郭少華,閆利萍,劉征權(quán),馬文博,付美媛,趙平原,毛會(huì)麗,關(guān)建義
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)
嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和維氏單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于弧菌科,氣單胞菌屬,廣泛分布于各類養(yǎng)殖水體中,是常見的人-獸-魚共患病的病原菌,也是多種水生動(dòng)物的條件致病菌[1-4]。嗜水氣單胞菌和維氏單胞菌可產(chǎn)生高毒性外毒素,如溶血素、腸毒素和蛋白酶等,能引起淡水魚類細(xì)菌性出血病,導(dǎo)致魚類大量死亡,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-9]。此外,這2 種細(xì)菌也嚴(yán)重威脅人類的健康,可引起人類患胃腸炎、敗血癥、腹膜炎及外傷感染等疾病,因此一些國(guó)家已把嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌及其同屬菌作為水體質(zhì)量和食品安全的檢疫對(duì)象[10-11]。目前,國(guó)際上已經(jīng)建立了水生動(dòng)物疾病檢疫網(wǎng)絡(luò),應(yīng)用免疫防治技術(shù)及綠色生物漁藥控制病害的發(fā)生,是當(dāng)今世界水生動(dòng)物疾病防控的研究重點(diǎn),也是解決我國(guó)水產(chǎn)藥物濫用問(wèn)題、促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要技術(shù)保障[12-13]。因此,魚類疫苗已成為水生動(dòng)物疾病防治領(lǐng)域研發(fā)的主流產(chǎn)品。
魚類疫苗的相關(guān)研究最早始于20 世紀(jì)40 年代。1942 年,加拿大學(xué)者Duff[14]首次成功研制出鮭產(chǎn)氣單胞菌滅活口服疫苗,開創(chuàng)了魚類疫苗的新時(shí)代。1975 年,疥瘡病ERM 疫苗由美國(guó)疫苗有限公司(AVL)成功研制,并獲得生產(chǎn)許可,開啟了魚類疫苗的工業(yè)化進(jìn)程[12]。1984 年,在法國(guó)巴黎首次成功舉辦了魚類疫苗接種研討會(huì),是魚類疫苗發(fā)展歷程中的重要里程碑[15]。進(jìn)入21 世紀(jì),魚類疫苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅速,全世界已有140 多種疫苗獲得生產(chǎn)許可證,在北美、東亞等多個(gè)主要養(yǎng)殖區(qū)建立了工業(yè)生產(chǎn)基地[16]。我國(guó)漁業(yè)疫苗的研究始于20 世紀(jì)60 年代[17]。1969 年,中國(guó)第一種魚類疫苗即草魚出血病組織血漿滅活疫苗(即“土法”疫苗)由珠江水產(chǎn)研究所研制成功[18]。1986 年,研制出免疫效果較好的草魚出血病病毒滅活疫苗[19]。20 世紀(jì)90 年代初,中華鱉嗜水氣單胞菌滅活疫苗和鱸鰻弧菌口服微膠囊疫苗研制成功[20-21]。目前,我國(guó)有5 種疫苗獲得了國(guó)家新獸藥證書。2011 年,我國(guó)2 種魚類疫苗獲得了生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)許可,魚類疫苗行業(yè)產(chǎn)業(yè)化正式開啟。隨著國(guó)家提倡減少漁藥、大力推廣疫苗免疫,國(guó)內(nèi)魚用疫苗研制也進(jìn)入了快速發(fā)展階段。
國(guó)內(nèi)水產(chǎn)疫苗中,注射疫苗的占比為79.0 %,浸泡與口服疫苗的占比為21.0 %[20]。為了解細(xì)菌性敗血癥二聯(lián)注射疫苗[22]在淡水魚類中的應(yīng)用效果,在河南省新鄉(xiāng)市延津縣小楊莊開展了淡水魚免疫注射試驗(yàn)。
試驗(yàn)地位于河南省新鄉(xiāng)市延津縣小楊莊,選擇6 口池塘,面積均為3 335 m2,水深均約 2 m,每口池塘均配置自動(dòng)投料機(jī)1 臺(tái)、增氧機(jī)5 臺(tái)。魚塘每667 m2用100 kg 生石灰消毒,后注水,水源來(lái)自地下水。
對(duì)照組的 3 口(1#,2#,3#)塘未注射淡水魚細(xì)菌性出血病疫苗;試驗(yàn)組的 3 口塘(1#,2#,3#)注射淡水魚細(xì)菌性出血病疫苗。
2019 年 4—11 月。
從本地選購(gòu)個(gè)體健壯、無(wú)病的草魚(Ctenopharyngodon Idellus)、鰱(Hypophthalmichehys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)。2019 年 4 月 20 日,每個(gè)池塘放養(yǎng)魚種11 500 尾左右(其中50 g 左右的草魚種 10 000 尾、150 g 左右的鰱種 1 250 尾、150 g 左右的鳙種250 尾)。
淡水魚細(xì)菌性出血病疫苗為嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗,由本實(shí)驗(yàn)室制備。將嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌接種于LB 液體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)16 h,加入終濃度為0.2 %的甲醛溶液,28 ℃搖床滅活 24 h,于 10 000 r/min 離心 20 min,收集菌株,加入磷酸緩沖液(PBS)至菌體濃度為1×108cfu/mL,經(jīng)超聲破碎后制得嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌二聯(lián)滅活疫苗。將制備的疫苗涂布平板,28 ℃培養(yǎng)48 h 后,平板無(wú)菌落出現(xiàn),證明完全滅活。在魚種投放前,用連續(xù)注射器對(duì)30 尾草魚腹腔注射制備的疫苗,用量為0.2 mL/尾。經(jīng)觀察,草魚無(wú)異常反應(yīng)且血清抗體明顯增加,證明疫苗安全無(wú)毒[23]。之后對(duì)魚種進(jìn)行腹腔注射,每尾0.2 mL。
日常投喂主要以顆粒飼料為主,青飼料為輔,投餌量根據(jù)水溫、天氣、魚類生長(zhǎng)及魚攝食情況進(jìn)行調(diào)整,每天 08:00、12:00 和 18:00 各投喂 1 次。在 4—11 月份定期換水,每次換水量為20~30 cm,每隔2 周全池潑灑1 次生石灰水調(diào)節(jié)水質(zhì),用量為每667 m21.0~1.5 kg,保持魚塘透明度為 35 cm 左右。每天清理投料臺(tái)區(qū)域并撈取塘中污物,保持養(yǎng)殖池塘水體潔凈;每天3 次巡塘,察看水體顏色變化、魚類攝食及活動(dòng)情況,若發(fā)現(xiàn)異常,查找原因,及時(shí)采取措施。及時(shí)撈出池中死魚和重病魚,記錄數(shù)量,觀察、解剖和顯微檢測(cè),確定其是否患出血病。
試驗(yàn)結(jié)束之后,排水撈魚,統(tǒng)計(jì)每種魚存活數(shù)量,計(jì)算試驗(yàn)組與對(duì)照組草魚的存活率,按下列公式計(jì)算免疫保護(hù)率。
式中:SRP 為免疫保護(hù)率,%;RI為免疫組死亡率,%;RC為對(duì)照組死亡率,%。
在魚苗放養(yǎng)后的第 0,30,60,90,120,150 和180 天,分別從每個(gè)魚塘中隨機(jī)撈取30 尾,稱其質(zhì)量,重復(fù)3 次,并記錄。計(jì)算放苗后第180 天時(shí),魚類的各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)。計(jì)算公式如下。
式中:WG 為凈質(zhì)量增加量,g;RWG 為質(zhì)量?jī)粼黾勇剩?;RSG 為特定生長(zhǎng)率,%/d;F 為餌料系數(shù);W0為初始平均體質(zhì)量,g;WT為終末平均體質(zhì)量,g;T 為飼養(yǎng)天數(shù),d;FT為總投餌量,kg;WZ為總質(zhì)量增加量,kg。
使用軟件SPSS 24 進(jìn)行單因素方差分析,試驗(yàn)結(jié)果用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,組間差異采用LSD進(jìn)行多重比較,P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異極顯著。
試驗(yàn)期間,各養(yǎng)殖塘內(nèi)的淡水魚均出現(xiàn)了不同程度的死亡現(xiàn)象,試驗(yàn)組與對(duì)照組存活率見表1。由表1 可見,試驗(yàn)組存活率高于對(duì)照組,且試驗(yàn)組草魚的平均存活率同對(duì)照組相比極顯著提高了37.3%(P<0.01),試驗(yàn)組鰱和鳙的平均存活率同對(duì)照組相比極顯著提高了20.0%(P<0.01)。淡水魚細(xì)菌性敗血癥疫苗對(duì)草魚、鰱和鳙的免疫保護(hù)率分別為95.0%,66.6%和80.7%(表2)。
表1 細(xì)菌性敗血癥疫苗對(duì)淡水魚存活率① %
表2 細(xì)菌性敗血癥疫苗對(duì)淡水魚的免疫保護(hù)率 %
淡水魚的發(fā)病率見表3。由表3 可見,試驗(yàn)中危害最大的疾病為出血病,其平均發(fā)病率為29.5%,占死亡總量的77.8%;腸炎病的平均發(fā)病率為5.3%,占死亡總量的14.0%;爛鰓病的平均發(fā)病率為1.9%,占死亡總量的4.9%。試驗(yàn)組魚類發(fā)病率相較于對(duì)照組有極顯著的下降(P<0.01),淡水魚類出血病、腸炎病、爛鰓病的平均發(fā)病率分別降低29.5%,2.8%和1.5%,并且其他病癥的平均發(fā)病率降低0.9%。
表3 淡水魚發(fā)病率 %
于試驗(yàn)第180 天計(jì)算試驗(yàn)組與對(duì)照組生長(zhǎng)性能的各項(xiàng)指標(biāo),結(jié)果見表4。由表4 可見,試驗(yàn)組草魚的日質(zhì)量增加量、凈質(zhì)量增加量和質(zhì)量?jī)粼黾勇示鶚O顯著高于對(duì)照組(P<0.01),草魚的特定生長(zhǎng)率高于對(duì)照組;試驗(yàn)組鰱的日質(zhì)量增加量和凈質(zhì)量增加量高于對(duì)照組,質(zhì)量?jī)粼黾勇逝c對(duì)照組差異極顯著(P<0.01),特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05);試驗(yàn)組鳙的凈質(zhì)量增加量和質(zhì)量?jī)粼黾勇矢哂趯?duì)照組,日質(zhì)量增加量與特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)。在飼養(yǎng)周期中,對(duì)照組和試驗(yàn)組的總投餌量分別是55 800 和 99 600 kg,餌料系數(shù)分別為 1.57 和 1.56。
表4 淡水魚的生長(zhǎng)性能①
試驗(yàn)組和對(duì)照組養(yǎng)殖產(chǎn)量見表5。由表5 可見,對(duì)照組共計(jì)收獲商品魚35 453.0 kg,其中草魚、鰱和鳙的總產(chǎn)量分別為31 700.0,2 625.0 和1 128 kg。對(duì)照組每667 m2的產(chǎn)量為2 363.5 kg,其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產(chǎn)量分別為2 113.3,175.0 和75.2 kg。試驗(yàn)組共計(jì)收獲商品魚63 638.9 kg,其中草魚、鰱和鳙的總產(chǎn)量分別為58 835.9,3 375.0 和1 428.0 kg。試驗(yàn)組每667 m2的產(chǎn)量為4 242.6 kg,其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產(chǎn)量分別為3 922.4,225.0 和 95.2 kg。
表5 養(yǎng)殖產(chǎn)量 kg
試驗(yàn)組與對(duì)照組在池塘租金、用電成本、魚苗成本、人工成本、固定資產(chǎn)折舊等費(fèi)用相同,試驗(yàn)結(jié)果不統(tǒng)計(jì)上述費(fèi)用。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),草魚、鰱和鳙的市場(chǎng)價(jià)格分別為 12.6,4.0 和 10.0 元/kg。
試驗(yàn)組和對(duì)照組養(yǎng)殖產(chǎn)值見表6。由表6可見,對(duì)照組總產(chǎn)值為42.12 萬(wàn)元,其中草魚、鰱和鳙的產(chǎn)值分別為39.94 萬(wàn),1.05 萬(wàn)和1.13 萬(wàn)元。對(duì)照組每667 m2的產(chǎn)值為2.81 萬(wàn)元,其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產(chǎn)值分別為2.66 萬(wàn),0.07萬(wàn)和0.08 萬(wàn)元。試驗(yàn)組總產(chǎn)值為76.90 萬(wàn)元,其中草魚、鰱和鳙的產(chǎn)值分別為74.13 萬(wàn),1.35 萬(wàn)和1.42 萬(wàn)元。每667 m2的產(chǎn)值為5.13 萬(wàn)元,其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產(chǎn)值分別為4.94 萬(wàn),0.09 萬(wàn)和0.09 萬(wàn)元。
表6 養(yǎng)殖產(chǎn)值 萬(wàn)元
試驗(yàn)組和對(duì)照組養(yǎng)殖成本見表7。由表7 可見,對(duì)照組和試驗(yàn)組總成本分別為22.70 萬(wàn)和38.01 萬(wàn)元,總收益分別為19.42 萬(wàn)和38.89 萬(wàn)元,每667 m2的收益分別為1.29 萬(wàn)和2.59 萬(wàn)元。
表7 養(yǎng)殖成本 元
魚類疫苗可有效降低養(yǎng)殖業(yè)對(duì)環(huán)境的污染,同時(shí)無(wú)藥物殘留及耐藥性等問(wèn)題[13]。在經(jīng)濟(jì)效益方面,魚類疫苗成本低且免疫效果好[24-26]。本試驗(yàn)使用的細(xì)菌性敗血癥疫苗為二聯(lián)疫苗,由滅活的嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌混合而成,包含2 種抗原成分。試驗(yàn)期間,注射淡水魚細(xì)菌性出血病疫苗的試驗(yàn)組魚類,在養(yǎng)殖周期中發(fā)病率低,攝食旺盛,生長(zhǎng)速度快,其中草魚平均免疫保護(hù)率達(dá)(95.0±1.2)%,成活率比對(duì)照組高出37.3%,鰱和鳙成活率比對(duì)照組高出20.0%。楊先樂(lè)等[27]開展的草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗免疫試驗(yàn),免疫組成活率為79.5%;張玉芬等[28]開展的嗜水氣單胞菌疫苗免疫鯉試驗(yàn),免疫組鯉的存活率為90.0%,淡水魚細(xì)菌性出血病疫苗具有更好的免疫效果。在養(yǎng)殖產(chǎn)量和效益方面,試驗(yàn)組均較高,其中總產(chǎn)量比對(duì)照組提高28 185.9 kg,總產(chǎn)值比對(duì)照組提高了34.78 萬(wàn)元,總收益比對(duì)照組提高了19.47 萬(wàn)元。整體上,淡水魚細(xì)菌性敗血癥疫苗安全有效[22],在魚類病害防控、提高機(jī)體免疫力、提高生產(chǎn)效率及養(yǎng)殖效益等多個(gè)方面均有較好的效果。此外,試驗(yàn)組藥物的用量遠(yuǎn)低于對(duì)照組。因此淡水魚細(xì)菌性敗血癥疫苗的使用,可減少因水產(chǎn)養(yǎng)殖造成的環(huán)境污染,提高水產(chǎn)品質(zhì)量。
細(xì)菌性敗血癥疫苗在淡水魚類病害的生物防治中有良好的效果。不僅可以保護(hù)魚類的健康、提高魚類對(duì)病害的抵抗力、魚類成活率和產(chǎn)量,還可以減少養(yǎng)殖水體的用藥量,促進(jìn)淡水養(yǎng)殖向綠色、健康、高產(chǎn)的方向發(fā)展。