李育敏，付曉歌，郭東月，龔海娜，曾子朗，姚潔儀，鄧巧梅，李雙，張秀明

(深圳市羅湖醫(yī)院集團醫(yī)學檢驗實驗室 & 深圳大學第三附屬醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518001)

新型冠狀病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)疫情在世界范圍內持續(xù)流行，引發(fā)疫情的新型冠狀病毒(新冠病毒，2019-nCoV)基因組不斷變異，影響病毒的生物學特性。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第九版)，新冠病毒核酸檢測陽性為確診的首要標準[1]。各醫(yī)療機構應當加強核酸檢測的質量控制，確保檢測結果準確可靠。按照《新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》要求[2]，實驗室應開展室內質控，每批檢測至少有1份弱陽性質控品(第三方質控品，通常為檢出限的1.5～3倍)、3份陰性質控品(生理鹽水)，質控品隨機放在臨床標本中，參與從提取到擴增的全過程。在新冠病毒核酸檢測過程中，第三方弱陽性質控一旦出現(xiàn)失控，將會影響結果的準確判讀。目前針對核酸檢測失控現(xiàn)象分析的報道較少。本實驗室嚴格按照國家文件規(guī)定每批檢測至少1份弱陽性質控(廣州邦德盛公司)，現(xiàn)就實際工作中發(fā)現(xiàn)的弱陽性質控失控案例進行總結分析，探討相關影響因素和解決措施，供臨床參考。

1 案例分析

1.1室內質控失控案例1 當天發(fā)現(xiàn)多批次弱陽性質控ORF1ab基因無Ct值或Ct值增高現(xiàn)象(圖1A)。針對失控可能發(fā)生的原因，實驗室逐一排查。(1)核酸提取或擴增：實驗室采用的核酸提取試劑為重慶中元匯吉核酸提取試劑盒(磁珠法)，擴增試劑為上海伯杰公司新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)。當天失控批次的所有樣本檢測內標正常，表明核酸提取和擴增過程正常。(2)質控品：更換另一廠家擴增試劑檢測弱陽性質控，結果符合預期值(圖1B)，排除質控品質量問題。(3)試劑：當天部分批次同時檢測弱陽性質控和試劑盒自帶的陽性對照，ORF1ab均無Ct值或Ct值增高(圖1C)，而另外部分批次試劑盒自帶的陽性對照ORF1ab和N的Ct值雖然接近預期值，但其熒光強度(Rn)仍低于前一天未失控批次自帶的陽性對照。結合第三方弱陽性質控和自帶陽性對照均出現(xiàn)失控的現(xiàn)象，考慮為檢測試劑出問題的可能性大，更換同一廠家新批號試劑后，檢測弱陽性質控Ct值符合預期值(圖1D)，表明失控為試劑質量問題所致。進一步調查也證實失控是發(fā)生在當天更換新批號試劑后，更換前檢測室內質控均符合預期值。廠商反饋為提高檢測靈敏度，對該批號試劑進行了優(yōu)化(具體環(huán)節(jié)不詳)，考慮可能為優(yōu)化后反應體系如ORF1ab熒光探針等發(fā)生變化或其他干擾因素所致。

1.2室內質控失控案例2 連續(xù)2天多批次弱陽性質控ORF1ab的Ct值出現(xiàn)增高現(xiàn)象(圖2A)，質控品均為同一批號，失控批次的樣本內標檢測正常，試劑盒自帶的陽性對照ORF1ab和N的Ct值及Rn均正常(圖2B)，考慮為該批號質控品出問題的可能性大。更換新批號質控品后ORF1ab Ct值檢測正常(圖2C)，表明失控為該批號的質控品自身質量問題所致。

1.3室內質控失控案例3 當天下午連續(xù)幾批弱陽性質控ORF1ab的Ct值出現(xiàn)明顯增高現(xiàn)象(圖3A-B)，質控品批號和擴增試劑批號均與前一天和當天上午相同，重新提取該批號質控品后檢測ORF1ab的Ct值仍增高，更換新批號質控品，用同一種擴增試劑同時檢測新、舊批號質控，新批號質控ORF1ab的Ct值明顯低于舊批號(圖3C)，表明為舊批號質控品問題所致，但是同一舊批號質控品前后結果出現(xiàn)明顯差異，考慮可能為質控品反復凍融或儲存不當發(fā)生了降解。繼續(xù)查看前后2天的結果，發(fā)現(xiàn)當天上午檢測試劑盒自帶的陽性對照Ct值雖接近預期值，但熒光強度較前一天偏低，而且更換新批號質控品后，ORF1ab Ct值雖明顯低于舊批號，但仍高于前一天，且熒光強度也較前一天弱，表明擴增試劑也存在問題。質控品和試劑兩者均出現(xiàn)問題，因此考慮存儲不當?shù)目赡苄源螅鴮嶒炇椅窗l(fā)生斷電現(xiàn)象，考慮為冰箱門未封閉嚴密導致的溫度不達標。將擴增試劑和質控品均更換后，檢測弱陽性質控結果Ct值恢復至前一天預期值水平。采用新更換的試劑同時檢測新、舊質控品，舊質控較新質控的ORF1ab Ct值更高，表明除儲存原因外，舊質控品還存在多次使用、反復凍融的問題。

注：黃色，內標；綠色，N基因；藍色，ORF1ab基因。圖1 室內質控失控案例1

注：黃色，內標；綠色，N基因；藍色，ORF1ab基因。圖2 室內質控失控案例2

注：黃色，內標；綠色，N基因；藍色，ORF1ab基因。圖3 室內質控失控案例3

1.4室內質控失控案例4 將中值質控品(參考濃度：1.6×104copies/mL)稀釋20倍至800 copies/mL作為弱陽性質控(檢出限500 copies/mL)，稀釋初期檢測結果符合預期值，但是后續(xù)逐漸出現(xiàn)部分批次弱陽性質控ORF1ab Ct值增高現(xiàn)象，檢測批次的Ct值強弱不等，重復性較差。而檢測質控品原液(未稀釋)的Ct值符合預期值，且重復性較好，表明稀釋對質控品的保存有一定影響，稀釋后質控品存在降解和不穩(wěn)定現(xiàn)象。

2 討論

按照《新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》要求[2]，實驗室開展室內質控，弱陽性質控需采用第三方質控品。目前，廠商制備的新冠病毒核酸檢測第三方質控品以假病毒為原料，使用較為廣泛的有廣州邦德盛、北京康徹思坦等生物技術公司生產(chǎn)的室內質控品。相比試劑盒自帶的強陽性對照，采用第三方弱陽性質控品的優(yōu)勢在于不針對于特定檢測系統(tǒng)和試劑進行優(yōu)化，具有廣泛的通用性，可更為客觀地評估檢測系統(tǒng)和反映誤差水平，更好地監(jiān)控不同廠家的試劑檢測弱陽性樣本的靈敏度，避免病毒拷貝數(shù)較低時，因檢測系統(tǒng)的靈敏度低導致弱陽性樣本漏檢，出現(xiàn)假陰性；其次陽性質控的濃度越低，核酸污染的風險越小。3份陰性質控品參與從提取到擴增的步驟，可有效監(jiān)測核酸檢測的全流程是否存在污染，也可以將其中1份生理鹽水暴露在生物安全柜內，直接加入到檢測試劑中監(jiān)測生物安全柜是否存在氣溶膠污染。3份陰性質控檢測結果均為陰性，弱陽性質控為陽性，且Ct值符合預期值，視為室內質控在控，否則為失控。

核酸提取及擴增過程、試劑和質控品質量等出現(xiàn)問題均可引起失控。一般情況下，如樣本內標檢測正常，核酸提取和擴增步驟出問題的可能性較小，那么發(fā)生失控首先考慮試劑或質控品的問題。本研究分析的失控案例1和案例2分別由試劑和質控品問題所致，而失控案例3分析原因后考慮為儲存不當所致的試劑和質控品均出現(xiàn)問題，將擴增試劑和質控品均更換后，檢測弱陽性質控結果正常。因此，建議每批次同時檢測2份弱陽性對照，1份為第三方質控品，1份為試劑盒自帶的陽性對照稀釋至檢出限的1.5～3倍(Ct值與第三方弱陽性質控品接近)，以便發(fā)生失控時能夠及時查找原因，采取糾正措施。另外檢測試劑配制好后應避光保存，并盡快使用，更換新批號試劑后，應按文件規(guī)定驗證試劑批間差異和關鍵耗材抑制物[3]。

除以上原因外，質控品的正確保存也是影響檢測結果的重要因素之一。本研究分析的失控案例3由于儲存原因所致保存溫度不達標，案例4由于將質控品原液稀釋后影響了保存穩(wěn)定性。邦德盛液體質控品首先對新冠假病毒(含ORF1ab、N、E和M基因)進行構建和培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液，對收獲的假病毒培養(yǎng)液進行初步定值，然后用陰性稀釋液稀釋至所需濃度，并添加了適量的穩(wěn)定劑。如實驗室因檢測弱陽性質控的濃度要求，進行再次稀釋時采用的稀釋液或稀釋后儲存的耗材含RNase或抑制物等都可能影響質控品的穩(wěn)定性，因此建議直接使用適合參考濃度(檢出限的1.5～3倍)的質控品原液進行檢測，如邦德盛液體質控品低值(參考濃度：1.4×103copies/mL)，避免因稀釋造成的質控不穩(wěn)定現(xiàn)象。另外質控品原液及其提取后的核酸應嚴格按照說明書進行保存和使用，不可反復凍融或長時間存放于室溫及2～4 ℃，避免質控品降解或變質。

在臨床新冠病毒核酸檢測過程中經(jīng)常會觀察到N基因和ORFlab基因的檢出率存在差異，N基因的陽性率通常高于ORF1ab基因，檢出的Ct值大于ORF1ab基因，這可能跟以下因素有關[4-10]：(1)ORF1ab基因特異性強，而N基因相對保守，易與其他病毒發(fā)生交叉反應；(2)新冠病毒轉錄新的mRNA均帶有N基因，而ORF1ab基因拷貝數(shù)較低；(3)2個基因序列不同，不同廠家的試劑設計對ORF1ab基因和N基因的檢測靈敏度存在差異等。同樣第三方弱陽性質控品失控也常首先觀察到ORF1ab基因Ct值增高或檢測不出，而N基因可檢出。由于第三方質控品非臨床樣本，其原因主要與試劑的靈敏度有關。

綜上所述，新冠病毒核酸檢測出現(xiàn)弱陽性質控失控，要從核酸提取、擴增和檢測結果全流程進行追溯分析，并結合試劑和質控品綜合判斷失控原因及影響因素，及時采取相應的糾正措施，確保檢測結果準確可靠。