陳若虹，蔡婧瑤，吳逢熙，胡敏

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科，長沙410011)

線性范圍是定量檢測系統(tǒng)除正確度、精密度之外的一項重要性能指標(biāo)，也是臨床實驗室定量檢測系統(tǒng)性能驗證的一項重要內(nèi)容。美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)發(fā)布的線性評價標(biāo)準(zhǔn)為EP06文件，此標(biāo)準(zhǔn)歷經(jīng)多次修訂，歷史版本有EP06-P(1986年)、EP06-P2(2001年)和EP06-A(2003年)[1]，目前最新版本為EP06-Ed2(2020年)[2]。我國國家衛(wèi)生健康委員會(原衛(wèi)生部、原衛(wèi)生與計劃生育委員會)也發(fā)布了多個與之相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，如針對血液學(xué)專業(yè)的WS/T 406—2012《臨床血液學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》[3]和針對分子生物學(xué)專業(yè)的GB/T 37871—2019《核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價技術(shù)規(guī)范》[4]，以及針對所有定量項目的WS/T 408—2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評價指南》[5]、WS/T 420—2013《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》[6]等。雖然這些評價標(biāo)準(zhǔn)采用的樣本基本相似，但統(tǒng)計處理方法卻存在較大差異，導(dǎo)致評價結(jié)論也可能出現(xiàn)不一致的情況，各臨床實驗室可能面臨著選擇困難。本研究以2種直接膽紅素(direct bilirubin，D-Bil)檢測試劑為例，采用4種生化和免疫定量項目常用的標(biāo)準(zhǔn)(EP06-A、EP06-Ed2、WS/T 408—2012、WS/T 420—2013)對其進(jìn)行線性驗證，演示驗證過程，比較各方法的差異，為臨床實驗室選擇合適的線性驗證方法提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)；校準(zhǔn)合格的移液器(德國eppendorf公司)；A、B 2種不同品牌D-Bil試劑盒及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品。

1.2實驗樣本 收集檢測結(jié)果靠近線性范圍上、下限的中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院患者血清各1份，每份2 mL，無溶血、乳糜等干擾物。

1.3線性范圍驗證

1.3.1樣品組制備和檢測 由于各標(biāo)準(zhǔn)均可以采用真實濃度不確定但已知相互關(guān)系的樣品組，因此本研究采用同一個用高、低值濃度按比例混合的樣品組進(jìn)行驗證。收集接近聲明線性范圍濃度的高(H)、低(L)值混合血清2份，將L和H樣品按L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、H的比例混勻，得到6份樣品用于此次實驗。WS/T 408—2012要求的檢測次數(shù)最少為3次，EP06-Ed2、EP06-A、WS/T 420—2013要求的檢測次數(shù)為2次，為方便比較，本研究將每個樣品重復(fù)檢測3次。檢測前保證儀器狀態(tài)正常，采用配套校準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器后檢測雙水平質(zhì)控品，質(zhì)控均在控再開始檢測，所有檢測在同一批次完成。檢測完成后，分別用EP06-Ed2、EP06-A、WS/T 408—2012、WS/T 420—2013中介紹的方法對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理并作出評價。EP06-Ed2發(fā)布后，理論上EP06-A應(yīng)不再被推薦使用，但EP06-A是存在時間較長、使用范圍較廣的標(biāo)準(zhǔn)，因此，同時采用新舊2個版本進(jìn)行比較以展示其改進(jìn)內(nèi)容。

1.3.3EP06-A統(tǒng)計方法 首先需計算數(shù)據(jù)組的合成SD(SDr)或合成CV(CVr)，檢驗其精密度是否符合要求， 然后以均值為因變量，稀釋度為自變量，進(jìn)行二元一次、二次和三次多項式回歸分析，判斷非線性系數(shù)b2和b3與0比較差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，若無統(tǒng)計學(xué)意義，則認(rèn)為存在線性關(guān)系；若有統(tǒng)計學(xué)意義，則說明存在非線性，需要評價非線性度。通過比較回歸標(biāo)準(zhǔn)差(Sy,x)(Sy,x越小，說明該模型越適合)，確定最佳擬合模型后，計算該模型每一個樣品的DL，即非線性模型與線性模型在每個濃度點的差值。當(dāng)每個濃度點的DL均小于實驗室設(shè)定的允許誤差范圍時，該組數(shù)據(jù)線性驗證通過。若有任意濃度點的DL超過允許誤差范圍時，驗證失敗。

1.3.5WS/T 420—2013統(tǒng)計方法 對均值和稀釋度作普通最小二乘法(ordinary least squares，OLS)回歸，若回歸系數(shù)r2>0.995，則可初步判斷線性范圍符合要求，然后根據(jù)線性回歸方程計算出每個樣品的預(yù)期濃度并計算實測濃度與預(yù)期濃度的偏差，若偏差均在設(shè)定的允許誤差范圍內(nèi)，則認(rèn)為線性范圍可接受；若有任意點偏差超過允許誤差范圍時，則認(rèn)為線性范圍不可接受。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 用Excel和Medcalc對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果

2.1線性驗證樣品檢測結(jié)果 用2種D-Bil試劑檢測6個樣品，每個樣品重復(fù)檢測3次，結(jié)果見表1。作測定值與稀釋度的散點圖，目測無離群值。

表1 線性驗證樣品檢測結(jié)果的均值、SD和CV

2.2EP06-Ed2 統(tǒng)計方法 表1顯示，A、B 2組數(shù)據(jù)的SD均隨著濃度升高有逐步增加的趨勢，適合WLS回歸。由于1號樣品的CV遠(yuǎn)大于其他樣品，因此不被納入精密度輪廓，1號樣品用實際SD計算權(quán)重。用2～6號樣品作為精密度輪廓，計算各樣品權(quán)重。繪制WLS回歸散點圖，計算回歸方程，分別為y=390.765x+1.690、y=417.642x+1.460。以CLIA′88允許總誤差(allowable total error，TEa)的1/2為D-Bil的ADL，即3.42 μmol/L或10%(取高值)。A試劑的2號樣本DL及其90%CI均在ADL范圍之外，說明其線性不可接受；B試劑的所有樣品的DL及其90%CI均在ADL范圍內(nèi)，說明其線性范圍可以接受。2種試劑線性驗證的數(shù)據(jù)分析分別見表2和表3。圖1顯示了DL及90%CI和ADL的關(guān)系。

表2 A試劑EP06-Ed2線性驗證數(shù)據(jù)分析

表3 B試劑EP06-Ed2線性驗證數(shù)據(jù)分析

注：A,A試劑；B，B試劑；紅圈所示的2號樣品的DL及其90%CI落在陰影區(qū)域(10%ADL)之外。圖1 線性驗證統(tǒng)計分析(EP06-Ed2)

2.3EP06-A統(tǒng)計方法 設(shè)定D-Bil的允許不精密度誤差范圍為CLIA′88的1/3TEa，即2.28 μmol/L或8.33%(取高值)。A、B 2種試劑的SDr分別為1.471和1.511，均符合要求。多項式回歸分析顯示A試劑數(shù)據(jù)組最佳擬合模型為三階。B試劑數(shù)據(jù)組最佳擬合模型為二階，回歸曲線及方程見圖2。計算數(shù)據(jù)組的DL(μmol/L)和DL(%)，結(jié)果顯示2種試劑的1號樣品的DL(μmol/L)和DL(%)均超過ADL(見表4)，2種試劑的線性驗證均不通過。

注：A,A試劑；B，B試劑。圖2 多項式回歸模型與線性模型

表4 線性驗證數(shù)據(jù)分析

2.4WS/T 408—2012統(tǒng)計方法 WS/T 408—2012建議用Grubbs法判斷重復(fù)檢測數(shù)據(jù)中是否存在離群值，經(jīng)檢驗，A、B 2組數(shù)據(jù)均無離群值。多項式回歸方法與EP06-A相同，但WS/T 408—2012使用平均DL評價非線性度。經(jīng)計算，2組數(shù)據(jù)的回歸不精密度均小于界值，說明2組數(shù)據(jù)的精密度好，可作線性評價。同時2組數(shù)據(jù)的平均DL均小于臨界值，說明2組數(shù)據(jù)均有臨床可接受的非線性，A、B 2種試劑的線性驗證均通過。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)見表5。

表5 線性驗證數(shù)據(jù)分析(WS/T 408—2012)

2.5WS/T 420—2013統(tǒng)計方法 WS/T 420—2013建議單個數(shù)據(jù)超過均值±4SD被判斷為離群值，經(jīng)計算,2組數(shù)據(jù)均無離群值。對2組數(shù)據(jù)作OLS回歸，得到的回歸系數(shù)分別為0.995 2、0.997 5，均大于0.995，可初步判斷線性范圍符合要求。繼續(xù)計算數(shù)據(jù)組平均值與預(yù)期值的差值，結(jié)果顯示2種試劑的1號樣品的DL(μmol/L)和DL(%)均超過允許誤差范圍，說明2種試劑的線性驗證均不通過。見表6。

表6 線性驗證數(shù)據(jù)分析(WS/T 420—2013)

2.64種驗證標(biāo)準(zhǔn)的簡單比較 簡單歸納了4種驗證標(biāo)準(zhǔn)的差異，見表7。對于A、B 2種試劑，4種線性驗證標(biāo)準(zhǔn)的判定結(jié)果存在差異。

表7 4種線性驗證方法的比較

3 討論

各標(biāo)準(zhǔn)對樣品類別的要求基本一致，在選擇樣品濃度時，各標(biāo)準(zhǔn)大多建議在聲明的線性范圍內(nèi)或者靠近線性范圍上、下限的濃度選擇樣品，EP06-Ed2首次詳細(xì)介紹了怎樣根據(jù)定量(線性)上、下限的精密度來調(diào)整高、低值樣品的濃度。在本研究中2種試劑聲明的線性范圍分別為1～393 μmol/L、1～410 μmol/L，濃度最高樣品的檢測值均未超過聲明線性范圍。

確定ADL是線性驗證的關(guān)鍵步驟。實驗室在設(shè)定ADL時，應(yīng)基于測量程序的臨床用途，EP06-Ed2認(rèn)為雖然ADL和TEa之間沒有明確的關(guān)系，但ADL大于1/2TEa是不正常的。制造商聲明的線性偏差也是制定ADL的重要參考，前提是聲明的偏差應(yīng)滿足臨床用途。ADL可以是固定值，也可以是相對值，或二者的組合取高值，如本研究設(shè)定的ADL為3.42 μmol/L或10%(取高值)。

WS/T 408—2012更側(cè)重于對臨床是否滿足需要的判斷，本研究結(jié)果顯示，2種試劑的線性驗證均獲通過，評價標(biāo)準(zhǔn)最寬松，但散點圖(圖1)顯示在高濃度處A試劑的數(shù)據(jù)與B試劑數(shù)據(jù)相比明顯向下彎曲，平均DL的統(tǒng)計方法可能掩蓋了某些濃度點出現(xiàn)較大偏差的情況；同時，WS/T 408—2012的判斷界值均采用PctBnd=5%的標(biāo)準(zhǔn)，與檢測系統(tǒng)的性能及驗證項目的生物學(xué)變異等特性無關(guān)。總體來說，WS/T 408—2012是基于內(nèi)部統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全局通過或失敗的評估，不能提供任何偏離線性的位置、大小和意義的信息。

EP06-A和WS/T 420—2013判定2種試劑線性驗證均失敗，失敗的原因均是最低濃度樣品的線性偏差超出允許誤差范圍，二者的線性模型均采用OLS回歸，這在樣品組的重復(fù)性SD保持恒定時是合適的，但當(dāng)SD明顯依賴于濃度時，低、高濃度樣品對直線與線性數(shù)據(jù)的擬合產(chǎn)生的影響將不成比例，低濃度樣品很有可能由于較高的相對偏差而超過允許誤差范圍，此時增加低濃度處特別是醫(yī)學(xué)決定水平處的樣本數(shù)重新驗證，有可能降低高濃度樣品對回歸模型的影響，更簡單的方法是采用WLS回歸。WLS回歸可減少因偶然誤差導(dǎo)致驗證失敗的情況，這也是EP06-Ed2強烈推薦采用WLS回歸的原因。從實際應(yīng)用來看，在本研究中WLS回歸使低濃度樣本的DL明顯變小，從而使B試劑的線性獲得通過，同時又不使線性稍差的A試劑驗證通過，這種判斷尺度最合理。

用EP06-Ed2的方法分析時，2種試劑均未出現(xiàn)DL在ADL之外而90%CI與ADL相交叉的情況，因此A試劑驗證失敗和B試劑驗證通過的結(jié)論是確定的。90%CI的加入使EP06-Ed2作出結(jié)論時變得更靈活。當(dāng)出現(xiàn)這種交叉的情況時，EP06-Ed2的解釋為：線性在統(tǒng)計上是可以接受的，如果整體性能特征足以滿足臨床要求，實驗室有理由接受線性研究的結(jié)果；當(dāng)整體性能特征不足以滿足臨床要求(如超過TEa要求)時，不應(yīng)接受該線性。

從計算的復(fù)雜程度來看，WS/T 420—2013的統(tǒng)計分析最簡單；EP06-A、WS/T 408—2012的多項式回歸統(tǒng)計分析步驟較繁瑣， EP06-Ed2放棄了EP06-A的多項式回歸算法，更接近WS/T 420—2013的計算方法，但比WS/T 420—2013增加了加權(quán)回歸以及90%CI的計算步驟，計算量適中。

查閱近5年的資料發(fā)現(xiàn)，國外文獻(xiàn)在評估生化免疫類檢測系統(tǒng)線性時，大多采用EP06-A。國內(nèi)文獻(xiàn)采用EP06-A[7]和WS/T 408—2012[8]的較多，采用WS/T 420—2013的較少，近年來已逐漸有采用EP06-Ed2驗證的文獻(xiàn)發(fā)表[9]。還有部分文獻(xiàn)采用了其他驗證方法，如《臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)》[10]、CNAS-GL037《臨床化學(xué)定量檢驗程序性能驗證指南》中介紹的方法。

本研究主要從用戶體驗方面入手，對4種線性驗證標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了簡單比較，詳細(xì)演示了這些標(biāo)準(zhǔn)的驗證過程，希望對臨床實驗室掌握其驗證步驟及計算方法有所幫助。對于同一組線性驗證數(shù)據(jù)，不同標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論可能不一致，實驗室可根據(jù)實際用途以及數(shù)據(jù)組的特點選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗證。EP06-Ed2是目前最新、最全面、最合理(對于本研究數(shù)據(jù)而言)的線性驗證標(biāo)準(zhǔn)，值得推薦，EP06-A不應(yīng)再被使用。實驗室也可先采用計算最簡單的WS/T 420—2013的方法，當(dāng)驗證不通過時，再采用EP06-Ed2或WS/T 408—2012的方法繼續(xù)統(tǒng)計分析，前者采用WLS回歸分析以及90%CI可減少因偶然誤差導(dǎo)致驗證失敗的情況，后者側(cè)重于臨床標(biāo)準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)組的平均DL，更容易通過，最后再考慮縮小范圍重新驗證。WS/T 420—2013、WS/T 408—2012均已發(fā)布10年，我國新版的定量驗證程序即將發(fā)布，屆時將為臨床實驗室提供更全面的指導(dǎo)。