時佳園,馬 達,顧佳蕙,秦 笙,2,汪生鵬,2,張國政,2,李木旺,2,孫 霞,2,*

(1.江蘇科技大學生物技術學院,江蘇鎮(zhèn)江 212018;2.中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所,江蘇鎮(zhèn)江 212018)

在真核生物中，RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein,RBP)是基因表達過程中重要調(diào)控因子，主要參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯過程。ELAV/Hu(embryonic lethality abnormal vision system/human)家族是一類高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在多細胞生物的神經(jīng)系統(tǒng)中表達。該家族編碼基因elav首次在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中被發(fā)現(xiàn)(Camposetal.,1985)，隨后在多種生物中被發(fā)現(xiàn)(Sunetal.,2021;Hilgers,2022)。

雙翅目黑腹果蠅ELAV/Hu家族包括ELAV,RBP9和FNE，三者均含有3個RNA識別基序(RNA recognition motifs,RRMs)。ELAV和FNE表達于神經(jīng)系統(tǒng)中，前者分布于細胞核中，后者分布于細胞質(zhì)中，二者的表達貫穿黑腹果蠅的整個發(fā)育周期(Samson and Chalvet,2003)。RBP9從3齡幼蟲開始表達，存在于成蟲神經(jīng)系統(tǒng)的細胞核和卵子發(fā)生時包囊細胞的細胞質(zhì)中(Kim-Haetal.,1999)。ELAV在黑腹果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與分化、選擇性剪接中具有重要調(diào)控作用(Lisbinetal.,2001;Simionatoetal.,2007)。ELAV能夠結(jié)合在pre-mRNA的3′內(nèi)含子和自身3′UTR，參與靶標基因和自我表達調(diào)控(Lisbinetal.,2001;Borgeson and Samson,2005)。ELAV功能完全缺失會導致胚胎致死。FNE在蘑菇體(mushroom body)發(fā)育、神經(jīng)突觸形成、交配行為中具有重要調(diào)控作用(Zaninietal.,2012;Olesnickyetal.,2014)。研究發(fā)現(xiàn)FNE蛋白表達水平受性別決定因子SXL(sex lethal)的調(diào)控，而不受TRA(transformer)和TRA2(transformer 2)的調(diào)控(Sunetal.,2015)。RBP9在卵巢發(fā)育分化、血腦屏障形成和RNA穩(wěn)定性中具有重要調(diào)控作用(Kimetal.,2010;Tobaetal.,2010)。RBP9功能缺失導致黑腹果蠅壽命縮短。ELAV,RBP9和FNE通過選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)和最后一個外顯子可變剪接(alternative last exon,ALE)對mRNA 3′UTR長度進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，且三者在黑腹果蠅的生長發(fā)育過程中存在重要的相互作用(Zaharievaetal.,2015;Weietal.,2020;Leeetal.,2021)。

為了進一步了解RBP9蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能，我們首先利用CRISPR/Cas9技術構建了3×Flag標簽與RBP9融合表達的轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅，其次，以此轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅為材料，使用質(zhì)譜法分析了在神經(jīng)系統(tǒng)中與RBP9相互作用的蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果為進一步探索RBP9在黑腹果蠅神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的生物學功能提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 試蟲

黑腹果蠅品系在25℃標準培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)和雜交。利用CRISPR/Cas9技術構建轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅品系3×Flag-RBP9/3×Flag-RBP9 (3FRBP9)和V5-FNE/V5-FNE(VFNE)，分別在RBP9和FNE序列N端編碼序列插入3×Flag和V5標簽編碼序列(Renetal.,2013)。在RBP9和FNE起始密碼子ATG附近分別設計1個sgRNA靶點，其序列分別為：5′-CAGCGTTCGCAAGATGGTCGAGG-3′;5′-AA TCACAATGACCAACGCCATGG-3′(粗體代表起始密碼子)。將sgRNA序列利用酶切方法構建到表達質(zhì)粒pU6a中。在RBP9和FNE起始密碼子ATG后分別插入3×Flag和V5標簽編碼序列，在該位置的上下游分別擴增約1 kb作為供體質(zhì)粒的同源臂，再利用overlap PCR將兩個同源臂序列連接并克隆至pMD-19T載體。pU6a和供體質(zhì)粒的黑腹果蠅胚胎的顯微注射由珠海聯(lián)合華益科技有限公司(UniHuaii)完成，其中胚胎注射的黑腹果蠅為轉(zhuǎn)基因株系nos-Cas9(attP2)，每個基因注射300粒胚胎，注射后胚胎置于正常培養(yǎng)基上于27℃至孵化，之后在正常條件下飼養(yǎng)。單頭G0黑腹果蠅分別與野生型黑腹果蠅進行雜交，雜交后留取G0黑腹果蠅基因組，分別對其利用同源臂、起始密碼子ATG后的標簽編碼序列進行克隆測序(引物序列見表1)，篩選保留序列正確的黑腹果蠅后代，并將其與黑腹果蠅野生型品系(Bloomington no.5905)回交6代，消除潛在的脫靶可能同時獲得遺傳背景均一的轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅。將雜合轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅自交和雜交，分別構建純合個體3FRBP9/3FRBP9(3FRBP9),VFNE/VFNE(VFNE)和V5-FNE/V5-FNE;3×Flag-RBP9/3×Flag-RBP9(VFNE;3FRBP9)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 免疫沉淀

分別收集黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9,VFNE和VFNE;3FRBP9以及野生型品系成蟲頭部各600個，用1 mL裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1% Triton X-100,0.5% NP40,1 mmol/L PMSF和1×Protease Inhibitor(Roche,瑞士)]冰上研磨。超聲破碎。低溫離心后取上清。將上清分別與anti-V5和anti-FLAG M2磁珠(Sigma，美國)孵育。用裂解緩沖液洗滌磁珠4次，去上清后加入50 μL的1×蛋白上樣緩沖液，重懸后煮沸，提取RBP9蛋白。上清樣品使用anti-FLAG(Sigma，美國)單克隆抗體進行Western blot或銀染分析。

1.3 蛋白質(zhì)譜實驗

將1.2節(jié)免疫沉淀得到的3FRBP9和野生型品系成蟲頭部中RBP9蛋白樣品進行免疫沉淀后，洗脫樣品送公司進行蛋白質(zhì)譜分析。使用TripleTOF 5600+Eksigent nanoLC質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(SCIEC,美國)進行質(zhì)譜檢測，分析頭部中RBP9的互作蛋白。整個過程由武漢金開瑞生物工程有限公司(Wuhan GeneCreate Biological Engineering Co.,Ltd.)完成。利用ProteinPilot 4.5軟件和數(shù)據(jù)庫uniprot_Drosophila_melanogaster蛋白測序數(shù)據(jù)(包括43 023條蛋白序列)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)鑒定(2012年7月；AB Sciex，美國)。對鑒定的蛋白結(jié)果進行過濾，肽段Unused Protscore>1.3(可信度≥95%)認為是可信肽段，且保留包含unique peptide≥1肽段的蛋白質(zhì)。

1.4 GO和KEGG富集分析

鑒定的190個與RBP9相互作用蛋白編碼基因的GO和KEGG信息由KOBAS 3.0軟件進行注釋(Xieetal.,2011)，然后使用R包ClusterProfile基于超幾何檢驗進行GO和KEGG富集分析，多重校正方法為BH法，由R包ggplot2進行可視化，富集注釋條目均含3個以上基因且校正后P≤0.05的用作后續(xù)分析(Wuetal.,2021)。富集通路利用hypergeometric/Fisher檢驗進行統(tǒng)計學分析。

1.5 免疫共沉淀

在3FRBP9中鑒定到的與RBP9互作的蛋白質(zhì)中包含ELAV/Hu家族的另外兩個成員FNE和ELAV。利用免疫共沉淀方法檢測RBP9和FNE之間的相互作用。分別收集黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9,VFNE和VFNE;3FRBP9以及野生型品系成蟲頭部各600個，頭部裂解處理同1.2節(jié)，離心后上清分別與anti-FLAG M2磁珠(Sigma，美國)或anti-V5 agarose(Sigma，美國)孵育。樣品洗滌及處理同1.2節(jié)。洗脫樣品使用anti-FLAG(Sigma，美國)和anti-V5(Sigma，美國)單克隆抗體進行Western blott檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9和VFNE的獲得

利用CRISPR/Cas9技術，分別將3×Flag和V5序列插入到RBP9和FME基因的起始密碼子ATG序列下游(圖1:A)。注射的供體質(zhì)粒即修復質(zhì)粒包含插入標簽序列位置的上游和下游各約1 kb片段(圖1:A)。通過篩選和遺傳雜交，最終我們獲得轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅純合個體3FRBP9,VFNE和VFNE;3FRBP9。使用anti-V5和anti-FLAG抗體，經(jīng)Western blot檢測融合蛋白V5-FNE(約39 kD)和3×FLAG-RBP9(約60 kD)分別在3個轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅品系中能夠正確表達(圖1:B)。

圖1 黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9(3Fr),VFNE(Vf)和VFNE;3FRBP9(Vf-3Fr)構建示意圖(A)及Western blot檢測融合蛋白(V5-FNE和FLAG-RBP9)的表達(B)Fig.1 Schematic diagram of construction of transgenic Drosophila melanogaster strains 3FRBP9 (3Fr),VFNE (Vf) and VFNE;3FRBP9 (Vf-3Fr) (A) and the expression of fusion proteins (V5-FNE and FLAG-RBP9) detected by Western blot (B)WT:野生型品系Wild-type strain (Bloomington no.5905).數(shù)字①-⑧為擴增片段引物編號(見表1)，箭頭標示引物方向。Numbers ①-⑧ are the primer numbers (see Table 1) of the amplified fragments.The arrows indicate the primer direction.

2.2 轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9成蟲頭部RBP9免疫沉淀產(chǎn)物質(zhì)譜

利用免疫沉淀和Western blot方法，在轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9成蟲頭部洗脫的兩個樣品E1和E2均能檢測到RBP9蛋白(圖2:A)；同時銀染結(jié)果顯示，與野生型品系相比，轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9兩個洗脫樣品中均有明顯差異條帶(圖2:B，紅色箭頭標示)。

圖2 黑腹果蠅野生型品系(WT)和轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9(3Fr)成蟲頭部中RBP9表達的Western blot(A)和銀染(B)檢測Fig.2 Expression of RBP9 protein in the adult heads of the wild-type strain (WT) and transgenic strain 3FRBP9 (3Fr) of Drosophila melanogaster by Western blot (A) and silver staining (B)E1,E2:洗脫樣品Eluted samples.紅色箭頭標示的是差異蛋白。The red arrows represent the differential proteins.

3FRBP9和野生型品系頭部中RBP9蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，樣品質(zhì)譜產(chǎn)生的二級譜圖數(shù)分別為7 684和3 449個，解析的二級譜圖數(shù)分別為1 743和391個，通過ProteinPilot軟件檢索分析，在3FRBP9和野生型品系中分別鑒定到可能與RBP9相互作用的蛋白質(zhì)分別為220和43個。其中在野生型品系和3FRBP9中鑒定到特異與RBP9相互作用的蛋白分別有13和190個，共有的蛋白質(zhì)有30個。

2.3 與RBP9互作的190個蛋白質(zhì)的功能注釋

GO分析結(jié)果表明(圖3)，190個蛋白質(zhì)編碼基因被注釋為三大類：生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)，主要包括生物學過程類別中的染色質(zhì)組裝或拆卸(chromatin assembly or disassembly)、蛋白質(zhì)-DNA復合物亞基組裝(protein-DNA complex subunit organization)和核小體組裝(nucleosome organization)；細胞組分中的染色質(zhì)(chromatin)、核小體(nucleosome)和DNA包裝復合物(DNA packaging complex)；分子功能中的蛋白質(zhì)二聚化活性(protein dimerization activity)、核糖體結(jié)構成分(structural constituent of ribosome)和含蛋白質(zhì)復合物結(jié)合(protein-containing complex binding)等。同時，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這190個編碼基因主要富集在核糖體(ribosome)、碳代謝(carbon metabolism)、檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán))[citrate cycle(TCA cycle)]和氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)等生物通路(圖4)。

圖4 黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9成蟲頭部中鑒定到的與RBP9互作的190個蛋白編碼基因的KEGG通路分析Fig.4 KEGG pathway analyses of genes encoding 190 proteins interacting with RBP9 in the adult head of transgenic Drosophila melanogaster strain 3FRBP9

2.4 RBP9和FNE的相互作用

免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，利用anti-V5 agarose，RBP9能夠從轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅VFNE;3FRBP9成蟲頭部中被拉下，且能被anti-V5抗體正確檢測(圖5)。同時，利用anti-FLAG磁珠，F(xiàn)NE能夠從VFNE;3FRBP9成蟲頭部中被拉下，且能被anti-FNE抗體正確檢測(圖5)。以上結(jié)果表明RBP9在黑腹果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中與FNE存在直接或間接的相互作用。

3 討論

在本研究中，我們利用免疫印跡和蛋白質(zhì)譜方法在黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9成蟲頭部中鑒定了190個與RBP9相互作用的蛋白質(zhì)。經(jīng)GO注釋和KEGG富集分析，這些蛋白質(zhì)編碼基因主要涉及染色質(zhì)組裝或拆卸、蛋白質(zhì)-DNA復合物組裝、蛋白質(zhì)二聚體化活性、核糖體、碳代謝、三羧酸循環(huán)和氨基酸生物合成等生物學過程或通路(圖3和4)，該結(jié)果表明作為RNA結(jié)合蛋白，RBP9可能在頭部神經(jīng)系統(tǒng)中的基因表達、能量代謝等過程中具有重要的調(diào)控作用。

圖3 黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9成蟲頭部中鑒定到的與RBP9互作的190個蛋白編碼基因的GO功能注釋Fig.3 GO functional annotation of genes encoding 190 proteins interacting with RBP9 in the adult head of transgenic Drosophila melanogaster strain 3FRBP9BP:生物學過程Biological process;CC:細胞組分Cellular component;MF:分子功能Molecular function.

在黑腹果蠅中，ELAV家族包括ELAV,FNE和RBP9。Toba和White (2008)利用酵母雙雜交驗證了三者在體外存在相互作用。該研究組進一步利用黑腹果蠅雜交實驗發(fā)現(xiàn)elav和rbp9間的遺傳相互作用在黑腹果蠅壽命中具有重要作用(Tobaetal.,2010)。在本研究鑒定的與RBP9互作蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)同家族的ELAV和FNE，進而利用免疫共沉淀實驗驗證了RBP9和FNE之間在體內(nèi)存在相互作用(圖5)，該結(jié)果與已報道結(jié)果相一致。由此我們推測該家族3個成員間的相互作用可能在黑腹果蠅生長發(fā)育中具有重要作用，其具體調(diào)控機制有待進一步研究。

圖5 免疫共沉淀法檢測黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系3FRBP9成蟲頭部中RBP9和FNE的相互作用Fig.5 Interaction between RBP9 and FNE in the adult head of transgenic Drosophila melanogaster strain 3FRBP9 detected by immune coprecipitation method1:野生型品系Wild-type strain (Bloomington no.5905);2:VFNE;3:VFNE;3FRBP9;4:3FRBP9.4個品系頭部蛋白樣品分別與anti-V5 agarose和anti-FLAG M2 磁珠孵育；Input和immune coprecipitation樣品分別使用anti-V5和anti-FLAG抗體檢測。Protein samples from the head of four strains were incubated with anti-V5 agarose and anti-FLAG M2 beads,respectively.Input and immune coprecipitation samples were detected using anti-V5 and anti-FLAG antibody,respectively.

RBP9分布于細胞質(zhì)和細胞核中，能夠在不同水平上調(diào)控基因的表達(Kim and Baker,1993;Kim-Haetal.,1999)。在我們鑒定與RBP9相互作用的蛋白中，包含了與基因表達相關的蛋白，如線粒體BSF(bicoid stability factor),Pep(protein on ecdysone puffs),PS(pasilla)和qkr58E-2(quaking related 58E-2)等。BSF能夠結(jié)合bicoid基因的3′UTR以維持其穩(wěn)定性(Braticetal.,2011)。PS,Pep和qkr58E-2均具有RNA結(jié)合活性，并且通過剪接體參與mRNA剪接調(diào)控(Allende and Allende,1995;Martinetal.,2014;Liuetal.,2018)。研究發(fā)現(xiàn)RBP9與poly U序列結(jié)合，調(diào)節(jié)目的RNA的剪接和穩(wěn)定性(Parketal.,1998;Kimetal.,2010)。最近研究報道通過抑制遠端多聚腺苷酸化位點的使用，RBP9可以誘導3′UTR延長(Weietal.,2020)。本研究質(zhì)譜鑒定的蛋白中包含了多聚腺苷酸結(jié)合蛋白[poly(A) binding protein,PABP]和DmelCG13928，前者能夠與靶標mRNA 3′UTR結(jié)合，進而調(diào)控其亞細胞定位(Kamiyamaetal.,2020)；后者可調(diào)控靶標mRNA poly(A)的長度(Khanetal.,2015)。由此我們推測RBP9在3′多聚腺苷化形成中具有重要調(diào)控作用。另外，我們研究鑒定的與RBP9相互作用的蛋白還包括與翻譯相關的蛋白，如真核翻譯起始因子4B(eIF4B)、真核翻譯延伸因子1 α1(eEF1 α1)和真核翻譯延伸因子1γ(eEF1γ)。這些發(fā)現(xiàn)表明RBP9可能與這些蛋白質(zhì)相互作用，共同參與靶標基因的翻譯過程。

編碼RBP9蛋白基因缺失會導致黑腹果蠅運動活動減少，血腦屏障異常，壽命縮短，但導致這些缺陷的機制尚不清楚(Kimetal.,2010)。神經(jīng)系統(tǒng)復雜而有序的活動需要消耗大量的能量(Camandola and Mattson,2017;Rittschof and Schirmeier,2018)。神經(jīng)元中糖原的異常積累導致小鼠和黑腹果蠅神經(jīng)元死亡、運動缺陷和壽命縮短(Duranetal.,2012;Yamadaetal.,2019)。我們的研究鑒定了與RBBP9相互作用的糖原代謝相關、TCA循環(huán)的線粒體蛋白，如糖原合成酶、脂肪酸合成酶1、CG9485、ATPsynbeta、琥珀酰輔酶A合成酶α亞基1、異檸檬酸脫氫酶3a等。這些蛋白質(zhì)在黑腹果蠅的能量代謝中發(fā)揮重要作用(Garridoetal.,2015;Quanetal.,2017)。有研究發(fā)現(xiàn)RBP9與同家族的ELAV和FNE共同參與黑腹果蠅神經(jīng)突觸生長。我們鑒定了Eps-15(epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15)和Chc(clathrin heavy chain)，這兩個蛋白在突觸囊泡循環(huán)中具有重要作用(Kohetal.,2007;Kasprowiczetal.,2008)。這些蛋白的鑒定表明，RBP9可能調(diào)控能量代謝途徑和神經(jīng)突觸發(fā)生中重要基因的表達或者與其中重要蛋白質(zhì)相互作用，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)的活動。

根據(jù)本研究結(jié)果，我們推測，在黑腹果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中RBP9能夠與多種蛋白質(zhì)以直接或間接的方式相互作用，在基因表達多個水平、能量代謝和神經(jīng)突觸發(fā)生的調(diào)控中起著重要作用，該研究為RBP9在黑腹果蠅神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的生物學功能提供了重要的實驗依據(jù)。