王彩君 ，宋志會(huì) ，陳瑞 ，陳思宇 ，馮婉瀅 ，呂清波 ，鄂秀輝 ，王怡

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410）

慢性心力衰竭（CHF）是一種因心臟收縮及舒張功能下降，導(dǎo)致心臟排血量不足而誘發(fā)全身組織代謝異常的臨床綜合征，也是器質(zhì)性心臟病發(fā)展的終末階段[1]，主要表現(xiàn)為呼吸困難、疲乏及液體潴留（肺淤血、體循環(huán)淤血及外周水腫）等，因病死率高、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)已成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)[2]。心力衰竭的主要生理病理機(jī)制是血流動(dòng)力學(xué)障礙和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常激活，后者參與并促進(jìn)心肌重構(gòu)，是CHF不斷進(jìn)展惡化的基礎(chǔ)[3]。

加參方是張伯禮院士長期治療輕、中度CHF的經(jīng)驗(yàn)處方，組方以丹參、黃芪為君藥，香加皮、葶藶子、桂枝為臣藥，三七、益母草、陳皮為佐藥。諸藥合用，共奏益氣活血，溫陽利水功效。臨床研究表明，加參方能治療冠心病心力衰竭氣虛血瘀證，改善患者心功能，提高生活質(zhì)量[4-5]。既往研究顯示加參方能通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的過度激活、抑制炎癥、減輕纖維化和減輕水鈉潴留等治療心梗后的CHF[6-9]，并能抑制心肌細(xì)胞凋亡和纖維化[10-12]。

代謝組學(xué)技術(shù)通過對體內(nèi)小分子內(nèi)源性代謝物進(jìn)行定性定量分析，再經(jīng)過多元統(tǒng)計(jì)分析、代謝物鑒定及生物信息解析，發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)記物并探索發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步研究給予藥物治療后生物標(biāo)記物的變化情況，以闡明藥物治療機(jī)制[13]。因此，本研究采用超高液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLCQ-TOF-MS）技術(shù)對CHF大鼠血清及尿液進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究，篩選CHF發(fā)生的潛在代謝標(biāo)志物，構(gòu)建加參方治療CHF的代謝通路，以期從代謝物組學(xué)角度闡釋加參方治療CHF的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 VEVO 3100超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）；3D HISTECH數(shù)字病理掃描儀（濟(jì)南丹吉爾電子有限公司）；Waters ACQUITY UPLC色譜儀，Waters Xevo G2 QTOF/MS質(zhì)譜儀，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國 Waters公司）。

1.2 藥品與試劑 加參方提取物干膏粉由天士力研究院提供，批號：20200801，出膏率約為6.97%，其中丹酚酸B含量為69.4 mg/g，杠柳毒苷含量為1.09 mg/g。伊紅染液、蘇木素染液、馬松（Masson）三色染色液、羧甲基纖維素鈉（北京索萊寶科技有限公司）；NT-proBNP ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；甲醇（色譜純，美國Merck公司）；甲酸（色譜純，Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2016-0006，溫度25℃，濕度50%，12 h晝夜循環(huán)，自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 慢性心力衰竭模型大鼠的制備 采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支法造成心肌梗死后形成CHF模型。將大鼠用5%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板，于大鼠左側(cè)第三和第四肋間開胸，暴露并擠出心臟，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳尖之間、距左心耳下緣2 mm處用5-0結(jié)扎線快速結(jié)扎，隨后立即將心臟恢復(fù)原位，用2-0縫合線縫合。假手術(shù)組操作同模型組，但只穿線不結(jié)扎?？瞻捉M不做任何處理。造模5周后超聲檢測心功能，以左室射血分?jǐn)?shù)（EF）下降到50%以下作為心衰模型成功標(biāo)志。

2.2 分組及給藥 造模5周后，將成模的CHF大鼠根據(jù)EF值和體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，每組9只，分別為模型組（CHF）、加參方組（JSF），另設(shè)假手術(shù)組（Sham）和空白組（Con），每組各10只。根據(jù)前期研究[9]，加參方給藥劑量為6 g/kg生藥量，即本實(shí)驗(yàn)采用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）將加參方提取物干膏粉配制0.041 83 g/mL的藥液，灌胃給藥，模型組、假手術(shù)組和空白對照組同加參方組，均按大鼠體質(zhì)量5 mL/kg給予溶劑0.5%CMC-Na，連續(xù)給藥4周。

2.3 樣本采集 給藥4周后，收集每組大鼠的12 h尿液，4℃條件下，離心半徑10cm，1000rpm/min離心10 min，去除顆粒污染物，后倒取上清，2 500 rpm/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，加入終濃度2 mmol/L硼酸作為防腐劑[14]，-80℃條件下保存。大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血置于含有促凝劑的采血管中，室溫靜置30 min，離心半徑10 cm，4 500 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存待測。大鼠取完血后進(jìn)行心臟灌注，每組隨機(jī)取3～4個(gè)取心臟，置于組織固定液中固定，其余心臟剪取左心室置于凍存管中，液氮凍存，-80℃保存。其中血清和尿液用于代謝組學(xué)研究，組織固定液固定的心臟用于組織病理觀察，液氮凍存的心臟用于生物學(xué)指標(biāo)檢測。

2.4 藥效學(xué)評價(jià)

2.4.1 大鼠心臟功能檢測 分別于造模5周后及取材前用異氟烷麻醉進(jìn)行超聲檢測，檢測大鼠EF、左室短軸縮短率（FS）。

2.4.2 大鼠心肌組織病理學(xué)變化和纖維化變化檢測 將組織固定液固定的大鼠心臟進(jìn)行改刀，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后用石蠟包埋，冷卻后以5 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟至水。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化及病理損傷；Masson染色觀察心肌組織肌纖維及膠原纖維的形態(tài)和分布，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）。

2.4.3 大鼠心肌組織NT-proBNP含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠心肌組織中NT-proBNP水平。先將心臟組織左心室邊緣區(qū)用1×磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿，再參照ELISA劑盒說明書，檢測NT-proBNP含量（ng/mL），同時(shí)采用考馬斯亮藍(lán)法（BCA法）對樣本進(jìn)行蛋白定量，最后計(jì)算心肌組織NT-proBNP相對含量（ng/mg）。

2.5 代謝組學(xué)研究

2.5.1 血清和尿液樣本前處理及質(zhì)控樣品制備 取“2.3”項(xiàng)下-80℃凍存的血清樣本和尿液樣本，4℃解凍，分別進(jìn)行如下操作。

血清樣本：分別取100 μL血清加入300 μL乙腈（1∶3 體積比），渦旋混勻 1min，冰水浴超聲 10min。以4℃，離心半徑10cm，12000rpm/min離心15min，取100 μL上清液至液相內(nèi)插管中待進(jìn)樣分析。

尿液樣本：分別取150 μL尿液，加入150 μL蒸餾水（1∶1體積比），渦旋混勻 1 min，以 4℃，離心半徑 10 cm，12 000 rpm/min，離心 15 min，取 100 μL 上清液至液相內(nèi)插管中待進(jìn)樣分析。

質(zhì)控（QC）樣本：分別吸取4℃解凍后血清樣品和尿液樣品各50 μL，渦旋混勻1 min，使得QC樣本包含了所有樣品的生物學(xué)信息，并分別按照血清樣品和尿液樣品的前處理方法處理QC樣品。

2.5.2 UPLC-Q-TOF-MS分析條件 色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相組成：A 相：0.1%甲酸水；B 相：0.1%甲酸乙腈，血清樣本流速：0.3 mL/min；尿液樣本流速：0.25 mL/min，柱溫：45 ℃，血清樣本進(jìn)樣量：2 μL；尿液樣本進(jìn)樣量：1 μL，采用梯度洗脫。血清梯度洗脫條件為：0～0.5 min，1%B；0.5～2 min，1%～50%B；2～9 min，50%～99%B；9～10 min，99%B；10～10.5 min，99%～1%B；10.5～12 min，1%B。尿液梯度洗脫條件為：0～8.5 min，1%～25%B；8.5～11 min，25%～50%B；11～13 min，50%～99%B；13～14 min，99%B。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源（ESI源），在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析。使用高純氮?dú)庾鳛檩o助噴霧電離與脫溶劑氣體，毛細(xì)管電壓：3.0 Kv，脫溶劑氣流速：800 L/h，錐孔電壓：40 V，錐孔反吹氮?dú)饬魉伲?0 L/h，脫溶劑氣溫度：450℃，電離源溫度：120℃，四極桿掃描范圍：m/z 50～1 000 Da。

2.5.3 方法學(xué)考察 儀器精密度：取同一QC樣本溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次；方法精密度：平行制備6份QC樣本，連續(xù)進(jìn)樣6次；樣本穩(wěn)定性：取同一QC樣本溶液，分別在樣本中間穿插進(jìn)樣分析，然后分別計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值，以RSD＜30%的峰個(gè)數(shù)占所有峰個(gè)數(shù)的百分比大于70%可信，以此評價(jià)儀器穩(wěn)定性，方法精密度和樣本穩(wěn)定性。

2.5.4 數(shù)據(jù)處理和分析 將UPLC-Q-TOF-MS檢測采集的原始數(shù)據(jù)經(jīng) MarkerLynx 4.1（Waters，美國）軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行峰發(fā)現(xiàn)、峰對齊和原始數(shù)據(jù)的峰值濾過，以找出潛在的判別變量，并導(dǎo)出數(shù)據(jù)，包括保留時(shí)間（tR）、質(zhì)荷比（m/z）和峰面積；采用80%原則進(jìn)行數(shù)據(jù)修約，利用“悟空”平臺（https：//www.omicsolution.org/wkomics/main/） 根據(jù) K 近鄰法（KNN）進(jìn)行缺失值填充；導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），篩選VIP＞1的作為候選差異代謝物；使用SPSS 21.0對候選差異代謝物進(jìn)行獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，篩選 VIP＞1，且 P＜0.05 的代謝物作為差異代謝物；利用 HMDB（http：//www.hmdb.ca/） 代 謝 物 數(shù) 據(jù) 庫 和 KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)等信息匹配確認(rèn)代謝標(biāo)志物；利用 MetaboAnalyst 5.0 平臺（https：//www.metaboanalyst.ca/faces/ModuleView.xhtml） 統(tǒng)計(jì)分析模塊繪制熱圖，通過聚類分析進(jìn)一步觀察代謝標(biāo)志物在各組間趨勢，并通過MetaboAnalyst 5.0平臺通路分析模塊，進(jìn)行代謝通路分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行分析，組間兩兩比較若方差齊采用最小顯著差法（LSD），方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 加參方對CHF大鼠心臟功能的影響 超聲檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組EF與FS均顯著降低（P＜0.01）；給藥后，與模型組比較，加參方組 EF 與 FS顯著升高（P＜0.01）。見圖 1。

圖1 加參方對CHF大鼠左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率的影響Fig.1 Effect of Jiashen Prescription on EF and FS of CHF rats

3.2 加參方對大鼠心肌損傷及心肌纖維化的影響 心肌組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示空白對照組與假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞完整、排列整齊、著色均勻，細(xì)胞核、細(xì)胞漿完整，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠可見左心室腔擴(kuò)大（全心橫切面），出現(xiàn)明顯的梗死灶，肌纖維排列紊亂，纖維細(xì)胞增多，心肌細(xì)胞減少、排列紊亂、細(xì)胞間質(zhì)水腫，梗死灶及周圍可見炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，加參方組大鼠心室腔相對縮小，梗死灶相對減小，上述現(xiàn)象減輕。見圖2。

圖2 加參方對CHF大鼠心肌病理損傷的影響（HE，n=3）Fig.2 Effect of Jiashen Prescription on myocardial pathological injury in CHF rats(HE，n=3)

心肌組織進(jìn)行Masson染色，結(jié)果顯示空白對照組和假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞間隙有少量膠原纖維，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常。模型組大鼠左心室前壁可見大量膠原纖維，呈片狀分布，纖維可見明顯腫脹、斷裂，膠原纖維間有殘存的心肌細(xì)胞。與模型組比較，加參方組大鼠膠原纖維面積縮小，膠原纖維間可見排列較整齊的心肌細(xì)胞，見圖3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織心肌CVF明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，加參方組大鼠心肌組織CVF無明顯降低（P＞0.05）。見圖 4。

圖3 加參方對CHF大鼠心肌纖維化變化的影響（Masson，n=4）Fig.3 Effect of Jiashen Prescription on myocardial fibrosis in CHF rats(Masson，n=4)

圖4 加參方對CHF大鼠心肌組織CVF的影響（n=4）Fig.4 Effects of Jiashen Prescription on CVF of myocardial tissue in CHF rats(n=4)

3.3 加參方對CHF大鼠心肌組織NT-proBNP含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織NT-proBNP 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，加參方組心肌組織 NT-proBNP 明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 加參方對CHF大鼠心肌組織NT-proBNP含量的影響（±s）Tab.1 Effect of Jiashen Prescription on NT-proBNP content in myocardial tissue of CHF rats（±s）

表1 加參方對CHF大鼠心肌組織NT-proBNP含量的影響（±s）Tab.1 Effect of Jiashen Prescription on NT-proBNP content in myocardial tissue of CHF rats（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) NT-proBNP（ng/mg）空白組 8 4.78±0.81假手術(shù)組 8 5.30±1.42模型組 7 9.44±1.77**加參方組 8 7.88±1.13#

3.4 代謝組學(xué)結(jié)果

3.4.1 方法學(xué)考察 血清和尿液QC樣本正離子模式下的BPI圖，見圖5。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，血清和尿液樣本的儀器精密度，方法精密度和樣本穩(wěn)定性峰面積的RSD＜30%的比例均大于70%，說明儀器和樣本穩(wěn)定，方法可靠，見表2。

表2 大鼠血清和尿液樣本方法學(xué)考察結(jié)果Tab.2 Methodological investigation results of rat serum and urine samples

圖5 大鼠血清和尿液QC樣本正離子模式下的BPI圖Fig.5 BPI diagram of rat urine QC samples in positive ion mode

3.4.2 CHF大鼠代謝標(biāo)志物鑒定 利用SIMCA 14.1軟件對各組大鼠血清和尿液代謝譜圖所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，首先，用無監(jiān)督的PCA分析剔除異常值，并發(fā)現(xiàn)3個(gè)組不容易區(qū)分，見圖6A、6D。因此，進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA分析可以觀察到3個(gè)組能夠很好的分開，說明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠體內(nèi)內(nèi)源性代謝物發(fā)生改變，給藥后代謝水平區(qū)別于模型組，且趨近于假手術(shù)組，見圖6B、6E。在此基礎(chǔ)上，采用擬合的OPLS-DA分析假手術(shù)組與模型組的差異代謝物，見圖6D、6F。R2Y代表模型的解釋率，Q2代表模型的預(yù)測率，Q2＞0.4，表明模型可靠，該值越接近于1，表明OPLS-DA模型擬合數(shù)據(jù)的效果越好。其中血清 R2Y=0.977，Q2=0.501，尿液R2Y=0.947，Q2=0.465，說明所擬合的模型均可靠。然后篩選出假手術(shù)組和模型組之間VIP＞1且P＜0.05的差異代謝物，根據(jù)HMDB代謝物數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組得到33個(gè)與CHF相關(guān)的血清代謝標(biāo)志物，主要為脂質(zhì)和氨基酸及其衍生物；38個(gè)與CHF相關(guān)的尿液代謝標(biāo)志物主要為氨基酸及其衍生物、長鏈脂肪酸和核苷類；大鼠血清、尿液代謝標(biāo)志物見OSID。

圖6 大鼠血清和尿液樣本PCA和OPLS-DA得分圖Fig.6 PCA and OPLS-DA scores of rat serum and urine samples

3.4.3 加參方對CHF大鼠代謝標(biāo)志物的影響 與模型組比較，加參方組大鼠血清中有21個(gè)代謝標(biāo)志物有回調(diào)趨勢，其中 MG（14：1）、MG（14：0）、MG（16：0）、MG（18：0）、5'-羧基-α-生育酚、DG（16：0/16：1）、α-亞麻基肉堿、LysoPC（20：1）和乳糖神經(jīng)酰胺（d18：1/22：0）明顯回調(diào)；尿液中 29 個(gè)代謝標(biāo)志物有回調(diào)趨勢，其中精氨酸賴氨酸、3-氧十四烷酸、3-羥基十四烷二酸和3-甲基組氨酸明顯回調(diào)。具體結(jié)果見OSID。

3.4.4 加參方治療CHF的代謝標(biāo)志物聚類分析和代謝通路分析 采用分層聚類分析即熱圖來展示加參方可回調(diào)的代謝標(biāo)志物在不同組樣本中的分布情況。以代謝標(biāo)志物為縱坐標(biāo)，樣本為橫坐標(biāo)，圖中顏色越深表明含量越高。通過分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組血清和尿液代謝標(biāo)志物有明顯差異；與模型組比較，加參方組有不同程度的回調(diào)趨勢，見圖7A，7C。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)加參方對CHF的作用，對加參方可回調(diào)的血清和尿液代謝標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加參方對CHF大鼠血清代謝標(biāo)志物的干預(yù)主要通過甘油磷脂代謝、鞘脂代謝及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路產(chǎn)生作用；對CHF大鼠尿液代謝標(biāo)志物的干預(yù)主要通過泛酸和CoA生物合成、組氨酸代謝及嘌呤代謝通路產(chǎn)生作用，見圖7B，7D。

圖7 加參方對CHF大鼠代謝標(biāo)志物影響的聚類分析圖和代謝通路圖Fig.7 Cluster analysis and metabolic pathway analysis of the effect of Jiashen Prescription on serum and urine metabolic markers in CHF rats

4 討論

心肌梗死（簡稱心梗）是心力衰竭最常見、最重要的病因之一[15]。心梗后凋亡及壞死的心肌細(xì)胞引起免疫損傷，觸發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，加重組織功能受損；同時(shí)，心梗后心排出量的降低引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，如反射性激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、RAAS等；此外，心臟壓力和（或）容量負(fù)荷增加，機(jī)械應(yīng)力改變，也會(huì)直接導(dǎo)致一系列病理生理改變，加重心肌重構(gòu)，最終導(dǎo)致心衰[16]。本研究結(jié)果顯示加參方能降低CHF大鼠心肌組織NT-proBNP水平，升高CHF大鼠EF和FS值，減輕CHF大鼠心肌病理損傷和心肌纖維化，減緩心肌重構(gòu)，改善CHF。

本研究發(fā)現(xiàn)CHF大鼠血清代謝標(biāo)志物涉及的代謝通路包括類固醇激素生物合成、甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等；尿液代謝標(biāo)志物涉及的代謝通路包括泛酸和CoA生物合成、嘌呤代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、組氨酸代謝、花生四烯酸代謝等，與已有研究結(jié)果一致[17-19]。給予藥物后，發(fā)現(xiàn)加參方通過干預(yù)甘油磷脂代謝和鞘脂代謝等脂質(zhì)代謝通路、組氨酸代謝及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等氨基酸代謝通路、泛酸和CoA生物合成等能量代謝通路、以及嘌呤代謝通路調(diào)節(jié)血清和尿液代謝標(biāo)志物，改善CHF大鼠代謝紊亂，減輕CHF。

脂質(zhì)在維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和心臟功能方面具有重要作用[20]，其中甘油磷脂構(gòu)成生物膜并參與細(xì)胞膜蛋白識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。研究表明CHF患者在磷脂代謝方面出現(xiàn)明顯紊亂，磷脂酰膽堿（PCs）、溶血磷脂酰膽堿（Lyso PCs）和溶血磷脂酰乙醇胺（Lyso PE）顯著下降[22]。而Lyso PCs是氧化損傷低密度脂蛋白的主要成分，可誘導(dǎo)心血管疾病中的炎癥和血管功能障礙[23]，加參方給藥后與甘油磷脂代謝相關(guān)的脂質(zhì)代謝標(biāo)志物水平回調(diào)，說明藥物可能通過減輕炎癥的發(fā)展，減緩CHF的發(fā)展。與鞘脂代謝相關(guān)的神經(jīng)酰胺可增加線粒體膜通透性，促進(jìn)凋亡因子的釋放，從而觸發(fā)半胱氨酸蛋白酶（Caspase）級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可激活環(huán)磷酸腺苷（cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白3樣蛋白1（CREB3L1）促進(jìn)膠原蛋白沉積，促進(jìn)纖維化[24-25]。本研究中給予加參方后血清中乳糖神經(jīng)酰胺顯著降低，心肌纖維化現(xiàn)象減輕，說明加參方可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡和減輕心肌纖維化，改善CHF。

氨基酸及其衍生物是生物體生命運(yùn)動(dòng)重要的代謝中間體[26]。天冬酰胺是草酰乙酸的前體之一，有研究表明心力衰竭患者生物標(biāo)志物天冬酰胺降低[27]。組氨酸可清除氧自由基，保護(hù)心肌細(xì)胞肌膜Na+-K+-ATP酶、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶，改善心肌損傷[28-29]。本研究中加參方可回調(diào)CHF大鼠血清L-天冬酰胺和尿液3-甲基組氨酸，調(diào)節(jié)天冬氨酸代謝和組氨酸代謝。說明加參方可以通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝改善CHF大鼠氧化應(yīng)激和能量代謝，減緩心肌重構(gòu)，減輕CHF。

泛酸是輔酶A（CoA）和?；d體蛋白生物合成的重要前體物質(zhì)，CoA對脂肪酸代謝和檸檬酸循環(huán)至關(guān)重要，參與能量代謝[30]。而?；鈮A是參與脂肪酸氧化重要的脂質(zhì)底物，缺血造成的CHF心肌脂肪酸氧化減少[31]。本研究中CHF大鼠血清代謝物中α-亞麻基肉堿水平顯著下降，與泛酸和CoA生物合成通路相關(guān)的CHF大鼠尿液代謝物中4'-磷酸泛酰半胱氨酸水平降低，給藥后均回調(diào)，說明加參方可以改善CHF大鼠能量代謝。

嘌呤代謝指核酸堿基腺嘌呤及鳥嘌呤等嘌呤衍生物的合成或分解，正常生理情況下，嘌呤合成與分解處于相對平衡狀態(tài)。嘌呤代謝分解代謝終產(chǎn)物尿酸與CHF在內(nèi)的心血管疾病密切相關(guān)，升高的尿酸水平與CHF患者的疾病嚴(yán)重程度和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[32]。本研究中CHF大鼠尿液中與嘌呤代謝相關(guān)的中間代謝物磷酸鳥苷和脫氧腺苷下降，給藥后回調(diào)，說明加參方可能通過改善CHF大鼠嘌呤代謝減少尿酸生成。

綜上所述，加參方能改善CHF大鼠心臟功能，減緩心肌重構(gòu)，改善CHF，主要通過干預(yù)脂質(zhì)代謝通路、氨基酸代謝通路、能量代謝通路和嘌呤代謝通路發(fā)揮作用。