白璐，陳志強

（1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院腎內科，石家莊 050051；2.河北中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內二科，石家莊 050011）

蛋白尿是糖尿病腎?。―N）主要的臨床表現(xiàn)，亦是腎小球濾過屏障受損的重要標志。腎小球濾過屏障由內皮細胞、腎小球基底膜（GBM）及足細胞組成，其結構和功能的改變是蛋白尿產(chǎn)生的病理生理基礎[1-3]。足細胞貼附于GBM表面，是一種終末分化的多突狀細胞，是維持整個腎小球濾過膜正常通透性的主要成份，其損傷及脫落對于蛋白尿的形成具有重要作用[4]。有研究表明DN患者從尿中丟失的足細胞數(shù)與患者的尿蛋白量呈正相關關系[5-6]，說明足細胞對GBM的黏附失常造成其脫落，是DN蛋白尿發(fā)生的主要原因之一。α3β1整合素是介導足細胞與基底膜連接的膜蛋白，主要對足細胞的黏附功能起作用，使足細胞黏附于GBM的Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白上，其表達量的改變會使足細胞與GBM的黏附性下降，出現(xiàn)足細胞脫落，表明其與足細胞數(shù)量的丟失及蛋白尿的多少密切相關[7]。腎母細胞瘤抑制基因（WT1）是足細胞特異性標志基因，可以標記足細胞核數(shù)量，有研究報道DN足細胞損傷與WT1在腎臟的表達量下降有緊密關系[8]，隨著DN足細胞損傷脫落的發(fā)展，WT1在腎臟的表達量也明顯下降。

隨著瘀血阻絡理論在DN發(fā)病中的重要作用進一步被認可，化瘀通絡中藥在治療DN時成為組方中必要的組成部分，前期研究證實該類中藥治療DN蛋白尿療效確切，能減輕DN大鼠腎臟纖維化、保護足細胞、抑制腎臟氧化應激、減輕炎癥反應[9-12]。此本研究意在探討化瘀通絡中藥能否通過干預α3β1整合素的表達減少足細胞脫落從而減少蛋白尿，以期為化瘀通絡中藥在臨床上的推廣應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體質量（120±20）g，購買于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2018-1-004。

1.2 藥物 化瘀通絡中藥顆粒劑：丹參（1.8 g/袋，相當于飲片 10 g，批號 501306T）、川芎（1.3 g/袋，相當于飲片 6 g，批號 412272T）、水蛭（1.5g/袋，相當于飲片 3 g，批號 408245T）、地龍（1.0 g/袋，相當于飲片 10 g，批號 501153T）、全蝎（1.0 g/袋，相當于飲片3 g，批號412299T），廣東一方制藥有限公司惠贈。厄貝沙坦片（0.15g/片，批號 4A293），由賽諾菲（杭州）制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑儀器 鏈脲佐菌素（STZ，Enzo公司，貨號04081408），TRIquick Reagent（北京Solarbio公司，貨號：R1100），F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司，貨號：KR202）、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（美國 invitrogen公司，貨號：11733046），引物（上海生工生物工程公司），腦脊液與尿蛋白測定試劑盒（終點法，北京利德曼生化股份有限公司，貨號：2400134），兔多克隆抗體Integrin α3（ITGA3，武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA0955），兔多克隆抗體 Integrin β1（ITGB1，北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-0486P），兔多克隆抗體WT1（美國ABclone公司，貨號：A2446）。穩(wěn)豪型血糖儀（強生有限公司），NanoDrop2000C紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司），Eco實時定量PCR儀（美國illumina公司），BX63+DP72正置研究級顯微鏡（日本OLYMPUS株式會社），MICROM-340E石蠟切片機（德國Zeiss公司）。

1.4 造模、分組和給藥 健康雄性SD大鼠40只，適應性飼養(yǎng)1周。隨機選取8只大鼠為正常組（C組），給予普通飼料飼養(yǎng)，剩余32只大鼠給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)（由河北醫(yī)科大學實驗動物中心加工制作），飼養(yǎng)6周后所有大鼠禁食不禁水12 h，按35 mg/kg腹腔注射1%STZ溶液，72 h后尾靜脈取血檢測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠（DM）模型復制成功。共3只大鼠檢測血糖不達標剔除，將成模大鼠隨機分為模型組（M組）10只，厄貝沙坦組（I組）10只，中藥組（Z組）9只。大鼠成模后給藥干預，按照人用藥的配伍比例及大鼠與人的體表面積計算，化瘀通絡中藥成人口服劑量：丹參15 g，川芎 12 g，地龍 10 g，水蛭 6 g，全蝎 6 g，大鼠每日灌胃給藥劑量為丹參1.41 g/kg，川芎1.12 g/kg，地龍 0.94 g/kg，水蛭 0.56 g/kg，全蝎 0.56 g/kg，厄貝沙坦組以14.12 mg/kg灌胃，連續(xù)給予20周。

1.5 標本的收集 大鼠灌胃20周末，代謝籠收集24h尿液并測量尿量，尿液離心半徑8 cm，3 000 r/min離心15 min后取上清液，終點法行24 h尿蛋白定量檢測。所有大鼠禁食8 h以10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心后取血清用于血液指標檢測，快速分離腎臟，留取腎皮質用于腎臟病理、實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）、免疫組化（IHC）檢測。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 生化指標檢測 尿蛋白濃度采用終點法檢測，尿蛋白濃度×24 h尿量得出24 h尿蛋白總量（24 h UTP）。所有大鼠禁食8 h尾靜脈采血檢測空腹血糖（FBG）。采用BECKMAN CX7全自動生化分析儀按試劑盒操作檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。

1.6.2 光鏡觀察腎臟病理 預冷的FAA固定液固定腎皮質，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度2 μm）、二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化后，蘇木精-伊紅染色（HE）、過典酸雪夫氏染色（PAS），封片，顯微鏡下放大400倍采集圖像。

1.6.3 RT-PCR 檢測 ITGA3、ITGB1、WT1 mRNA 的表達 采用TRIquick提取腎組織總RNA，檢測其濃度及純度，將OD260/OD280比值在1.8～2.0之間的RNA樣品，反轉錄成cDNA，將cDNA放于熒光定量PCR儀擴增。采用Primer 5.0軟件設計引物（引物序列見表1），反應條件為UDG Incubation 50℃2 min、Polymerase Activation 95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃40 s共40個循環(huán)。融解曲線條件：95℃15 s、55℃15 s、95℃15 s，建立融解曲線檢測擴增產(chǎn)物的特異性。數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCq法進行相對定量，以βactin作為內參，正常組設置為對照組，相對表達量（Relative Quantification）=2-ΔΔCq；ΔCq=目的基因 Cq平均值-內參Cq平均值；ΔΔCq=實驗組ΔCq-對照組ΔCq，以均數(shù)±標準差（±s）表示。

表1 大鼠基因引物序列Tab.1 Primers for rat genes

1.6.4 IHC 檢測 ITGA3、ITGB1、WT1 蛋白的表達切取腎組織標本用4%中性甲醛固定液固定，經(jīng)梯度脫水后，石蠟包埋，制作4 μm厚石蠟切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（SP）法檢測，常規(guī)石蠟切片脫蠟，微波修復，切片置于3%H2O2溶液中，PBS沖洗，滴加A液（10%正常山羊血清封閉液），室溫孵育30 min，滴加一抗（ITGA3稀釋比例 1∶100；ITGB1 稀釋比例 1∶200；WT1 稀釋比例1∶200），4℃孵育過夜，沖洗后滴加二抗（B液）37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加C液37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染3 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用BX63+DP72正置研究級顯微鏡閱片觀察并拍片。

1.6.5 腎小球內足細胞密度的檢測 采用WT1-C末端抗體標記足細胞核，IHC檢測WT1的表達，計數(shù)足細胞數(shù)量。BX63顯微成像系統(tǒng)放大400倍采集圖像，應用Cell Sens Dimension軟件采用逐點描繪區(qū)域法測量腎小球面積，計數(shù)腎小球內褐色細胞核數(shù)量即足細胞個數(shù)。以足細胞個數(shù)/腎小球面積，來表示足細胞密度。

1.6.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，若方差齊，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；若方差不齊，采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 C組大鼠毛色光澤，反應靈活，活動自然，飲食飲水量及尿量均正常；M組大鼠毛色晦暗，精神萎靡，體重逐漸下降，并出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿的癥狀，造模后第7周，M組死亡1只，第15周末血糖不達標，剔除1只，第16周死亡1只；Z組大鼠于第10周、第14周各死亡1只，第13周血糖不達標，剔除1只；I組于第6、12、17周各死亡1只。

2.2 各組大鼠FBG、Scr、BUN、24 h UTP的比較 與C組比較，造模各組大鼠FBG明顯升高（P＜0.05）；與M組比較，I組及Z組FBG差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與C組比較，M組大鼠Scr、BUN均明顯升高，與M組比較，各干預組Scr差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Z 組 BUN 顯著低于 M 組（P＜0.05），I組BUN與M組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與I組比較，Z組BUN明顯降低（P＜0.05）；與C組比較，M組大鼠 24UTP明顯升高（P＞0.05），與 M 組比較，Z組及 I組 24UTP 均明顯下降（P＜0.05），與 I組比較，Z組24UTP明顯下降（P＜0.05）。見表2。

表 2 各組大鼠 FBG、Scr、BUN、24 h UTP 的比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG，Scr，BUN，and 24 h UTP in each group of rats（±s）

表 2 各組大鼠 FBG、Scr、BUN、24 h UTP 的比較（±s）Tab.2 Comparison of FBG，Scr，BUN，and 24 h UTP in each group of rats（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，△P＜0.05。

24 h尿蛋白定量（mg/24 h）正常組 4.33±0.51 24.08±4.31 6.89±0.76 6.79±1.38模型組 28.42±3.82* 40.99±9.52*17.76±1.54* 53.04±5.94*厄貝沙坦組 28.78±4.31* 31.73±5.91 16.12±3.02 24.05±2.28#中藥組 29.08±4.18* 32.43±7.87 12.91±3.84#△ 20.65±4.39#△組別 空腹血糖（mmol/L）血肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）

2.3 各組大鼠腎組織病理觀察比較 C組大鼠腎組織可見腎小球、腎小管未見明顯異常；M組大鼠腎組織腎小球肥大，基底膜輕度增厚，系膜細胞和基質增多，腎小囊腔變窄；與M組比較，Z、I組病理改變有一定程度減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織光鏡（上圖HE染色、下圖PAS染色）觀察（×400倍）Fig.1 Kidney tissue observed by light microscopy（HE，PAS staining）of rats in each group（×400）

2.4 各組大鼠腎組織中ITGA 3、ITGB1、WT1 mRNA及蛋白表達的比較 與C組比較，M組ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA的表達均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；與 M 組比較，I、Z 組 ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA 的表達增加（P＜0.05）；與 I組比較，Z 組 ITGB1 mRNA 表達增加（P＜0.05），ITGA3、WT1 mRNA 無明顯差異（P＞0.05）。見表 3。

表3 各組大鼠腎組織ITGA3、ITGB1、WT1 mRNA的比較（±s）Tab.3 Comparison of ITGA3，ITGB1，and WT1 mRNA in each group of rats（±s）

表3 各組大鼠腎組織ITGA3、ITGB1、WT1 mRNA的比較（±s）Tab.3 Comparison of ITGA3，ITGB1，and WT1 mRNA in each group of rats（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與厄貝沙坦組比較，△P＜0.05。

組別 ITGA3 ITGB1 WT1正常組 1.00±0.14 1.00±0.12 1.00±0.08模型組 0.49±0.10* 0.56±0.07* 0.51±0.07*厄貝沙坦組 0.85±0.18# 0.73±0.10# 0.72±0.11#中藥組 0.95±0.15# 0.88±0.16#△ 0.78±0.08#

ITGA3，ITGB1主要分布于腎小球基底膜和系膜基質，少量分布于足細胞胞質中，兩者在C組大鼠腎小球高表達；與C組相比，ITGA3、ITGB1在M組大鼠腎小球表達減少；與M組比較，I、Z組兩者表達增多；WT1是足細胞的特異性蛋白，表達在腎小球中且位于足細胞的細胞核內；與C組相比，M組WT1表達減少；與M組比較，I、Z組WT1表達增多。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織ITGA3、ITGB1、WT1蛋白的表達（×400）Fig.2 Expression of ITGA3，ITGB1，and WT1 protein in kidney tissues of rats in each group（×400）

2.5 各組大鼠腎小球內足細胞密度的比較 與C組比較，M組大鼠足細胞密度顯著減少（P＜0.05）；與M組比較，I、Z組大鼠足細胞密度明顯增加（P＜0.05）；與I組比較，Z組密度明顯增加（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠腎小球內足細胞密度的比較Fig.3 Comparison of podocyte density in the glomeruli of rats in each group

3 討論

DN是一種慢性漸進性疾病，其臨床表現(xiàn)及病理特征隨著病程的延長而逐漸加重，蛋白尿的發(fā)生是DN最明顯的臨床特征，表現(xiàn)為早期微量蛋白尿到臨床期出現(xiàn)大量蛋白尿。腎小球濾過屏障可有效阻止白蛋白等大分子量物質進入尿液，其結構和功能的改變是蛋白尿產(chǎn)生重要的病理基礎。足細胞作為濾過屏障重要的組成部分，覆蓋于GBM的表面，它是腎小球中唯一一種高度終末分化細胞，不能進行正常的細胞分裂，其一但脫落將不可再生。足細胞損傷的表現(xiàn)一方面為足細胞相關蛋白的表達異常；另一方面是形態(tài)變化主要包括足細胞肥大、細胞足突融合、足細胞數(shù)量或密度減少、足細胞凋亡、足細胞上皮-間充質轉分化等[13-14]。有針對DM患者的1項研究，結果顯示足細胞的脫落與DN蛋白尿及腎功能的損害有關[15]。通過腎活檢分析發(fā)現(xiàn)2型DM患者足細胞數(shù)明顯低于正常人，且足細胞密度越小，尿白蛋白的排泄率越大[16]。正常狀態(tài)下，足細胞通過整合素 α3β1、dystroglycans黏附于 GBM 表面保持其結構和功能的完整性，而發(fā)揮濾過屏障的作用，一但足細胞損傷整合素α3β1表達降低，足細胞對GBM的黏附力降低，則會出現(xiàn)脫落。整合素是異質二聚體的穿膜蛋白，由α和β亞基組成，本文主要研究了整合素 α3（ITGA3） 及整合素 β1（ITGB1）在腎臟的表達水平，兩者均是細胞與細胞外基質黏附的受體。α3β1整合素是在體內腎小球發(fā)育過程中唯一發(fā)揮重要作用的整合素，其由足細胞分泌并介導足細胞與GBM的黏附，足細胞主要通過ITGA3、ITGB1被覆于GBM的細胞外基質蛋白上，從而維持腎小球濾過功能的正常[17]。WT1表達于足細胞核，是成熟足細胞的特異性標志蛋白，其對維持成熟的足細胞表型可能是必要的[18]，在腎小球中，WT1只在足細胞核表達，因此WT1可作為計數(shù)足細胞的標記物。

DN可累及約40%的DM患者，一旦出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿，發(fā)生腎損傷，則病情常不可逆轉，直至發(fā)展為終末期腎病。DN發(fā)病機制復雜，其防治目前尚缺乏針對性較強的特效手段?！督饏T要略》云：“病人如熱狀，煩滿，口干燥而渴，其脈反無熱，此為陰伏，是瘀血也，當下之?！庇涊d了瘀血致消渴的病理機制。DM病機在氣陰兩虛，氣虛無力助血運行，血行艱澀致瘀；消渴日久不愈，陰津虛耗，津液虧虛，虛火內生，內熱煎灼陰血而至血瘀；或燥熱之邪煎熬津液，使津虧血稠、血行不暢而致瘀；或病久營衛(wèi)之氣運行不暢，經(jīng)絡失疏而生瘀。因此，隨著DM病程遷延，導致腎絡瘀阻，引起腎小球毛細血管團結構及功能受損，導致蛋白尿的漏出，由此可見DN病機重在瘀血阻絡。據(jù)證立法，依法采方選取了化瘀通絡中藥進行DN干預，其降低蛋白尿及腎臟保護作用也得到前期臨床及動物實驗研究的證實[19-20]。通過多中心隨機臨床試驗發(fā)現(xiàn)化瘀通絡中藥可有效改善Ⅲ、Ⅳ期DN患者的臨床癥狀，降低尿蛋白，調節(jié)脂代謝，保護腎功能，提高患者生活質量。通過對DN大鼠的實驗室檢測發(fā)現(xiàn)化瘀通絡中藥能明顯改善DN大鼠腎臟病理損傷，減少蛋白尿排泄，并且能通過多種信號通路減輕腎臟損傷，改善腎功能。方藥選取丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎進行配伍，意在祛逐腎絡瘀血、改善腎臟循環(huán)、延緩腎臟纖維化、減輕腎臟損傷。現(xiàn)代藥理研究及臨床實驗證明丹參、川芎均具有擴血管、改善DN血液高凝高黏狀態(tài)、降低血小板黏性、抑制血小板活化、改善腎臟微循環(huán)的作用[21]。地龍、水蛭、全蝎皆屬蟲類之品，性善走竄，驅逐腎絡癥瘕，具有擴張毛細血管、改善血液動力學、抗血栓、減少腎臟Ⅳ型膠原表達，減輕腎小球硬化的作用[22-24]。因此本研究就化瘀通絡中藥能否通過干預α3β1整合素表達起到減少足細胞脫落的目的，從而對DN起到腎臟保護作用展開探討。

研究結果顯示，DN大鼠α3β1整合素表達明顯減少，足細胞密度減少，表明α3β1整合素介導了足細胞與GBM的黏附，其表達與足細胞密度呈正相關。通過化瘀通絡中藥的干預能一定程度上對α3β1整合素表達起到良性調節(jié)作用，上調其在腎組織的表達量，減少足細胞脫落個數(shù)，從而起到足細胞保護作用，能夠明顯減少DN大鼠蛋白尿排泄和腎臟病理損傷。由此筆者推測，化瘀通絡中藥也能通過改善足細胞形態(tài)學的變化來達到腎保護作用，該作用機制可能也是化瘀通絡中藥干預DN重要的作用靶點之一。