潘稚芬 張亞會 彭草云

·綜述與進展·

噬菌體作為結(jié)核病新興診療技術(shù)的研究進展

潘稚芬1張亞會2彭草云1

1.嘉興市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科（嘉興學院附屬醫(yī)院），浙江嘉興 314000； 2.蚌埠醫(yī)學院研究生院，安徽蚌埠 233000

噬菌體是一種通過特異性感染殺死細菌的病毒。噬菌體治療細菌的研究已經(jīng)有幾十年歷史，但在結(jié)核病使用中的認識有限。目前，耐藥結(jié)核的流行促使分枝桿菌噬菌體在結(jié)核病的診療中的研究越來越多。本文通過噬菌體的特性介紹了不同分枝桿菌噬菌體對宿主的作用機制及其在臨床分型中的應用，并對噬菌體在結(jié)核病診斷及藥敏檢測中的價值，噬菌體療法在分枝桿菌感染中的成效等內(nèi)容進行總結(jié)。同時通過展望噬菌體作為結(jié)核病新興診療技術(shù)的優(yōu)勢與局限性，探討其未來研究的可行重點方向。

噬菌體；分枝桿菌噬菌體；結(jié)核??；診斷和治療

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的呼吸道傳染病，由于耐藥、耐多藥（multi drug-resistant tuberculosis, MDR-TB）和泛耐藥（extensively drug- resistant，XDR-TB）結(jié)核菌株的傳播，TB已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。肺結(jié)核現(xiàn)有的診療技術(shù)有限，導致大量MDR-TB和XDR-TB無法獲得有效治療，因此有必要探討結(jié)核病診療的新方法。噬菌體能特異性感染并裂解細菌，用于治療細菌感染已有幾十年的歷史。近年來因結(jié)核耐藥形勢嚴峻，噬菌體在結(jié)核病的診療中的研究受到廣泛重視[2]。筆者對噬菌體的特性及分枝桿菌噬菌體在結(jié)核病診斷和治療中的應用進行綜述。

1 噬菌體的結(jié)構(gòu)與種類

1.1 噬菌體的一般特性

噬菌體是一種感染細菌的病毒，主要由蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)成。根據(jù)不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為三類：球狀、蝌蚪狀和線狀。根據(jù)不同的核酸特點分為四類：單鏈脫氧核糖核酸（single strand deoxyribonucleic acid，ssDNA）、雙鏈脫氧核糖核酸（double stranded deoxyribonucleic acid，dsDNA）、單鏈核糖核酸（single strand ribonucleic acid，ssRNA）和雙鏈核糖核酸（double stranded ribonucleic acid，dsRNA）。綜合噬菌體組成可分為A～F六種類型[3]，其中，A、B、C三類為有頭部的蝌蚪狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)20面體dsDNA，A類以收縮性長尾為顯著性特征，如T4噬菌體；B類為非收縮性長尾，如λ噬菌體；C類為以T3噬菌體為例的非收縮性短尾噬菌體。D、E二類為有頭部的球狀無尾20面體，D類為ssDNA、如ΦX174噬菌體；E類以ssRNA核酸種類為代表的MS2噬菌體、以Φ6噬菌體為代表的核酸為dsRNA；F類為僅有尾部的線狀體、核酸為ssRNA，如M13噬菌體。

根據(jù)噬菌體對宿主作用的不同生命周期，分為烈性（裂解型）噬菌體和溫和（溶原）噬菌體。烈性噬菌體通過一系列復制產(chǎn)生子代噬菌體，使宿主細胞裂解死亡；溫和噬菌體則將自身脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）與宿主細胞的DNA整合實現(xiàn)同步復制，形成溶原菌致細菌裂解。

1.2 分枝桿菌噬菌體生物學特性

分枝桿菌噬菌體是一種專門感染分枝桿菌宿主的病毒，屬尾狀病毒科，尤其是肌病毒科（具有收縮尾巴）和星狀病毒科（非收縮尾巴）家族，后者含有90%以上描述的分枝桿菌噬菌體，它們具有dsDNA和尾巴的二十面體頭部，這類噬菌體的細菌宿主包括快生長的恥垢分枝桿菌，慢生長的結(jié)核分枝桿菌和鳥分枝桿菌[4]。

2 分枝桿菌噬菌體對宿主的作用機制

Catal?o等[5]發(fā)現(xiàn)分枝桿菌噬菌體具有不同的裂解酶組，包含細胞溶菌酶（LysinA、LysinB）和穿孔素（holin）蛋白，用于破壞分枝桿菌宿主細胞的復雜細胞膜和釋放病毒子代，具有高效裂解分枝桿菌的機制。

LysinA是一種細菌內(nèi)溶素，可水解細胞壁中的肽聚糖。LysinB是一種阿拉伯半乳聚糖酯酶，可特異性水解霉菌酸與肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖復合物的連接，從而破壞分枝桿菌的細胞膜。LysinB還可以水解恥垢分枝桿菌的海藻糖二甲酸酯，降低結(jié)核分枝桿菌致病力。LysinB具有脂肪分解活性，可以水解在MTB中廣泛存在的脂肪酸酯。Holin作為一種穿孔素蛋白，參與溶菌素從細胞質(zhì)向質(zhì)周的轉(zhuǎn)移，具有控制內(nèi)毒素的激活和進入細胞壁等多種作用。除裂解作為分枝桿菌死亡的主要機制外，Kortright等[6]還提出了次級機制的存在，如裂解細胞產(chǎn)生超氧自由基，或分枝桿菌噬菌體誘導程序性細胞死亡。此外，噬菌體還通過調(diào)節(jié)細菌細胞來刺激細菌的吞噬作用，噬菌體包裹在細菌表面，使其更易被巨噬細胞和其他先天免疫細胞識別[7]。

分枝桿菌噬菌體TM4的編碼蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相似，在單核細胞內(nèi)裂解并殺死分枝桿菌。噬菌體T7是一種專溶性噬菌體，可產(chǎn)生與核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚合酶結(jié)合的小的編碼蛋白質(zhì)，抑制細菌基因轉(zhuǎn)錄，阻止MTB-RNA聚合酶的酶促活性。噬菌體P4的衣殼蛋白以兩種方式抑制MTB的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶和轉(zhuǎn)錄基因的活性，殺死MTB。噬菌體L5的小尾蛋白通過水解分枝桿菌細胞膜表面的含糖分子達到裂菌。噬菌體PDRPv對結(jié)核分枝桿菌具有催化活性，然而確切抗結(jié)核機制尚不清楚[8]。分枝桿菌噬菌體SWU1gp39抑制分枝桿菌的脂質(zhì)代謝，阻止長鏈脂肪酸的產(chǎn)生，增加細胞壁通透性；gp67下調(diào)多個基因的轉(zhuǎn)錄，改變菌落形成和生物膜形態(tài)，在噬菌體子代的繁殖和釋放中發(fā)揮作用。此外，SWU1gp39和gp67通過增加MTB對不同抗生素的敏感性，可作為廣譜抗生素的佐劑或增效劑[9]。

3 分枝桿菌噬菌體在結(jié)核病中的應用

3.1 噬菌體在臨床分枝桿菌分型中的應用

自然界中噬菌體呈現(xiàn)出非常不同的宿主特異性，利用噬菌體宿主特異性可對臨床新分類的結(jié)核菌進行分型[10]。由于分子診斷技術(shù)的發(fā)展，噬菌體分型被DNA的方法所取代[11]。目前已有29個分枝桿菌噬菌體簇[A至Z、AA、AB和AC]，其中A是最大的簇，還有16個科。12個簇進一步分為亞簇：A1至A14和A16至A20、其中A15噬菌體只感染戈登分枝桿菌株。B1至B13、C1至C2、D1至D2、F1至F5、G1至G5、H1至H2、I1至I2、K1至K7、L1至L4、M1至M3和P1至P6。隨著噬菌體新序列的發(fā)現(xiàn)，基于整體核苷酸序列共享≥50%的基因組DNA或≥35%的基因被歸屬到相應的簇和亞簇組中[12]。20世紀80年代，分枝桿菌噬菌體通過基因重組工程和質(zhì)粒穿梭，在分枝桿菌宿主中引入選擇性免疫標志物來進行分枝桿菌屬的報告分型[13]。

3.2 分枝桿菌噬菌體在結(jié)核病診斷和耐藥檢測中的應用

以噬菌體為基礎(chǔ)的結(jié)核病診斷技術(shù)包括：噬菌體擴增生物學（phage amplified iologically，PhAB）檢測和噬菌體報告基因檢測（phage reporter assays，PRAs）。Foddai等[14]研究的PhAB技術(shù)利用噬菌體感染，擴增和破壞細胞的能力來檢測臨床樣本中活的結(jié)核分枝桿菌。該技術(shù)目前已用于結(jié)核病的快速診斷和藥物敏感性檢測，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所需的4～8周比較，PhAB檢測快速而簡單，只需48h，但耐藥分析的變異性較大，靈敏度81%～100%，特異性73%～100%。PhAB還具有檢測潰瘍分枝桿菌、鳥分枝、海分枝和龜分枝桿菌等其他非結(jié)核分枝桿菌的能力。

噬菌體報告基因檢測（phage reporter assays，PRAs）的關(guān)鍵優(yōu)勢是只有當存在活的靶細胞時才會產(chǎn)生信號。PRAs對不同的分枝桿菌噬菌體進行工程改造，即可以檢測到熒光、發(fā)光或替代信號。Allúe-Guardia等[15]將螢火蟲熒光素酶基因整合到噬菌體DNA中，構(gòu)建了第一代熒光素酶報告噬菌體法（luciferase reporter phage，LRP），重組噬菌體感染宿主細菌后可通過熒光顯微鏡觀察到，如果細菌已被抗生素殺死，則不能表達產(chǎn)生熒光蛋白，因而在含抗結(jié)核藥物培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)幾小時內(nèi)，即可動態(tài)觀察殺菌效果，進行抗結(jié)核藥物敏感性檢測和新藥的篩選。應用噬菌體Che12構(gòu)建新的分枝桿菌熒光素酶報告噬菌體，可檢測到休眠的結(jié)核分枝桿菌，對于診斷潛伏結(jié)核感染很有希望，該技術(shù)尚處于試驗階段，需要改進測試條件[16]。

此后，優(yōu)化LRP開發(fā)了攜帶綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein gene，gfp）的熒光分枝桿菌噬菌體。Piuri等[17]研究該方法檢測異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇等抗結(jié)核藥物的敏感度、特異性更高、穩(wěn)定性更好。Jain等[18]研究了納米熒光素酶報告法，該技術(shù)可準確識別異煙肼和利福平等耐多藥結(jié)核桿菌外，還可以在多耐藥和泛耐藥結(jié)核病方案中檢測貝噠喹啉、普托馬尼、利奈唑胺等藥物的敏感性。隨后又構(gòu)建了一個雙報告分枝桿菌噬菌體法，該技術(shù)可以用來鑒定和定量細胞內(nèi)持留結(jié)核分枝桿菌，評價治療效果[19]。Foddai等[20]研發(fā)的一項新技術(shù)是使用磁珠捕獲桿菌，該方法檢測活菌更快速、靈敏，特異性高。

3.3 分枝桿菌噬菌體在結(jié)核病治療中的應用

3.3.1 分枝桿菌噬菌體治療結(jié)核病的臨床前研究 早期噬菌體治療研究僅限于動物試驗，僅在牛分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌感染的動物模型上觀察。到目前為止，只有少數(shù)噬菌體的抗結(jié)核治療潛力被研究，包括分枝桿菌噬菌體D29、DS6A、TM4、BTCU-1、SWU1和Ms6[8]。彭麗等[21]研究結(jié)果顯示，菌體D29治療敏感結(jié)核分枝桿菌株感染的豚鼠與采用利福平治療4周后比較，效果優(yōu)于單用利福平。Pedulla等[22]發(fā)現(xiàn)包括TM4在內(nèi)的一些長尾分枝桿菌噬菌體尾部卷尺蛋白有裂解靜止期結(jié)核菌作用，減少結(jié)核病復發(fā)。柳巖等[23]研究D29不能裂解靜止期結(jié)核菌，但噬菌體TM4和Guol能夠裂解。Azimi等[8]利用恥垢分枝桿菌傳遞的噬菌體TM4裂解酶可殺死細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌。Danelishvili等[24]的研究證實：噬菌體TM4通過載體可殺死細胞內(nèi)結(jié)核和鳥分枝桿菌。噬菌體D29-LysinB對潰瘍分枝桿菌的殺菌作用在小鼠模型中也得到證實，體內(nèi)顯示出與其他抗菌藥物的協(xié)同作用，徹底消除感染部位的結(jié)核分枝桿菌[8]。Sula等[25]發(fā)現(xiàn)噬菌體DS6A治療結(jié)核分枝桿菌感染的豚鼠，與最有效的抗結(jié)核藥物異煙肼療效相當。Zemskova等[26]發(fā)現(xiàn)DS6A噬菌體可抑制肉芽腫的形成，對血行播散性結(jié)核有治療作用，療效略遜于異煙肼。鄔亭亭等[27]研究認為噬菌體33D為裂解型噬菌體，可殺滅休眠菌及胞內(nèi)菌，直接殺滅耐藥結(jié)核分枝桿菌，可作為耐藥結(jié)核病“雞尾酒療法”的候選噬菌體配方。江莉莎等[28]研究顯示，分支桿菌噬菌體Leo能殺滅結(jié)核分支桿菌。

有研究者認為3～6種具有不同抗藥性的分枝桿菌噬菌體組合治療結(jié)核病是理想的策略。Guerrero- Bustamante等[29]成功組裝了一種含五種噬菌體混合物的雞尾酒。Johansen等[30]則將噬菌體與抗生素結(jié)合使用協(xié)同殺滅病原菌。

3.3.2 分枝桿菌噬菌體給藥方法、頻率和劑量 噬菌體給藥方法取決于結(jié)核病灶的部位，包括滴鼻劑、吸入劑、口服、皮下注射、靜脈注射或膿腫內(nèi)直接注射。給藥頻率和劑量取決于噬菌體在治療部位維持有效的治療濃度多長時間而沒有嚴重的不良反應。由于噬菌體由蛋白質(zhì)和DNA組成，其毒性較低，大劑量治療除了對噬菌體衣殼蛋白有輕度過敏外，不會引起嚴重的不良反應。

3.3.3 分枝桿菌噬菌體在結(jié)核感染中的預防 2019年Carrigy等[31]研究足夠劑量的分枝桿菌噬菌體D29霧化吸入肺部是預防結(jié)核分枝桿菌感染的一種有價值的干預措施，為高風險人群預防性治療提供選擇。

3.3.4 分枝桿菌噬菌體在耐藥分枝桿菌感染中的治療 Dedrick等[32]首次報道了噬菌體用于臨床治療的研究。1例15歲雙肺移植后伴有囊性纖維化和彌散性耐藥膿腫分枝桿菌感染者Isabelle，該患者對藥物治療無效，研究人員在篩選了分枝桿菌噬菌體數(shù)據(jù)庫后，研發(fā)了Muddy、BPs33ΔHTH-HRM10和ZoeJΔ45三種噬菌體的混合物“雞尾酒”，經(jīng)靜脈給藥后患者臨床癥狀改善，皮膚感染性損害減輕，肝功能改善，無明顯不良反應。1例免疫功能正常的81歲老年男性，患有支氣管擴張伴耐藥膿腫分枝桿菌感染性肺病，使用同樣的三噬菌體雞尾酒靜脈治療6個月因強烈的抗體中和反應而失敗[33]。而在首例Isabelle患者中至少監(jiān)測了9個月未發(fā)現(xiàn)針對三株噬菌體的中和抗體，提示Isabelle的免疫抑制狀態(tài)（肺移植后免疫抑制劑服用），可能有利于噬菌體的存活和治療的成功。研究者還發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)（光滑或粗糙）影響噬菌體易感性，光滑的分離菌株可能具有初始耐藥性[33]。

4 分枝桿菌噬菌體診療的展望

噬菌體的診斷只檢測到活菌，而特異性是由噬菌體的宿主范圍決定，具有快速診斷結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌及藥敏檢測的能力，還有檢測結(jié)核潛伏感染的潛能，定量細胞內(nèi)持留分枝桿菌及評價治療效果。

噬菌體治療耐藥性細菌通常是個性化的，使用患者自己的致病菌株來篩選治療上有效的噬菌體，用于治療結(jié)核病的噬菌體“雞尾酒”需要滿足一些關(guān)鍵要求：①候選噬菌體必須同時感染結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌，以便能利用快生長的非致病性恥垢分枝桿菌菌株，安全有效地生產(chǎn)臨床使用所需的結(jié)核分枝桿菌噬菌體；②裂解性噬菌體是首選，因為很少有細菌能在噬菌體感染中存活下來，且當沒有更多的細菌宿主可接近時，噬菌體會自我消除；③溫和性噬菌體整合在宿主基因組上時可以形成溶原菌，在此過程中可能會將某些不利基因轉(zhuǎn)移到其他細菌中，導致宿主毒性或抗生素耐藥性的增加，但溫和性噬菌體可以通過基因操縱來使其轉(zhuǎn)變成裂解性噬菌體，從而適合于治療使用；④噬菌體“雞尾酒”的組合也很重要，它不僅會感染和殺死廣泛的臨床分離株，且足夠多樣化，以減少噬菌體耐受株出現(xiàn)的可能性。

作為一種結(jié)核病的潛在治療手段，噬菌體療法仍任重道遠。由于MTB獨特的感染方式，噬菌體治療最大的問題是如何進行給藥，使噬菌體與細菌相互接觸。未來隨著科學研究的發(fā)展，基于合成生物學，基因改造后的噬菌體若能克服目前療法中存在弊端，則有望成為治療耐藥結(jié)核病的另一法寶。

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浙江省中醫(yī)藥科技計劃（2021ZB290）；嘉興市科技計劃項目（2022AD30065）

潘稚芬，電子信箱：597085662@qq.com

（2022–06–29）

（2022–09–15）

R378.91

A

1673–9701(2022)36–0101–04