王菁菁,胡宏旺,胡瓊波,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院,廣州 510642)

昆蟲在復雜的生存環(huán)境中面臨捕食者和寄生者的挑戰(zhàn)，特別是在幼蟲期，體壁柔軟，容易形成創(chuàng)口，遭受寄生者的入侵。在長期適應(yīng)過程中，昆蟲進化出一套獨特的免疫系統(tǒng)(Kanostetal.,2004;Jiangetal.,2010)。昆蟲依賴先天免疫抵御病原物的侵染，對入侵病原作出迅速且有效的免疫應(yīng)答。雖然將昆蟲免疫分為體液免疫和細胞免疫，但實際二者聯(lián)合作用，精準且快速地識別并殺死入侵病原(Jiravanichpaisaletal.,2006;Sheehanetal.,2018;Eleftherianosetal.,2021)。一旦昆蟲體表形成創(chuàng)口或免疫力下降，即面臨微生物的侵染，免疫識別蛋白發(fā)現(xiàn)病原或異物入侵，就會迅速啟動免疫反應(yīng)，介導凝血、血細胞粘附、吞噬或包囊病原、合成抗菌肽，激活黑化級聯(lián)反應(yīng)等，在傷口處形成凝血塊、促進傷口愈合、防止血淋巴外溢，在血腔中固定和清除病原(Wojda,2017;Yangetal.,2018)。

Hemocytin是昆蟲血淋巴中的重要免疫因子，本質(zhì)上是一種凝集素，由血細胞合成和釋放，是人血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)的同源蛋白，是凝血過程的關(guān)鍵蛋白(Sadler,1998;Springer,2014;Lentingetal.,2015)。Hemocytin能介導血細胞之間的凝集作用，促進對病原的結(jié)節(jié)作用或囊胞化作用，固定和殺滅入侵血腔的病原(Nietal.,2020)。近年來，多種昆蟲hemocytin的蛋白序列和結(jié)構(gòu)被鑒定，在模式昆蟲家蠶Bombyxmori和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中對hemocytin介導的血淋巴免疫分子機理有了更深入的研究。近期，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，hemocytin是一種昆蟲病原真菌次生代謝物-綠僵菌素A的靶標蛋白，預(yù)示hemocytin在殺蟲劑靶點和新型農(nóng)藥研發(fā)中有潛在價值。本文對近些年來關(guān)于昆蟲hemocytin蛋白的研究進展進行綜述，并對昆蟲hemocytin作為殺蟲劑靶點的潛能進行討論和展望，為新型綠色農(nóng)藥的研發(fā)提供新思路。

1 昆蟲hemocytin的蛋白結(jié)構(gòu)與序列比對分析

1.1 Hemocytin的蛋白結(jié)構(gòu)

目前已有多種昆蟲的hemocytin蛋白序列被鑒定，普遍由3 000～4 000個氨基酸組成，是一個巨大的多結(jié)構(gòu)域蛋白，例如家蠶和果蠅hemocytin分別由3 133和3 843個氨基酸組成，分子量分別為343.40和426.42 kD(Kotanietal.,1995;Gotoetal.,2001)。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖1)(Luetal.,2020)，昆蟲hemocytin包含多個重復排列的結(jié)構(gòu)域，包括FA58C(coagulation factor 5 or 8 C-terminal),VWD(von Willebrand factor type D),TIL(trypsin inhibitor like cysteine rich),VWC(von Willebrand factor type C),CT(C-terminal cystine knot-like),C8(8 conserved cysteine residues),ChtBD2(chitin-binding domain type 2)和MUC(mucin-2 protein WxxWrepeating region)，說明hemocytin可能是一個多功能蛋白；并且hemocytin擁有多個二硫鍵和糖基化位點，是其作為凝集素重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 昆蟲hemocytin結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.1 Prediction of hemocytin domains in insects

昆蟲VWD和VWC結(jié)構(gòu)域與人血管性血友病因子VWF的VWD和VWC結(jié)構(gòu)域同源，說明hemocytin能在昆蟲中發(fā)揮凝血效應(yīng)。FA58C結(jié)構(gòu)域，也被稱為discoidin結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能與細胞表面碳水化合物結(jié)合，提示hemocytin能識別外來病原物表面的模式分子，例如細菌和真菌細胞壁成分葡聚糖等，也說明hemocytin可能是一種模式識別蛋白。TIL結(jié)構(gòu)域通常含有10個半胱氨酸殘基，能形成5個二硫鍵；部分含有TIL結(jié)構(gòu)的蛋白酶抑制劑能抑制微生物蛋白酶，提示hemocytin可能有抑菌作用。CT結(jié)構(gòu)域能讓蛋白形成尾尾相連的二聚體，是hemocytin二聚化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；GHB結(jié)構(gòu)域與CT結(jié)構(gòu)域功能一致。ChtBD2和MUC結(jié)構(gòu)域功能未知。

1.2 昆蟲hemocytin蛋白序列比對分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，選取家蠶、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、斜紋夜蛾Spodopteralitura、菜粉蝶Pierisrapae、煙粉虱Bemisiatabaci、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、桔小實蠅Bactroceradorsalis、紅火蟻Solenopsisinvicta的hemocytin的氨基酸序列，進行多序列比對。在鱗翅目昆蟲中，hemocytin蛋白氨基酸序列一致性在60%以上，在不同目昆蟲中hemocytin氨基酸序列一致性僅為35%左右，說明hemocytin在進化過程中可能根據(jù)環(huán)境病原物的不同，或不同昆蟲hemocytin介導的免疫調(diào)節(jié)機制不同而產(chǎn)生了功能分化，導致親緣關(guān)系較遠的昆蟲hemocytin序列相似性較小。根據(jù)圖1的結(jié)構(gòu)域預(yù)測也能發(fā)現(xiàn)，不同昆蟲hemocytin結(jié)構(gòu)域構(gòu)成具有一定的差異，比如煙粉虱則不具有FA58C結(jié)構(gòu)域，家蠶、煙粉虱和桔小實蠅不具有ChtBD2結(jié)構(gòu)域等。

在碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域FA58C中(圖2)，鱗翅目昆蟲具有多個保守區(qū)域，而在不同目昆蟲中僅存在個別保守的氨基酸，該結(jié)構(gòu)域的分化可能與昆蟲所處的環(huán)境、接觸的病原不同有關(guān)，識別病原不同導致FA58C的序列出現(xiàn)分化。VWD結(jié)構(gòu)域中存在于哺乳動物凝血因子VWF中，與凝血作用有關(guān)，鱗翅目昆蟲VWD結(jié)構(gòu)域的相似性很高，存在許多保守的序列，不同目昆蟲中也存在部分保守序列，說明VWD結(jié)構(gòu)域介導的凝血功能在進化中并未出現(xiàn)很大的分化，出現(xiàn)的分化可能與不同昆蟲血腔免疫的組成和功能的不同有關(guān)，導致VWD介導的凝血功能有差異。在TIL結(jié)構(gòu)域中(圖2)，鱗翅目TIL結(jié)構(gòu)域存在明顯的保守區(qū)域，而不同目昆蟲僅個別保守的氨基酸殘基，特別是半胱氨酸殘基，可能是hemocytin形成分子內(nèi)二硫鍵或多聚體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖2 昆蟲hemocytin蛋白結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of hemocytin domains in insectsA:von Willebrand factor type D(VWD)結(jié)構(gòu)域von Willebrand factor type D (VWD) domains;B:Coagulation factor 5 or 8 C-terminal (FA58C)結(jié)構(gòu)域Coagulation factor 5 or 8 C-terminal (FA58C)domain;C:Trypsin inhibitor like cysteine rich (TIL)結(jié)構(gòu)域Trypsin inhibitor like cysteine rich (TIL) domain.蛋白GenBank登錄號和其來源物種GenBank accession numbers of proteins and their origin species:NP_001104817.1:家蠶Bombyx mori;XP_037973765.1:小菜蛾P(guān)lutella xylostella;XP_022819319.1:斜紋夜蛾Spodoptera litura;XP_015839050.1:赤擬谷盜Tribolium castaneum;XP_011204691.1:桔小實蠅Bactrocera dorsalis;XP_011156310.2:紅火蟻Solenopsis invicta;XP_022121224.2:菜粉蝶Pieris rapae;XP_018902084.1:煙粉虱Bemisia tabaci.

2 Hemocytin的合成與功能

Hemocytin由血細胞合成和釋放，其功能研究集中在模式生物果蠅和家蠶中，目前還處于現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)階段，其分子機理缺乏深入研究。

2.1 合成與分泌

Hemocytin在血細胞中合成，在其他組織器官如脂肪體或腸道中均檢測不到表達。在果蠅中，hemocytin由漿細胞和晶體細胞合成，在板層細胞中不表達(Gotoetal.,2003;Leschetal.,2007)；在家蠶中，hemocytin僅在粒細胞中合成(Araietal.,2013)。Hemocytin儲存在細胞的顆粒中，以脫粒的方式釋放至血淋巴中(圖3)。主要以二聚體形式存在，少數(shù)為單體形式(Gotoetal.,2001)。被釋放的hemocytin是經(jīng)蛋白酶在VWD-C8-TIL與下一個TIL間切割的成熟形式(家蠶和果蠅成熟hemocytin分子量分別為280和300 kD)，在血淋巴中呈不溶型絮狀，形成纖維結(jié)構(gòu)凝集血細胞與血漿蛋白。

圖3 Hemocytin介導的凝血功能Fig.3 Hemocytin-mediated coagulationTG:谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶Transglutaminase;PPO:酚氧化酶原Prophenoloxidase.

2.2 凝血作用

昆蟲具有開放的循環(huán)系統(tǒng)，一旦表皮破損，面臨血淋巴外溢和微生物的入侵風險。凝血作用是節(jié)肢動物重要的免疫防御機制，可以迅速形成二級屏障，在限制血淋巴損失和啟動傷口愈合方面至關(guān)重要(Theopoldetal.,2004;Dushay,2009;Cerenius and S?derh?ll,2011)。Hemocytin是凝血過程(圖3)中的重要因子，是凝血栓的主要成分，缺失hemocytin的昆蟲凝血功能嚴重受損，不易形成凝血栓，而喪失過多的血淋巴，也更容易被微生物侵染(Gotoetal.,2003;Leschetal.,2007;Changetal.,2012)。由于昆蟲體積小，血淋巴難以獲取，目前初步明確凝血過程以及其中關(guān)鍵因子的相互作用，但是其背后的調(diào)控機理未知。凝血過程首先是血細胞的脫?；蚪怏w，包括hemocytin的釋放，導致血細胞和細胞外基質(zhì)形成軟凝塊，負責密封傷口；其次聯(lián)合酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)活化通路和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TG)的交聯(lián)作用產(chǎn)生硬凝塊；最后血細胞緊貼血塊，將其與血淋巴分離，形成結(jié)痂(Dushay,2009)。Hemocytin是軟凝塊形成的關(guān)鍵因子，形成纖維結(jié)構(gòu)凝聚血細胞、其他凝血因子和細胞外基質(zhì)，甚至捕獲和固定微生物(Lietal.,2002;Bidlaetal.,2005)。Hemocytin能與其他凝血蛋白相互作用，固定各因子在傷口處形成凝血塊，例如凝溶膠蛋白(gelsolin)、載脂蛋白(lipophorin)、儲藏蛋白(storage protein)等；能與具有交聯(lián)作用的蛋白相互作用，將各凝血組分交聯(lián)形成硬化的凝血栓，例如PPO,TG和peroxidasin (Karlssonetal.,2004;Scherferetal.,2004;Phillips and Clark,2017)。

Hemocytin介導的凝血作用在昆蟲病原真菌侵染過程中發(fā)揮重要作用。與主要通過消化道入侵的昆蟲病原細菌和病毒不同，蟲生真菌通過機械壓力和分泌蛋白酶直接從體壁入侵至寄主昆蟲血腔中，真菌一旦突破體表屏障造成創(chuàng)口，即面臨凝血作用(Qu and Wang,2018;Islametal.,2021)。研究表明，hemocytin參與病原真菌入侵的感染性損傷凝血，比如球孢白僵菌Beauveriabassiana侵染小菜蛾的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，在真菌侵染的關(guān)鍵時刻(36 h)，小菜蛾hemocytin和其他凝血因子的表達開始上調(diào)(Vidhateetal.,2022)。

2.3 結(jié)節(jié)和囊胞化作用

當一定數(shù)量病原成功入侵至昆蟲血腔中，血細胞介導的結(jié)節(jié)和囊胞化作用對病原固定和清除十分重要。以鱗翅目昆蟲為例，當血淋巴中的模式識別蛋白(pattern recognition protein,PRP)識別到病原時，血細胞立即轉(zhuǎn)變成粘附狀態(tài)，該過程以粒細胞和漿細胞為主，血細胞層層粘附和堆疊在病原物表面，并聯(lián)合黑化反應(yīng)隔絕和殺死微生物(Pech and Strand,1996;Eleftherianosetal.,2021)。其中hemocytin發(fā)揮重要的凝集作用，在血細胞間形成纖維狀的結(jié)構(gòu)凝聚細胞。目前發(fā)現(xiàn)hemocytin能介導大腸桿菌Escherichiacoli、金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae和家蠶微孢子蟲Nosemabombycis等多種病原入侵的結(jié)節(jié)和囊胞化作用(Araietal.,2013;Nietal.,2020)。

Hemocytin在結(jié)節(jié)和囊胞化作用中起到凝聚作用，與凝血過程中的作用一樣，將各要素凝聚到一起，最后聯(lián)合黑化作用隔絕和殺死病原物(圖4)(Shuetal.,2016)。Hemocytin介導各種血細胞粘附至病原處，不僅能形成鞘隔離病原，還能募集血細胞中的各種免疫蛋白，如漿細胞中血淋巴蛋白酶8、絲氨酸蛋白酶同源物，類絳色細胞中的PPO等，促進結(jié)節(jié)形成以及局部黑化反應(yīng)的進行，最后通過窒息作用或產(chǎn)生活性氧等有毒物質(zhì)殺死病原(Tokuraetal.,2004;Tokunagaetal.,2021)。Hemocytin也能凝聚免疫識別蛋白如β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(β-1,3-glucan binding protein,βGRP)、肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)和各種immulectin，這樣的機制能促進被識別病原的及時固定和清除。

圖4 家蠶hemocytin介導的結(jié)節(jié)和囊胞化Fig.4 Hemocytin-mediated nodulation and encapsulation in Bombyx mori

2.4 Hemocytin的互作蛋白預(yù)測

在STRING數(shù)據(jù)庫中，對黑腹果蠅Drosophilamelanogasterhemocytin蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)hemocytin與免疫調(diào)控、器官分化和修復等過程中的蛋白互作，提示hemocytin不僅在昆蟲免疫防御中發(fā)揮作用，還參與了幼蟲的發(fā)育調(diào)控(圖5)。Hemocytin與tiggrin,PPO1,PPO2和peroxidasin在凝血塊中共定位，其中hemocytin與tiggrin主要負責軟凝塊的形成，與PPO和peroxidasin交聯(lián)各種蛋白成為硬凝塊甚至黑化。Hemocytin與Nimrod C1互作、共定位，參與對細菌的吞噬作用。與細胞外基質(zhì)重要成分蛋白papilin互作與共定位，可能在凝血過程發(fā)揮作用。還能與血細胞中特有的蛋白HEMESE共定位，可能在血細胞囊胞化過程中共同發(fā)揮作用。Hemocytin也可能與促進細胞凋亡的croquemort蛋白共定位，參與細胞吞噬作用；也可能與一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白srp共定位，參與脂肪體器官的形態(tài)發(fā)生和分化。也有文獻預(yù)測hemocytin還可能與unpaired 3蛋白互作，參與JAK-STAT通路調(diào)節(jié)受損的血細胞或腸道的修復。

圖5 黑腹果蠅hemocytin蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測Fig.5 Prediction of hemocytin interaction network in Drosophila melanogasterProphenoloxidase 1,2:分別為酚氧化酶酶原1和2，含銅氧化酶，在黑色素等色素的形成中起作用，是黑化反應(yīng)過程的關(guān)鍵酶 Phenoloxidase 1 and 2,respectively,copper-containing oxidases,play a role in the formation of pigments such as melanin and are key enzymes in the process of melanization;Nimrod C1:參與細菌引發(fā)的免疫反應(yīng)，例如吞噬作用 Involvement in bacteria-induced immune responses,such as phagocytosis;Unpaired 3:一種Unpaired家族的細胞因子，Unpaired 3在血細胞或腸損傷時被誘導，激活JAK-STAT通路調(diào)節(jié)這些組織的修復反應(yīng) A cytokine of the Unpaired family,Unpaired 3 is induced in hemocytes or in the intestine upon damage to regulate the repair response in these tissues through JAK-STAT activation;Papilin:影響細胞重組的必要的細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，可能通過調(diào)節(jié)金屬蛋白酶在器官發(fā)生過程中的作用，能非競爭性抑制前膠原蛋白酶 As an essential extracellular matrix protein that influences cell rearrangements,it may act by modulating metalloproteinases during organogenesis,and be able to non-competitively inhibit procollagen N-proteinase;Tiggrin:一種整合素α-PS2/β-PS的配體,對幼蟲肌肉結(jié)構(gòu)和功能起重要作用，參與翅發(fā)育過程中細胞黏附的調(diào)節(jié) A ligand for integrin alpha-PS2/beta-PS,it is required in larvae for proper muscle structure and function,and involved in the regulation of cell adhesion during wing development;Peroxidasin:在細胞外基質(zhì)硬化、吞噬過程發(fā)揮作用 Playing a role in extracellular matrix consolidation,phagocytosis and defense;Box A-binding factor:可能作為轉(zhuǎn)錄激活蛋白，在脂肪體器官發(fā)生中起關(guān)鍵作用，其結(jié)合醇脫氫酶基因的啟動子特殊序列，作為末端間隙基因HKB的下游同源基因促進前、后中腸的形態(tài)發(fā)生和分化 Functioning as a transcriptional activator protein,Box A-binding factor may play a key role in the organogenesis of the fat body,it binds a sequence element found in the larval promoters of all known alcohol dehydrogenase (ADH) genes,and acts as a homeotic gene downstream of the terminal gap gene HKB to promote morphogenesis and differentiation of anterior and posterior midgut;HEMESE:血細胞特有蛋白，參與昆蟲先天免疫反應(yīng)，包括板層細胞分化的負調(diào)控和外源物的囊胞化反應(yīng)Specific protein in hemolymph,involvement in the innate immune response,including negative regulation of lamellocyte differentiation and encapsulation of foreign target;Croquemort:一種清道夫受體B類亞家族蛋白，Croquemort在漿細胞或巨噬細胞中表達，促進凋亡細胞清除，在表皮細胞中它在吞噬體成熟、樹突修剪和損傷中都起作用 A member of the scavenger receptor class B sub-family,Croquemort is expressed in plasmatocyte or macrophages and promotes apoptotic cell clearance,and in epidermal cells it plays a role in phagosome maturation in both dendrite pruning and injury.

3 小結(jié)與展望

Hemocytin介導的血淋巴免疫是昆蟲重要的防御機制，其作為一種特殊的凝集素，介導的凝血作用是昆蟲表皮損傷后的重要免疫屏障，也是防御從體壁直接入侵病原如真菌的高效機制，介導的結(jié)節(jié)和囊胞化是固定和清除入侵病原的重要基礎(chǔ)。但由于昆蟲體積小、血淋巴難以提取等原因，導致凝血、結(jié)節(jié)和囊胞化過程的基礎(chǔ)研究滯后，且hemocytin蛋白分子量大、結(jié)構(gòu)復雜、難以從血淋巴中純化等原因，基礎(chǔ)研究不深入，功能研究僅處于現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)階段。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，一種昆蟲病原真菌金龜子綠僵菌分泌的一種殺蟲毒素-綠僵菌素A能靶向結(jié)合并抑制hemocytin介導的血淋巴免疫功能，提示hemocytin在殺蟲劑靶點和新型農(nóng)藥研發(fā)中有潛在價值。

解析hemocytin蛋白三維結(jié)構(gòu)對其功能研究具有重要意義，但由于hemocytin結(jié)構(gòu)復雜，難以進行表達與純化，至今蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析；雖然人VWF蛋白結(jié)構(gòu)、儲存和分泌方式、調(diào)控凝血機理已明確(Springer,2014;Lentingetal.,2015)，但二者免疫系統(tǒng)組成、蛋白同源性和介導的凝血功能差異較大，僅能為昆蟲hemocytin結(jié)構(gòu)解析和功能研究提供一定參考。

調(diào)控hemocytin合成的信號通路、合成和分泌過程需要被解析。Hemocytin作為一種凝集素，是否具有免疫識別功能，還是僅僅起到橋梁連接的作用。明確hemocytin介導凝血、結(jié)節(jié)和囊胞化的分子機理是昆蟲血淋巴免疫研究的重要補充。前人利用生物化學和分子生物學的手段鑒定了凝血、囊胞化過程中的重要因子，包括hemocytin以及其他蛋白，但蛋白之間的相互作用和調(diào)控方式缺乏深入的研究，其中hemocytin與血細胞的互作研究是空白，hemocytin如何介導血細胞之間的連接，至今未鑒定出相關(guān)的關(guān)鍵因子，本課題組已開展相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)hemocytin能與血細胞骨架組成蛋白互作，似乎對血細胞有支撐作用。

天然產(chǎn)物-靶標模型是研發(fā)新型農(nóng)藥的最佳途徑，發(fā)現(xiàn)化合物在生物體內(nèi)的靶點，并從化合物-靶標的互作模式出發(fā)，研發(fā)新作用方式、新骨架的新農(nóng)藥(Newman and Cragg,2012;Harveyetal.,2015)。昆蟲的免疫系統(tǒng)是一類潛在的殺蟲劑靶標，與哺乳動物的免疫系統(tǒng)不同，昆蟲主要依賴先天性免疫，其組成結(jié)構(gòu)與機理兩者相差遠，關(guān)鍵蛋白同源相似性較小，基于免疫靶點設(shè)計的新藥作用機理新穎，選擇性好。本課題組前期發(fā)現(xiàn)蟲生真菌毒素綠僵菌素A靶向結(jié)合并抑制昆蟲hemocytin的功能，為hemocytin在害蟲防治領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的研究方向。例如hemocytin可作為一種新的RNAi防治害蟲的靶基因，為RNAi農(nóng)藥提供新基因與新研究方向；深入研究綠僵菌素A-hemocytin的互作模式，并基于此篩選出更多新穎的化合物，為新農(nóng)藥研發(fā)提供先導藥物。