牛來源的Ⅱ型膠原蛋白有反應，C57BL/6小鼠對雞來源的Ⅱ型膠原蛋白產(chǎn)生T淋巴細胞和B淋巴細胞免疫。相關(guān)研究表明，對CIA誘導反應敏感的大鼠比小鼠更早出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，T細胞活化持續(xù)時間更長使得炎癥發(fā)生率和嚴重程度更大[17]。

三、鏈球菌細胞壁誘導的關(guān)節(jié)炎模型

許多細菌細胞壁肽聚糖成分已被證實具有促炎活性，可直接或間接刺激或調(diào)節(jié)免疫，誘導嚙齒類動物發(fā)生關(guān)節(jié)炎。針對鏈球菌細胞壁特異的抗體反應以及軟骨和骨骼的破壞依賴于Toll樣受體(toll-like receptor,TLR4)通路，急性炎癥階段，鏈球菌也可以通過TLR2通路直接激活巨噬細胞，導致針對鏈球菌片段的先天免疫反應；在慢性期，鏈球菌首先啟動特異性B淋巴細胞和T淋巴細胞反應的發(fā)生，接著激活適應性免疫反應[18]。

本模型在制備時將鏈球菌細胞壁成分肽聚糖多聚糖水懸液單獨腹腔注射于易感品系體內(nèi)，24h 即出現(xiàn)急性期關(guān)節(jié)腫脹，2 周左右出現(xiàn)慢性炎性反應，關(guān)節(jié)腫脹逐漸加重，至 4 周時趨于穩(wěn)定，并持續(xù)數(shù)月，成為嚴重的侵蝕性關(guān)節(jié)炎?，F(xiàn)研究認為急性期是胸腺非依賴性的炎性反應，而慢性期則是一種胸腺依賴性的特異性免疫應答過程，并且這種特征性的波動期與 RA 患者相似。這個慢性階段與在受累關(guān)節(jié)高水平的炎性細胞因子、生長因子、金屬蛋白酶、循環(huán)氧化酶及氧化氮的產(chǎn)生有關(guān)[19]。鏈球菌細胞壁誘導的關(guān)節(jié)炎(streptococcal cell wall arthritis, SCWIA)模型組織學和放射學結(jié)果顯示有一段時間的急性滲出期，隨后是侵蝕性滑膜炎，炎癥嚴重程度與T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核細胞的激活狀態(tài)有關(guān)。與人RA比較，該模型滑膜增殖、炎性細胞滲透、對稱關(guān)節(jié)受累和復發(fā)性炎癥表現(xiàn)相似，但該模型缺乏高滴度的類風濕因子(rheumatoid factor, RF)，而且沒有類風濕結(jié)節(jié)的形成[20]。此外，該模型對治療人類RA的藥物金制劑和青霉素的反應差。因此該模型用于研究RA仍有一定欠缺。

在動物選擇方面，大鼠SCWIA模型的易感性與激素的分泌有關(guān)，其中雌性LEW大鼠的SCWIA發(fā)生率幾乎為100%，而雄性LEW大鼠、MHC相容雄性、雌性Fisher(F344/N)、WKY、BUF和其他品系相對耐藥，在暴露于鏈球菌細胞壁后不會發(fā)展為較嚴重的疾病[21]。小鼠SCWIA模型常用BALB/c、DBA/1品系小鼠在膝關(guān)節(jié)內(nèi)一次或多次注射鏈球菌細胞壁碎片使關(guān)節(jié)敏感，首先出現(xiàn)急性關(guān)節(jié)炎，1周內(nèi)痊愈，經(jīng)反復注射導致慢性關(guān)節(jié)炎。

四、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白誘導關(guān)節(jié)炎模型

軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)是一種五聚體糖蛋白，主要存在于軟骨、肌腱、滑膜、氣管、半月板關(guān)節(jié)軟骨中，與軟骨蛋白結(jié)合的抗體存在于早期RA患者的血液和滑液中，因此利用該蛋白可誘發(fā)高發(fā)生率的嚴重關(guān)節(jié)炎，同時伴有強烈的自身抗體反應，并確保只涉及自身免疫過程[22]。

本模型在制備時用天然和變性的COMP在IFA(不完全弗氏佐劑)中免疫可誘導大鼠的嚴重關(guān)節(jié)炎，溶解的COMP制劑用等量的IFA乳化，在大鼠尾巴底部進行皮內(nèi)注射。在嚴重關(guān)節(jié)炎的情況下，COMP在組織侵蝕期間從軟骨中釋放出來。這是COMP的一個有趣的特征，這使它成為RA中關(guān)節(jié)炎的生物學標志物。慢性關(guān)節(jié)炎的大鼠在用低分子量佐劑降植烷的誘導下也會釋放COMP，血清中的水平與侵蝕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[23]。與CIA模型比較，COMP誘導關(guān)節(jié)炎模型具有一定的優(yōu)勢，關(guān)節(jié)炎的發(fā)病是突然的，其特征是出現(xiàn)紅斑和前后爪腫脹。在腳趾關(guān)節(jié)遠端觀察到關(guān)節(jié)炎，并在幾天內(nèi)同時在腳踝/腕關(guān)節(jié)發(fā)作。在嚴重的情況下，可以看到其擴散到跖骨/掌骨區(qū)域以及關(guān)節(jié)和腳趾。

在動物選擇方面，大鼠COMP誘發(fā)關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建時，主要易感品系是DA和LEW；COMP誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎模型時常用C57BL/6小鼠，發(fā)病與MCHⅡ類肽識別有關(guān)，T淋巴細胞對非自身COMP的反應促進了關(guān)節(jié)炎的誘導[24]。與人RA比較，用COMP誘導的RA模型有利于研究關(guān)節(jié)炎的慢性發(fā)展和自身免疫反應的表位擴散和骨侵蝕，可作為研究關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的替代模型。

五、降植烷誘導關(guān)節(jié)炎模型

降植烷(pristane)誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎是通過刺激B淋巴細胞合成IgM、IgA型RF，同時RF與降植烷形成免疫復合物被吞噬細胞吞噬，轉(zhuǎn)變?yōu)檠仔约毎櫥ぃ@種受到T淋巴細胞和MHC基因調(diào)節(jié)的慢性特異性關(guān)節(jié)炎的模式使得PIA模型成為研究炎癥性關(guān)節(jié)疾病機制的重要工具[25]。

本模型在制備時注射降植烷在動物腹膜或皮內(nèi)，2～3周內(nèi)炎癥局限于關(guān)節(jié)，大鼠6～8周成為慢性復發(fā)性疾??；小鼠2～10個月才開始發(fā)生關(guān)節(jié)炎癥。PIA模型造模過程雖然較長，但關(guān)節(jié)炎癥呈慢性反復進行性加重，病理變化包括滑膜增殖、中性粒細胞浸潤、骨膜炎、軟骨侵蝕和進行性邊緣侵蝕，血清方面也可檢測到RF、抗熱休克蛋白抗體以及Ⅱ型膠原，這些改變與人RA較為接近，因此，該模型非常適合應用于慢性復發(fā)炎癥的長期研究以及治療干預，尤其是T淋巴細胞活化相關(guān)途徑導致的關(guān)節(jié)炎。

在動物選擇方面，大鼠降植烷誘導關(guān)節(jié)炎(pristane induced arthritis, PIA)模型常用LEW大鼠，發(fā)生率較高，紅腫最為明顯，但模型發(fā)病時間相對較晚，且不同的個體造模結(jié)果差異較大，但在急性期，血清還可檢測到RF和IL-6，與人RA十分相似，但炎癥消退后病情仍反復發(fā)作[26]。小鼠PIA模型常用BALB/c小鼠，以慢性發(fā)展為特點，關(guān)節(jié)炎癥腫脹程度較輕，一般經(jīng)初次注射后還需再次注射等量降植烷后，10天左右才出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，70天左右才能觀察到關(guān)節(jié)腫脹[27]。

需要說明的是，每一種嚙齒類動物RA模型在發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)僅可模擬人RA疾病的一部分，并不能還原人RA發(fā)病的整個概況。模型的選擇取決于待研究疾病的階段和待解決的問題。合適的動物模型在構(gòu)建時需根據(jù)研究的目的、動物的遺傳背景、刺激劑等方面進行選擇，以保證動物模型發(fā)病特點貼合研究目的，為RA的研究提供良好的實驗工具。