王晨虹，商燁，周蕊，李麗，文佳珂，李晉，何俊，常艷旭

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥化學(xué)與分析實驗室，天津 301617）

中藥川木香為菊科川木香屬植物川木香Vladimiria souliei（Franch.）Ling或灰毛川木香 V.souliei（Franch.）Ling var.cinerea Ling 的干燥根，主產(chǎn)于四川、重慶等地[1]，具有行氣止痛的功效，臨床上常用來治療胸脅、脘腹脹痛、腸鳴腹瀉、肝膽疼痛等癥[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明川木香具有抗菌、抗胃潰瘍、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽[3-7]等生物活性。川木香的化學(xué)成分主要包括倍半萜內(nèi)酯類、苯丙素類、黃酮類和揮發(fā)油類等[1，7]，其中倍半萜類內(nèi)酯化合物木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯是其主要活性化學(xué)成分，也是2020年版《中國藥典》中川木香的質(zhì)控指標(biāo)成分[7]，具有抗炎、抗胃潰瘍、抗腫瘤、保肝等藥理作用[7-11]，苯丙素類化合物紫丁香苷是川木香中含量較高的成分，具有抗炎、護肝等活性[12-15]。研究發(fā)現(xiàn)，這3種化合物的藥理活性與川木香的藥效作用十分相關(guān)[7，16]，因此有必要建立川木香中紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量分析方法，進而對其進行合理的質(zhì)量控制。

目前，研究報道的川木香的定量分析方法主要是通過高效液相色譜（HPLC）法同時測定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，但是存在HPLC分析時間長等問題[17-19]。超高效液相色譜（UPLC）法具有分析時間短，分離效果佳等優(yōu)點[20-21]。微波提取法作為新興的綠色提取技術(shù)由于其獨特的加熱機制和良好的性能具有高效率、高選擇性、低成本、綠色環(huán)保等眾多優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取[22-24]。本研究采用微波法提取，并通過UPLC法檢測分析，同時測定了22批川木香中的紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，以期為川木香的質(zhì)量評價研究提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 Waters Acquity超高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、自動進樣器、光電二極管陣列檢測器（PDA）和Empower 3色譜工作站（美國沃特世公司）；Multiwave PRO型微波消解儀（奧地利安東帕公司）；ZZ-L6DT型超聲清洗機（天津知著科技有限公司）；功能高速粉碎機（永康市追夢家居有限公司）；MSX（SD EE）型十萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；5453型離心機（德國艾本德）；Milli-Q II型超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 試藥 對照品紫丁香苷（批號：DST190803-012）、木香烴內(nèi)酯（批號：DSTDM003001）、去氫木香內(nèi)酯（批號：DSTDQ004201）均購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%。乙醇為分析純，購自天津市康科德科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，均購自于美國Fisher公司。

22批川木香（C1～C22），均產(chǎn)自四川，由天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院常艷旭教授鑒定為正品，粉碎后過65目篩，密封保存于陰涼干燥處。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜分離采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18保護柱 （2.1 mm×5 mm，1.8 μm）和Agilent ZORBAX Eclipse Plus XDB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以水（A）-乙腈（B）為流動相，進行梯度洗脫：0～3 min，5%～11.4%B；3～9 min，11.4%～17.8%B；9～15min，17.8%～30.6%B；15～16 min，30.6%～50.4%B；16～19 min，50.4%～50.9%B；19～23 min，50.9%～51.2%B；23～26 min，51.2%～86%B；26～30 min，86%～95%B。柱溫為 35℃，體積流量為0.3 mL/min，進樣體積 2 μL，檢測波長 225 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品適量，加入甲醇，配制成每1 mL分別含紫丁香苷60 μg、木香烴內(nèi)酯400 μg、去氫木香內(nèi)酯720 μg的混合對照品溶液，并密封于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取川木香粉末50 mg，按液料比 80∶1（mL/g）加入甲醇 4 mL，在400 W功率下微波提取2 min，取出放涼至室溫，離心（13 159 g，10 min），取上清液過 0.22 μm 有機微孔濾膜，取續(xù)濾液用于UPLC分析。

2.3 微波提取川木香條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑種類的考察 精密稱取川木香粉末100 mg于微波萃取管中，分別加入10 mL甲醇、乙醇、乙腈、水作為提取溶劑，于700 W微波下提取10 min，取出放涼至室溫后離心（13 159 g，10 min），取上清液經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾，平行實驗3次，UPLC進樣分析，結(jié)果由軟件SPSS 26進行方差（ANOVA）分析。如圖1A所示，當(dāng)以甲醇作為提取溶劑時，紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的總峰面積最高，因此提取溶劑選擇甲醇。

2.3.2 提取溶劑濃度的考察 控制微波提取其他條件不變，考察提取溶劑濃度100%、75%、50%、25%甲醇、水對川木香中木香烴內(nèi)酯、紫丁香苷和去氫木香內(nèi)酯的提取效果。結(jié)果如圖1B所示，以甲醇作為提取溶劑時，3種目標(biāo)化合物的總峰面積最高且具有顯著性，故選擇100%甲醇作為提取溶劑。

2.3.3 微波提取功率的考察 微波提取操作同上，保持其他因素一致，考察微波功率200、400、600、800、1 000、1 200 W對提取川木香中3種目標(biāo)成分的影響。結(jié)果如圖1C所示，當(dāng)微波以400 W功率進行提取時，紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的總峰面積最高，因此微波提取功率設(shè)定為400 W。

2.3.4 提取時間的考察 考察提取0、2、5、10、15、20 min時，微波提取紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取效果。結(jié)果如圖1D所示，微波提取川木香 2、5、10、15 min 時，3 種目標(biāo)化合物的總峰面積沒有顯著性差異，為降低能耗，所以微波提取時間定為2 min。

2.3.5 液料比的考察 按照液料比200∶1、100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1（mL/g）分別加入提取溶劑甲醇20、10、8、6、4、2 mL，對川木香進行微波提取，計算紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的提取率。結(jié)果如圖 1E 所示，液料比為 100∶1（mL/g）和 80∶1（mL/g）時，木香烴內(nèi)酯、紫丁香苷和去氫木香內(nèi)酯的總提取率高于其余液料比下3種目標(biāo)化合物的總提取率，故為減少有機溶劑消耗，料液比選擇80∶1（mL/g）。

圖1 微波提取川木香各因素的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of microwave extraction factors of vladimiriae radix

2.3.6 方法比較 隨機選取6批川木香樣品分別進行微波提取和超聲提取，UPLC分析測定。其中超聲提取法來源于2020年版《中國藥典》[25]，精密稱取川木香粉末50 mg，加入甲醇4 mL，密封放置過夜，超聲30 min（180 W/40 kHZ），放涼至室溫后測定分析。結(jié)果如圖2所示，微波提取的3種指標(biāo)成分的溶出率均高于超聲提取，且微波提取法所用時間更短，效率更高，所以微波提取川木香優(yōu)于傳統(tǒng)的超聲提取。

圖2 川木香微波提取與超聲提取對比圖Fig.2 Comparison of microwave extraction and ultrasonic extraction of vladimiriae radix

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系、檢測限及定量限 取混合對照品溶液，用甲醇稀釋成一系列濃度，用UPLC測定各色譜峰峰面積。以對照品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，色譜峰峰面積為Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別定義為信噪比（S/N）為3和10時的化合物濃度。紫丁香苷，木香烴內(nèi)酯，去氫木香內(nèi)酯的回歸方程分別為：Y=26944X+2322.1 （r2=0.9999），Y=13 653X+13 665（r2=0.999 9），Y=8 188.3X+14 581（r2=0.999 9），線性范圍分別為 0.937 5～60 μg/mL，6.25 ～400 μg/mL，11.25 ～720 μg/mL，LOD 分 別 為0.050 μg/mL，0.215 μg/mL，0.190 μg/mL，LOQ 分 別為 0.200 μg/mL，0.860 μg/mL，0.760 μg/mL。

2.4.2 精密度實驗 取配制的60 μg/mL紫丁香苷，400 μg/mL 木香烴內(nèi)酯，720 μg/mL 去氫木香內(nèi)酯混合對照品溶液作為高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇進行稀釋制備中濃度、低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。每種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進樣6針，分別計算各濃度下3種目標(biāo)化合物準(zhǔn)確度的RSD值作為日內(nèi)精密度的表征。連續(xù)重復(fù)3 d，分別計算3種化合物3 d間準(zhǔn)確度的RSD值作為日間精密度的表征。結(jié)果如表1所示，該方法下紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯高、中、低濃度的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于3%，表明該方法精密度良好。

表1 3種目標(biāo)化合物的日內(nèi)日間精密度、24 h穩(wěn)定性及其準(zhǔn)確度（n=6）Tab.1 Intra-day and inter-day precision and 24 h stability and accuracy of three target compounds(n=6)

2.4.3 重復(fù)性實驗 精密稱取川木香粉末6份，每份50 mg，采用優(yōu)化的微波提取法平行制備供試品溶液，UPLC進樣分析。記錄紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰面積，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量，用其含量的RSD值作為重復(fù)性的表征。結(jié)果：紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量的RSD值分別為 2.65%、2.71%、2.45%，均小于 3%，表明所建立方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（高、中、低濃度）分別在 0、2、4、6、8、12、24 h 定時進樣分析，計算3種目標(biāo)化合物準(zhǔn)確度的RSD值。結(jié)果如表1所示，紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯高中低濃度的穩(wěn)定性RSD值介于范圍1.47%～2.45%，表明川木香樣品溶液中的3個目標(biāo)成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密稱取川木香樣品粉末6份，每份25 mg，置于微波內(nèi)襯管中，加入定量的紫丁香苷，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯（加入的對照品量為25 mg藥材中含有的3種成分的量），用甲醇補足提取溶液體積至4 mL，搖勻，采用微波提取法平行制備樣品溶液，并進行UPLC分析測定，計算回收率。紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的平均回收率分別為 101.79%，101.91%，102.23%，平均回收率 RSD 分別為 1.73%，1.28%，0.89%，平均回收率介于范圍 101.79%～102.23%，且 RSD＜3%，表明該方法加樣回收率結(jié)果良好，方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 含量測定 取收集的22批川木香藥材，精密稱取粉末50 mg，進行微波提取，并通過UPLC分析測定，每個樣品重復(fù)3次。色譜圖如圖3所示，紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯分離度良好。3種成分的含量測定結(jié)果見表2。

表2 川木香樣品中3種成分含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Determination results of the content of three components in vladimiriae radix samples(mg/g，n=3)

圖3 超高效液相色譜圖Fig.3 UPLC chromatogram

3 討論

微波提取法是基于提取物質(zhì)細胞內(nèi)的水等極性分子吸收微波后，兩個偶極在外部電場的作用下震蕩釋能，從而產(chǎn)生大量迅速劇烈的分子間超高速運動，摩擦碰撞產(chǎn)生了熱能，致使細胞內(nèi)的溫度迅速升高，內(nèi)部壓力也隨之增大，沖破細胞膜和細胞壁，促進細胞內(nèi)成分的流出。這是一種由內(nèi)而外的加熱，具有溶劑用量少、所需溫度低、提取效率高、提取時間短、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點，目前廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效成分的提取[26-27]。本研究采用微波法提取川木香中的紫丁香苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，提取時間僅需要2 min，與文獻報道的回流提取法和超聲提取法比[19，28]，大大縮短了提取時間，提高了提取效率。另外，在檢測方法上，本實驗采用UPLC梯度洗脫，UPLC法相比于HPLC法分析時間更短，梯度洗脫使川木香中的各成分峰分離度良好，既滿足了3種目標(biāo)成分定量的要求，又為后續(xù)建立川木香的指紋圖譜，開展其譜效學(xué)研究提供了較好的分析方法。

本研究首次采用微波提取結(jié)合UPLC分析測定了22批川木香中紫丁香苷，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，含量測定結(jié)果表明市場上的川木香中3種化學(xué)成分的含量存在較大差異，因此為保證臨床用藥藥效的專一性，有必要進一步加強川木香藥材的質(zhì)量控制，而本實驗建立的提取分析方法穩(wěn)定可靠，高效快速，為此提供了技術(shù)支持。