于志文，郭 冉，韓佳樂(lè)，何立彬，高佳朋

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000)

抗菌肽被認(rèn)為是最適合的抗生素替代物[1]?？咕模置拗鞣烙?，是具有抗菌特性的一類小分子多肽，被認(rèn)為是機(jī)體抵抗病原入侵的“第一道屏障”?？咕牡膩?lái)源非常廣，在動(dòng)物、植物、微生物中都有發(fā)現(xiàn)。此外，抗菌肽具有廣譜抗菌性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌有很好的抑制作用?？咕脑谏矬w內(nèi)還可以充當(dāng)免疫效應(yīng)分子調(diào)節(jié)機(jī)體的抗炎和促炎作用，加快傷口的愈合速度，參與生物體的細(xì)胞代謝等重要過(guò)程[2]。凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的抗病性試驗(yàn)也證實(shí)，添加抗菌肽后，感染了對(duì)蝦白斑病毒和弧菌的對(duì)蝦成活率顯著提高[3]。

第益肽為一種新型抗菌肽，由地衣芽孢桿菌發(fā)酵而來(lái)，目前已應(yīng)用在仔豬、肉豬和禽類的養(yǎng)殖中，可以有效抑制革蘭氏陰性及陽(yáng)性致病菌，提高動(dòng)物免疫力、改善動(dòng)物腸道健康、提升動(dòng)物生產(chǎn)繁殖性能，是一款新型、綠色、環(huán)保的替抗飼料添加劑。目前，第益肽在凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖中尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)將第益肽添加到凡納濱對(duì)蝦飼料中，觀察其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫和消化性能的影響。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、豆粕為主要蛋白源，魚油、玉米油為脂肪源，根據(jù)飼料配方(見(jiàn)表1)制作飼料。試驗(yàn)前將所需原料進(jìn)行粉碎。經(jīng)粉碎后的原料經(jīng)粉過(guò)80目篩，之后將經(jīng)過(guò)處理的各種原料按照飼料配方中的比例混勻。A組為基礎(chǔ)飼料組(不含抗菌肽)，E組添加0.03%抗菌肽(第益肽)。用飼料擠壓膨化機(jī)將混勻后的A、E兩組原料擠壓膨化成粒徑1.55 mm的顆粒飼料。制作成功的顆粒飼料先放入烘箱中熟化(60 ℃，30 min)，隨后自然風(fēng)干，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將購(gòu)買來(lái)的蝦苗放入暫養(yǎng)桶中，進(jìn)行為期兩周的暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間投喂苗場(chǎng)購(gòu)買的成品商業(yè)蝦飼料。本試驗(yàn)共分兩組，對(duì)照組記為A，添加0.03%第益肽的記為E，每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放蝦苗40尾。在正式試驗(yàn)開(kāi)始前將蝦苗空腹24 h，隨后挑選初始體重為(0.40±0.01)g，體質(zhì)健康，大小勻稱的蝦苗進(jìn)行為期10周的飼養(yǎng)試驗(yàn)。

表1 飼料組成和營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

蝦苗飼養(yǎng)在大小為(60 cm×40 cm×50 cm)的魚缸中，每缸放苗40尾。養(yǎng)殖用水為天然海水，鹽度為(30±1)‰，用于養(yǎng)殖的海水先用二氧化氯消毒，靜置，經(jīng)過(guò)砂濾池過(guò)濾方可使用。每天投喂三次，投喂30 min后觀察飼料是否剩余，投喂量控制在蝦體重的6%～10%。每天換水一次，換水量為1/3。每?jī)芍芊Q重一次，及時(shí)調(diào)整投喂量。在整個(gè)飼養(yǎng)期間不間斷供氧，確保水中溶解氧含量>5.5 mg/L，控制水溫在(28±1)℃，pH值在7.5～8.0，氨氮<0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.2 mg/L，鹽度在(30±1)‰。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，空腹24 h，撈取每缸中的蝦記錄總數(shù)、總重。隨機(jī)取4尾蝦，擦干其體表水分，于烘箱烘干至恒重，轉(zhuǎn)入干燥器中保存，用于全蝦體成分的測(cè)定。另取9尾蝦置于冰托盤中，小心取出肝胰腺放入液氮罐冷凍，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冷凍冰箱中保存，用于肝胰腺中各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。將蝦體剩余部分完整剝離出肌肉放入烘箱中烘至恒重，轉(zhuǎn)入干燥器中保存，用于肌肉成分含量的測(cè)定。

1.5 待測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

飼料、全蝦和肌肉的水分含量采用烘干減重法(105 ℃)測(cè)定，粗灰分含量采用馬弗爐灰化法測(cè)定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定。堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、胰蛋白酶(TPS)、脂肪酶(LPS)使用南京建成生物科技有限公司的試劑盒測(cè)定。

1.6 計(jì)算公式

增重率(WGR，%)=100×(Wt-W0)/W0；

存活率(SR，%/d)=100×Nt/N0；

飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt-W0)；

肝體比(VSI，%)=100×Wh/W；

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=100×(lnWt-lnW0)。

上式中：Wt為蝦終末體重，g；W0為蝦初始體重，g；Nt為試驗(yàn)終末蝦尾數(shù)；N0為初始蝦尾數(shù)；Wh為蝦的肝胰腺重，g；W為蝦體重，g；F為飼料用量，g。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS26.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05則表示各組的結(jié)果存在顯著性差異，而后用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

各組對(duì)蝦的增重率、存活率、飼料系數(shù)、肝體比、特定生長(zhǎng)率各組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.2 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分的影響

全蝦和肌肉的水分含量?jī)山M間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；粗蛋白質(zhì)含量A組顯著低于E(P<0.05)；粗灰分含量A組顯著高于E組(P<0.05)；全蝦和肌肉中的粗脂肪含量?jī)山M無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分的影響

2.3 第益肽對(duì)凡納賓對(duì)蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和丙二醛含量A組高于E組(P<0.05)；超氧化物歧化酶兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；總抗氧化能力E組高于A組。(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.4 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺代謝酶和消化酶活性的影響

E組的胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著高于A組(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

表5 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶活性的影響

3 討論

3.1 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和體成分的影響

抗菌肽是一種在大自然中大量存在的，具有獨(dú)特生物學(xué)活性的多肽類物質(zhì)。能通過(guò)膜透化作用直接與靶細(xì)胞結(jié)合或與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶目標(biāo)相互作用干擾其代謝進(jìn)而殺死目標(biāo)，對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒均有很好的抑制效果，被認(rèn)為是最適合的抗生素替代物[1]。覃志彪等[4]的研究表明，飼料中添加不同比例的抗菌肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和體成分會(huì)產(chǎn)生不同的影響，但當(dāng)添加量小于3.0 mL/kg，增重率則無(wú)顯著性差異；當(dāng)超過(guò)5.0 mL/kg，粗脂肪含量顯著降低；超過(guò)8.0 mL/kg時(shí)，顯著提高肌肉蛋白質(zhì)含量，對(duì)灰分含量無(wú)顯著影響。石廣舉等[5]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.01%的NT-6抗菌脂肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能有顯著促進(jìn)作用。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，添加第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能并未造成顯著性影響，但肝體比略有升高，說(shuō)明第益肽對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用；對(duì)蝦的粗蛋白含量也顯著提高，由此可以看出抗菌肽能提高對(duì)蝦的蛋白質(zhì)利用率；而添加抗菌肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能影響不顯著的原因可能是當(dāng)飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)能完全滿足凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)需求時(shí)，添加劑的促生長(zhǎng)效果完全可能被其他因子所掩蓋[6]。

3.2 第益肽對(duì)凡納賓對(duì)蝦免疫性能的影響

凡納濱對(duì)蝦屬低等無(wú)脊椎動(dòng)物，以非特異性免疫為主，一般以血淋巴和肝胰腺中相關(guān)免疫酶活性和抗氧化能力來(lái)評(píng)價(jià)凡納濱對(duì)蝦的免疫功能。堿性磷酸酶和酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在對(duì)蝦的非特性免疫過(guò)程中有重要作用[7-8]。已有研究表明，在飼料中添加適量的抗菌肽可顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清中堿性磷酸酶的活性[9-10]。在本試驗(yàn)中，添加抗菌肽后對(duì)蝦的兩種磷酸酶活性反而偏低，與前人的研究結(jié)果并不一致。這兩種酶除了是溶酶體的標(biāo)志在亦在ADP形成ATP過(guò)程中有重要作用[7-8]。筆者發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖動(dòng)物受到脅迫或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性往往出現(xiàn)亦異常升高的現(xiàn)象，如王曉雯等[9]、劉慧玲等[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫、養(yǎng)殖密度的變化均會(huì)導(dǎo)致受試動(dòng)物體內(nèi)磷酸酶活性發(fā)生改變，往往表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的效果，當(dāng)生物體不能適應(yīng)環(huán)境的變化就會(huì)死亡。因此，本試驗(yàn)中對(duì)照組磷酸酶活性偏高可能是輕度應(yīng)激使機(jī)體大量合成ATP造成，而添加抗菌肽可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減輕對(duì)蝦的應(yīng)激狀態(tài)，但真正原因還有待深入研究。

超氧化物歧化酶是凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)重要的抗氧化酶，總抗氧化能力在整體上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。有研究表明，飼料中添加適量的抗菌肽可顯著提高凡納濱對(duì)蝦的總抗氧化能力[11]和超氧化物歧化酶活性[12]。丙二醛是凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，可以間接反應(yīng)對(duì)蝦肝臟的受損傷情況，常與超氧化物歧化酶一起作為評(píng)價(jià)機(jī)體肝臟健康與否的指標(biāo)。王自蕊等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在湘云鯽的飼料中添加0.015%和0.02%的天蠶素抗菌肽可顯著降低血清中丙二醛含量；王一娟等[14]也證實(shí)抗菌肽具有降低丙二醛濃度的作用。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，抗菌肽能顯著提高凡納濱對(duì)蝦的總抗氧化能力并降低丙二醛含量，這與前人的研究相似。而超氧化物歧化酶性未表現(xiàn)顯著性差異，但對(duì)照組偏高?？偪寡趸芰Ω哒f(shuō)明對(duì)蝦的免疫功能較強(qiáng)，而丙二醛含量升高表明體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多，肝臟受到脅迫，這一般會(huì)導(dǎo)致超氧化物歧化酶活性上升?？寡趸赶凳且粋€(gè)十分復(fù)雜的系統(tǒng)，各種酶活性在生物體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但毫無(wú)疑問(wèn)的是，添加第益肽可以提高對(duì)蝦的免疫性能。

3.3 第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶活性的影響

肝胰腺是凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)重要的器官，測(cè)定其中胰蛋白酶和脂肪酶的活性可以反映其消化能力的高低。但關(guān)于抗菌肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶活性影響的研究并不多，翟少偉等[15]發(fā)現(xiàn)抗菌脂肽可顯著提高中華稚鱉脂肪酶的活性；史慶超等[16]也證實(shí)，在吉富羅非魚的飼料中添加不同比例的抗菌肽，可以顯著提高腸道脂肪酶活性。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，抗菌肽可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺蛋白酶和脂肪酶的活性；抗菌肽在生物體內(nèi)可以有效消滅病原微生物，同時(shí)又屬于小肽類物質(zhì)，可以有效保護(hù)對(duì)蝦的肝胰腺，其自身作為小肽類物質(zhì)便于消化吸收，對(duì)消化酶活性有較明顯的提高作用。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加0.03%的第益肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響并不顯著，但可以顯著提高對(duì)蝦的免疫和消化性能，有效保護(hù)對(duì)蝦的肝胰腺。