閆婧怡，鄭靜美，王軍華，李維佳

（河北瑞龍生物科技有限公司，河北 石家莊 050000）

0 引 言

李子為薔薇科李屬植物，在河北省種植資源豐富，尤其是在晉州市總十莊鎮(zhèn)有一萬多畝李子種植基地，保定滿城區(qū)也有幾十萬畝李子種植基地，年產(chǎn)量達(dá)百萬噸，其他地區(qū)零星分布。李子果實中不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時具有藥用價值，李子含有多酚等生物活性物質(zhì)，具有降低血糖、改善代謝、延緩衰老、抗癌癥的作用。

目前，對李子多酚的提取基本都是鮮果粗加工為主，而近年來，利用發(fā)酵技術(shù)提高活性成分的含量是發(fā)酵技術(shù)研究的新方向。研究發(fā)現(xiàn)，使用酵母菌對發(fā)酵可以提高植物活性成分的含量。酵母菌發(fā)酵是一種保持與提高果蔬營養(yǎng)價值和風(fēng)味的處理方式，通過酵母菌發(fā)酵提高李子活性成分含量的報道較少。本文以李子為原料，以漢遜德巴利酵母菌、馬克斯克魯維酵母菌株、谷胱甘肽酵母菌株、釀酒酵母及魯氏酵母為發(fā)酵菌株，在單因素試驗的前提下，以發(fā)酵前后李子多酚含量的變化為標(biāo)準(zhǔn)，通過微生物菌株的篩選及組合研究，篩選出提高發(fā)酵產(chǎn)物多酚含量的菌株及菌株組合。利用篩選出的微生物菌株，對微生物發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，進(jìn)而找到最佳的發(fā)酵條件，為李子多酚的加工及應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

李子購自石家莊農(nóng)貿(mào)市場。漢遜德巴利酵母菌株購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC2.1335。馬克斯克魯維酵母菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC1276。谷胱甘肽酵母菌株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為M205130。釀酒酵母中國微生物菌種保藏中心，CICC1928。魯氏酵母購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC32899。

1.2 試 劑

試驗中所用試劑見表1。

表1 試驗中所用試劑Table1 Reagents used in the test

1.3 儀器與設(shè)備

實驗中所用儀器見表2。

表2 實驗中所用儀器Table 2 Instruments used in the experiment

1.4 實驗方法

1.4.1 原材料預(yù)處理

對購回的李子進(jìn)行挑選，挑選出無腐爛，無傷害，完整的果實，將其清洗干凈，瀝干、去核后，至于-40℃冰箱內(nèi)冷凍保藏備用。

1.4.2 酵母菌菌懸液的制備

從市場上購買上述酵母菌菌株，將活化后的酵母菌菌株接入YPD 培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)48 h，然后4 000 r/min，離心10 min，用無菌生理鹽水清洗沉淀菌落后溶于蒸餾水，配置成活菌數(shù)為2.6×109CFU/mL 的菌懸液。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用福林- 酚比色法測定李子多酚含量，以沒食子酸計，在760 nm 處測定吸光值，根據(jù)吸光值的大小與沒食子酸濃度的大小成正相關(guān)的關(guān)系，制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 結(jié)果計算

式中：Q 為李子樣品中多酚的含量，mg/g；X 為在李子多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線中根據(jù)所測吸光值得出的李子多酚溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；V 為李子樣品定容的體積，mL；N 為樣品稀釋倍數(shù)；q 為李子樣品的質(zhì)量，g。

1.4.5 不同酵母菌菌株對李子多酚含量的影響

稱取50 g 李子凍果共7 份，經(jīng)解凍、破碎、打漿制成漿液，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至5，然后分別將漢遜德巴利酵母菌株、馬克斯克魯維酵母菌株、谷胱甘肽酵母菌株、釀酒酵母及魯氏酵母酵母菌株的菌懸液按照5%體積比接種，25 ℃培養(yǎng)48 h，在保證其他發(fā)酵條件相同的情況下，采集發(fā)酵樣品，測定發(fā)酵后多酚含量，設(shè)置李子漿液及不接種酵母菌的李子漿液作為對照，每組重復(fù)3 次，篩選出獲得能夠提升李子多酚含量的酵母菌菌株。

1.4.6 發(fā)酵酵母菌菌株的組合對李子多酚含量的影響

將優(yōu)選出的酵母菌菌株的菌懸液以相同菌數(shù)配比兩兩組合后，稱取50 g 李子凍果共4 份，經(jīng)解凍、破碎、打漿制成漿液，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值至5，將組合后的酵母菌菌懸液按照5%體積比接種，25 ℃培養(yǎng)48 h，在保證其他發(fā)酵條件相同的情況下，采集發(fā)酵樣品，測定發(fā)酵后多酚含量，設(shè)置不接種酵母菌的李子漿液作為對照，每組重復(fù)3 次，測定李子發(fā)酵物中的多酚含量，篩選出能夠提升多酚含量的酵母菌菌株組合。

1.4.7 李子多酚發(fā)酵的單因素試驗

1.4.7.1 酵母菌菌株配比對李子多酚提取量的影響

將優(yōu)選出的酵母菌菌株分別按照1∶4、1∶2、1∶1、1∶2、1∶4 的比例進(jìn)行組合，稱取50 g 李子凍果共5 份，經(jīng)解凍、破碎、打漿制成漿液，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至5，將組合后的酵母菌菌懸液按照5%體積比接種，25 ℃培養(yǎng)48 h，在保證其他發(fā)酵條件相同的情況下，每組重復(fù)3 次，測定李子發(fā)酵物中的多酚含量，篩選出酵母菌菌株組合的最佳配比。

1.4.7.2 酵母菌接種量對李子多酚提取量的影響

將優(yōu)選出的酵母菌菌株按照最佳配比組合，稱取50 g 李子凍果共5 份，經(jīng)解凍、破碎、打漿制成漿液，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至5.0，將組合后的酵母菌菌懸液分別按照1%、3%、5%、7%和9%的體積比接種，25℃培養(yǎng)48 h，在保證其他發(fā)酵條件相同的情況下，每組重復(fù)3 次，測定李子發(fā)酵物中的多酚含量，篩選出能夠顯著提升多酚含量的酵母菌接種量。

1.4.7.3 溫度對李子多酚提取量的影響

將優(yōu)選出的酵母菌菌株按照最佳配比組合，稱取50 g 李子凍果共5 份，經(jīng)解凍、破碎、打漿制成漿液，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至5.0，將組合后的酵母菌菌懸液分別最佳接種量接種，分別在22℃、25℃、28℃、31℃及34℃培養(yǎng)48 h，在保證其他發(fā)酵條件相同的情況下，每組重復(fù)3 次，測定李子發(fā)酵物中的多酚含量，篩選出能夠顯著提升多酚含量的菌母菌發(fā)酵溫度。

1.4.7.4 pH 對李子多酚提取量的影響

將優(yōu)選出的酵母菌菌株按照最佳配比組合，稱取50 g 李子凍果共5 份，經(jīng)解凍、破碎、打漿制成漿液，用NaOH 溶液分別調(diào)節(jié)pH 值至4.6、5.0、5.4、5.8 及6.2，將組合后的酵母菌菌懸液按照最佳接種量接種，在優(yōu)選溫度下培養(yǎng)48 h，在保證其他發(fā)酵條件相同的情況下，每組重復(fù)3 次，測定李子發(fā)酵物中的多酚含量，篩選出能夠顯著提升多酚含量的酵母菌發(fā)酵pH。

1.4.8 正交試驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素條件篩選的試驗結(jié)果，利用正交分析法設(shè)計發(fā)酵法提李子多酚的實驗方法，選取菌株配比、接種量、溫度和pH 為影響李子多酚的發(fā)酵優(yōu)化的因素，設(shè)計L9（34） 正交表，優(yōu)化工藝參數(shù)，評估各單因素對發(fā)酵物中李子多酚含量影響的主次作用，確認(rèn)最佳工藝條件。

自變量選取菌株配比、接種量、溫度和pH，分別用A、B、C 和D 表示，用1、2、3 分別代表3 個水平，正交試驗因素水平表見表3。

表3 正交試驗設(shè)計因素及水平Table 3 Orthogonal test design factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用福林- 酚比色法，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y＝0.001 45x+0.019 38，R2＝0.995 99。

2.2 酵母菌發(fā)酵對李子多酚含量影響

2.2.1 不同酵母菌株對李子多酚含量的影響

不同酵母菌株對李子多酚含量的影響如圖2 所示。與發(fā)酵對照組相比，經(jīng)漢遜德巴利酵母、馬克斯克魯維酵母和谷胱甘肽酵母發(fā)酵后，發(fā)酵物中李子多酚含量有所提高，而經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后，發(fā)酵物中李子多酚含量變化不明顯，而經(jīng)過魯氏酵母發(fā)酵后，發(fā)酵物中李子多酚含量有所降低。最終，選取漢遜德巴利酵母、馬克斯克魯維酵母及谷胱甘肽酵母做為后續(xù)發(fā)酵的酵母菌菌株。

圖2 不同酵母菌株對李子多酚含量的影響Fig.2 Effect of different yeast strains on the polyphenol content of plums

2.2.2 酵母菌株組合對李子多酚含量的影響

酵母菌株組合對李子多酚含量的影響如圖3 所示，與發(fā)酵對照組相比，經(jīng)漢遜德巴利酵母菌株馬克斯克魯維酵母菌株組合、漢遜德巴利酵母菌株與馬克斯克魯維酵母菌株組合、漢遜德巴利酵母菌株與谷胱甘肽酵母菌株組合發(fā)酵后，發(fā)酵物中的李子多酚含量均有提高，其中，經(jīng)漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌株發(fā)酵后，發(fā)酵物中李子多酚含量提高最多，因此選取漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌株用于后續(xù)單因素試驗。

圖3 酵母菌株組合對李子多酚含量的影響Fig.3 Effect of yeast strain combinations on the polyphenol content of plums

2.3 單因素實驗結(jié)果分析

2.3.1 酵母菌菌株配比對李子多酚提取量的影響

酵母菌菌株配比對李子多酚提取量的影響如圖4 所示，隨著漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母中漢遜德巴利酵母菌株比例的的增加，發(fā)酵物中李子多酚含量有所增加，但是當(dāng)漢遜德巴利酵母菌株與馬克斯克魯維酵母菌株配比超過2∶1 時，發(fā)酵物中李子多酚含量有下降的趨勢，因此，漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌株的菌株配比應(yīng)控制在2∶1 左右。

圖4 酵母菌菌株配比對李子多酚提取量的影響Fig.4 Effect of yeast strain ratios on the extraction of polyphenols from plums

2.3.2 酵母菌接種量對李子多酚提取量的影響

酵母菌接種量對李子多酚提取量的影響如圖5所示，漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌株組合接種量的從1%增加到7%，發(fā)酵物中李子多酚含量有著明顯的提高，當(dāng)接種量增加到7%時，多酚含量達(dá)到4.669 mg/g，當(dāng)接種量超過7%時，發(fā)酵物中李子多酚含量有下降的趨勢，因此，漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌株的接種量應(yīng)控制在7%左右。

圖5 酵母菌接種量對李子多酚提取量的影響Fig.5 Effect of yeast inoculum on the extraction amount of plum polyphenols

2.3.3 發(fā)酵溫度對李子多酚提取量的影響

發(fā)酵溫度對李子多酚提取量的影響如圖6 所示，發(fā)酵溫度在22 ～31 ℃時，發(fā)酵物中李子多酚含量逐漸上升，當(dāng)發(fā)酵溫度到達(dá)31 ℃時，李子多酚含量達(dá)到最大4.824 mg/g，當(dāng)發(fā)酵溫度超過31℃時，發(fā)酵物中李子多酚含量有明顯下降，可能的原因是發(fā)酵溫度過高影響了菌株的活性。因此，漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌株的發(fā)酵溫度應(yīng)控制在31 ℃左右。

圖6 發(fā)酵溫度對李子多酚提取量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the extraction amount of plum polyphenols

2.3.4 發(fā)酵pH 對李子多酚提取量的影響

發(fā)酵pH 對李子多酚提取量的影響如圖7 所示，發(fā)酵pH 在4.6 ～5.4 時，發(fā)酵物中李子多酚含量逐漸上升，當(dāng)發(fā)酵pH 為5.4 時，李子多酚含量達(dá)到最大4.992 mg/g，當(dāng)發(fā)酵pH 超過5.4 時，發(fā)酵物中李子多酚含量有明顯下降。因此，漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌株的發(fā)酵pH 應(yīng)控制在5.4 左右。

圖7 發(fā)酵pH對李子多酚提取量的影響Fig.7 Effect of fermentation pH on the extraction amount of plum polyphenols

2.4 正交試驗法優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)實驗設(shè)計得出的實驗結(jié)果見表4。

表4 正交試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析Table 4 Orthogonal test design and data analysis

由正交試驗結(jié)果可知，影響發(fā)酵物中李子的多酚含量的的因素主次關(guān)系為D＞B＞C＞A，即4 個因素中對發(fā)酵物中李子的多酚含量影響最大的為pH，其他依次是接種量、溫度和菌株配比。各因素的最佳的水平組合為A2B2C3D2，即漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌菌株配比為2∶1，接種量為7%，發(fā)酵pH 值為5.4，發(fā)酵溫度為31 ℃的條件下，李子發(fā)酵物中的多酚含量最高。

3 結(jié) 語

本文以李子為原料，通過對漢遜德巴利酵母菌株、馬克斯克魯維酵母菌株、谷胱甘肽酵母菌株、釀酒酵母及魯氏酵母酵母菌株酵母菌菌株的篩選，篩選出了可以提高李子多酚含量的漢遜德巴利酵母菌株、馬克斯克魯維酵母菌株和谷胱甘肽酵母菌株。通過兩兩組合，優(yōu)選出漢遜德巴利酵母菌株和馬克斯克魯維酵母菌株作為后續(xù)發(fā)酵工藝優(yōu)化的菌株組合。通過單因素實驗法，并采用正交試驗法優(yōu)化了發(fā)酵工藝，通過酵母菌發(fā)酵后，李子多酚的含量明顯提高，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為漢遜德巴利酵母與馬克斯克魯維酵母菌菌株配比為2∶1，接種量為7%，發(fā)酵pH 值為5.4，發(fā)酵溫度為31 ℃。本研究為李子多酚產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)和資源利用提供了依據(jù)。