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        2型糖尿病對患者精子DNA碎片率、AR和MMP的影響研究

        2022-02-04 11:16:58張軍榮徐惠明唐鋒奚穎霞
        浙江醫(yī)學(xué) 2022年23期
        關(guān)鍵詞:前向生育能力百分比

        張軍榮 徐惠明 唐鋒 奚穎霞

        2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種多發(fā)病、常見病,流行病學(xué)調(diào)查顯示其患病率逐年上升,嚴(yán)重影響人們的身心健康[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)T2DM的慢性高血糖狀態(tài)會(huì)造成患者多器官功能損害,并且對生殖功能也可能有潛在的不利影響[3]。隨著男性T2DM患者的增加,潛在的生育風(fēng)險(xiǎn)也越來越大,故而研究T2DM影響男性生育能力的可能途徑已經(jīng)是迫在眉睫[4-5]。因此,本研究探討T2DM對患者精子DNA碎片率、精子頂體反應(yīng)(acrosome reaction,AR)率和精子線粒體膜電位(mitochondrial membrane protential,MMP)的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 對象和方法

        1.1 對象 選取2018年1月至2021年12月浙江省婦幼和生殖保健中心收治的T2DM育齡男性患者50例作為研究對象(T2DM組),年齡22~40(28.31±4.32)歲;體重57~89(68.74±7.42)kg。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[6]中T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn),且均為育齡男性;(2)初次發(fā)現(xiàn)、尚未經(jīng)治療;(3)年齡≥20歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴糖尿病并發(fā)癥;(2)伴急性感染、惡性腫瘤等疾病者;(3)嚴(yán)重精神疾病者;(4)伴嚴(yán)重肝、腎、脾、心、肺等嚴(yán)重異常者;(5)伴其他影響精液治療的內(nèi)分泌疾??;(6)存在射精障礙、勃起功能障礙者;(7)遺傳性疾病、泌尿生殖系統(tǒng)異常者。另選取同期本中心健康體檢育齡男性55名作為對照組,年齡 22~40(28.63±4.27)歲 ;體重 54~85(68.35±6.85)kg。兩組受試者年齡和體重比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

        1.2 主要試劑 精子DNA碎片染色試劑盒、精子AR檢測試劑盒、精子MMP檢測試劑盒均購自青島復(fù)諾生物醫(yī)療有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 精液標(biāo)本采集 禁欲3~7 d以手淫法收集受試者精液標(biāo)本。

        1.3.2 正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比檢測 精液標(biāo)本完全液化后按《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5版進(jìn)行常規(guī)分析,檢測正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比。

        1.3.3 精子DNA碎片率測定 精液標(biāo)本完全液化后,加入A液調(diào)整精子濃度至(1~2)×106/ml,將待染色精液樣本及染色試劑均放置于冰盒上預(yù)冷5 min。取100 μl準(zhǔn)備好的待檢精液樣本置于15 ml EP管中,加入B液200 μl,混勻,反應(yīng)30 s后加入C液600 μl,立即混勻。將混勻的溶液置于流式細(xì)胞儀上樣管處,使用流式細(xì)胞儀測定精子DNA碎片率。

        1.3.4 精子AR率測定 精液標(biāo)本完全液化后,在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),根據(jù)精子濃度取20~40萬個(gè)精子,加入A液稀釋至1 000 μl,混勻。將待染色精液樣本及試劑盒中的染色試劑放置于金屬浴上37℃預(yù)熱5 min。吸取D液,加入上述A液稀釋混勻的樣本中,混勻3 s。分別取500 μl準(zhǔn)備好的待檢精液樣本置于1.5 ml離心管中,標(biāo)記為檢測管、對照管。分別吸取B液5 μl加入檢測管、C液5 μl加入對照管,混勻3 s,金屬浴上37℃靜置15 min,使用流式細(xì)胞儀測定精子AR率。

        1.3.5 精子MMP測定 精液標(biāo)本完全液化后,在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),根據(jù)精子濃度取10~20萬個(gè)精子,加入A液稀釋至500 μl,混勻。將待染色精液樣本以及試劑盒中的染色試劑放置于金屬浴上37℃預(yù)熱5 min。將待染色樣本加入1.5 ml離心管中,混勻10 s。吸取B液5 μl,加入上述離心管中,混勻3 s,于37℃金屬浴上靜置10 min,使用流式細(xì)胞儀測定精子MMP。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件處理。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比比較 T2DM組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均低于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表1。

        表1 兩組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比比較

        2.2 兩組精子DNA碎片率、AR率和MMP比較 T2DM組精子DNA碎片率高于對照組,精子AR率、精子MMP均低于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

        表2 兩組精子DNA碎片率、AR率和MMP比較(%)

        3 討論

        近年來,研究發(fā)現(xiàn)T2DM可能引起男性生育能力下降[7-10]。精液質(zhì)量是男性生育能力體現(xiàn)的一個(gè)重要指標(biāo)。T2DM導(dǎo)致男性激素水平失常,生精功能障礙間接或直接造成精子相應(yīng)的正常生理過程受干擾;并且又最直接得造成附睪、睪丸組織正常功能受限,主要包括精子活力下降、精液液化時(shí)間延長及精子總數(shù)減少,因此會(huì)造成男性生育能力減弱,甚至可能出現(xiàn)不育的情況[11-13]。本研究表明,T2DM組正常形態(tài)精子百分比、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均低于對照組,提示T2DM患者正常形態(tài)精子百分比、精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均下降。近年來,以精子DNA損傷為特征的精子染色體結(jié)構(gòu)異常可能對男性生育能力具有一定預(yù)測價(jià)值[14]。本研究表明,T2DM組精子DNA碎片率高于對照組,提示T2DM患者精子DNA碎片率明顯增加。精子頂體主要由高爾基體小泡發(fā)育而來,并且是精子頭部頂端特化的小泡。而AR主要指精子在輸卵管壺腹部與卵子相遇后,導(dǎo)致頂體產(chǎn)生一系列反應(yīng)[15-16]。精子AR率是男性精子受精能力的判斷指標(biāo)[17]。姚佳沛[18]研究表明,與正常人群相比,糖尿病患者(a+b)級精子減少、精液液化時(shí)間延長、精液量減少。本研究表明,T2DM組精子AR率低于對照組,提示T2DM患者精子AR率明顯降低。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的主要部位,故而線粒體DNA、基質(zhì)中的酶最易受到活性氧攻擊的損傷[19]。線粒體正常膜電位依賴于線粒體膜間隙和線粒體基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子泵,當(dāng)線粒體內(nèi)活性氧過度增加時(shí),則會(huì)導(dǎo)致MMP下降[20]。本研究表明,T2DM組精子MMP低于對照組,提示T2DM患者精子MMP明顯下降。

        綜上所述,T2DM患者精子DNA碎片率升高、精子AR率和精子MMP下降,可能影響T2DM患者生育能力,導(dǎo)致生育能力下降。T2DM對精子DNA碎片率、AR率及MMP的影響機(jī)制仍不明確,筆者團(tuán)隊(duì)將對此開展進(jìn)一步研究。

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