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        基于毛細(xì)管電泳平臺的單基因病攜帶者篩查應(yīng)用

        2022-02-03 03:37:08方玉琴張苗苗李景然唐俊湘王朝紅朱健生
        實用醫(yī)學(xué)雜志 2022年23期
        關(guān)鍵詞:遺傳病攜帶者變異

        方玉琴 張苗苗 李景然 唐俊湘 王朝紅 朱健生

        安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院(合肥 230000)

        單基因遺傳病是影響人口出生缺陷的一個重要原因,我國是出生缺陷發(fā)生率較高的國家之一,出生缺陷嚴(yán)重影響兒童的生命和生存質(zhì)量,給家庭和社會帶來沉重的精神與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。2011年BELL等首次采用二代測序進(jìn)行攜帶者篩查,發(fā)現(xiàn)人均攜帶2.8個致病基因,突出了人群中進(jìn)行攜帶者篩查的必要性。因此在表型正常的人群中進(jìn)行ECS,從中篩出攜帶常染色體隱性或X連鎖隱性遺傳病相關(guān)致病基因的個體,結(jié)合遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和輔助生殖等措施,可以有效減少缺陷兒的出生[2]。近年來,美國多家專業(yè)協(xié)會針對單基因病的攜帶者篩查先后發(fā)布了多個指南和聲明[3-5],建議針對所有有生育需求的女性及其配偶進(jìn)行篩查,同時也對疾病的選擇標(biāo)準(zhǔn)、遺傳咨詢等提出指導(dǎo)意見。

        目前,中國關(guān)于ECS的研究正處于起步階段,大眾人群對單基因遺傳病普遍認(rèn)識不足,國內(nèi)尚缺乏大量專業(yè)的遺傳咨詢?nèi)藛T,也無相關(guān)的指南或共識指導(dǎo),且現(xiàn)階段中國的攜帶者篩查多針對單種遺傳病的篩查[6-7],偶有關(guān)于ECS相關(guān)報道的研究數(shù)據(jù),例如ZHAO等[8]對中國11種隱性遺傳病的擴(kuò)展性攜帶者篩查證明了ECS在中國的可行性。為了有效預(yù)防和減少嚴(yán)重單基因隱性遺傳病的發(fā)生,并了解本地區(qū)單基因病的攜帶情況和常見變異位點,本研究通過毛細(xì)管電泳一代測序基因分析技術(shù)對來我院就診的表型正常、無遺傳病家族史的育齡人群進(jìn)行ECS,ECS包含了與15種疾病相關(guān)的21個基因中的410種致病變異,涵蓋了中國人群中最常見的遺傳病及相關(guān)致病突變,其中還包括了一些難以通過二代測序評估的特殊的高發(fā)遺傳病基因突變類型,從而幫助育齡夫婦篩查高發(fā)遺傳病突變攜帶情況,降低新生兒遺傳缺陷風(fēng)險。研究分析本地區(qū)人群的攜帶率和致病變異類型等情況,可為尋找適用于中國人群的擴(kuò)展性攜帶者篩查模式提供數(shù)據(jù)支持。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料2021年1月至2022年8月期間,收集了534例在孕前或孕早期來安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院進(jìn)行攜帶者篩查的表型正常的育齡人群,研究對象為517例接受15種擴(kuò)展性攜帶者篩查者和17例接受目標(biāo)基因測序者,其中包括140對夫婦。研究人群的平均年齡(31±4.30)歲,其中男142例(26.6%),女392例(73.4%),大多數(shù)受檢者來自中國的安徽省。在所有檢測的女性中,72.96%(286/392)在采集血樣時的生育狀態(tài)是已懷孕,孕周5~21周。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有表型正常的育齡期夫婦(包括妊娠早期的夫婦);(2)不孕不育欲輔助生殖的夫婦。排除標(biāo)準(zhǔn):高度懷疑為遺傳疾病的患者(有家族史、表型高度符合某單基因?。T跈z查前,所有受檢者都接受了關(guān)于擴(kuò)展性攜帶者篩查的目標(biāo)疾病范圍、目的、意義、局限性和殘余風(fēng)險的宣教以及專業(yè)的遺傳咨詢,對受檢者進(jìn)行詳細(xì)的知情告知。本研究通過安徽省婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號:YYLL2020?Hwk2020yb008?10?01),所有受檢者自愿接受ECS,在采血前均簽署了知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1 檢測內(nèi)容本研究篩查的15種目標(biāo)疾病為針對中國人群常見的基因型?表型聯(lián)系明確的發(fā)病率較高或預(yù)后較嚴(yán)重的單基因隱性遺傳病,選擇了21個疾病相關(guān)基因或區(qū)域的410個突變進(jìn)行檢測,這些疾病的選擇基于美國婦產(chǎn)科學(xué)會(ACOG)所發(fā)布的共識中描述的攜帶者篩查的篩選標(biāo)準(zhǔn)[3],所有致病變異的選擇是基于文獻(xiàn)綜述中中國人群報道的高頻突變位點,且在HGMD和ClinVar數(shù)據(jù)庫中明確致病的位點。表1列出了15種遺傳病及篩查基因信息。

        表1 15種遺傳病及篩查基因信息表Tab.1 Information table of fifteen genetic diseases and related genes

        1.2.2 檢測方法本研究主要依托臨床基因分析金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)平臺-毛細(xì)管電泳一代測序平臺,使用EDTA抗凝管采集受檢者外周血2 mL,用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取DNA,然后進(jìn)行探針連接、多重PCR、上機(jī)測序,使用ABI3730和ABI3500一代測序平臺完成對于目標(biāo)疾病基因多種突變類型(點突變、缺失重復(fù)、短串聯(lián)重復(fù)、倒位、基因融合等)的精準(zhǔn)測序,對數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果分析。檢測技術(shù)包括SNP scan技術(shù)(檢測點突變),CNV plex技術(shù)(檢測拷貝數(shù)變異),AQ?PLP技術(shù)(檢測倒位),特殊熒光PCR(檢測CGG重復(fù)數(shù)),iMLDR技術(shù)(檢測點突變),Gap?PCR以及Sanger測序等。

        研究中所有檢測到的基因變異均通過替代方法進(jìn)行結(jié)果驗證,對于點突變、小片段插入和缺失突變,直接通過Sanger測序驗證;另外采用Gap?PCR和MLPA(多重連接探針擴(kuò)增技術(shù))等方法學(xué)對大片段缺失和重復(fù)突變進(jìn)行驗證。

        1.2.3 篩查模式本研究包括兩種篩查模式,第一種為112對夫婦同時采集外周血進(jìn)行ECS;第二種為282例受檢者率先進(jìn)行ECS,在282例受檢者中檢出57例(20.2%)攜帶者,經(jīng)門診遺傳咨詢建議召回此部分?jǐn)y帶者的配偶進(jìn)行基因檢測,目前有28例(28/57,49.1%)配偶進(jìn)行了后續(xù)基因檢測,其中11例(39.3%)接受了ECS,另外17例(60.7%)選擇針對其配偶所攜帶的基因突變進(jìn)行目標(biāo)基因測序。

        1.2.4 檢測結(jié)果咨詢對本研究人群中檢測出的所有陽性攜帶者進(jìn)行遺傳咨詢。建議被檢出的高危夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷和或胚胎植入前單基因病遺傳檢測,以降低遺傳風(fēng)險。

        2 結(jié)果

        2.1 總體攜帶情況在517例接受ECS的受檢者中,檢出了51個(12.4%,51/410)位于13(61.9%,13/21)個基因中的不同突變位點。所有檢測到的基因變異均通過其他方法學(xué)進(jìn)行驗證,如Sanger測序、MLPA、Gap?PCR等,結(jié)果顯示,研究中檢測出的突變位點與驗證結(jié)果具有100%的一致性。在本研究中,94例(18.2%,94/517)為至少一種目標(biāo)疾病的攜帶者,表2列出了研究中所檢出的目標(biāo)疾病的攜帶情況。其中92例(97.87%,92/94)為常染色體隱性疾病攜帶者,1例(1.06%,1/94)為X連鎖疾病攜帶者,1例(1.06%,1/94)為線粒體遺傳疾病的攜帶者(圖1)。最常見的常染色體隱性疾病是遺傳性耳聾,人群攜帶率為6.38%(33/517),其次是肝豆?fàn)詈俗冃裕?.09%,16/517)和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(2.51%,13/517)。在94例已確認(rèn)的攜帶者中,75例(79.8%)攜帶一種基因變異,18例(19.1%)攜帶兩種基因變異,1例(1.1%)攜帶三種基因變異,見表2。

        圖1 女性受檢樣本MTRNR1異質(zhì)數(shù)據(jù)圖Fig.1 Map of heterogeneous data of Female sample MTRNR1

        表2 517例中目標(biāo)疾病致病基因的攜帶率Tab.2 Carrying rate of target disease pathogenic gene in 517 people

        同時,本研究檢測到一些難以通過二代測序進(jìn)行評估的疾病,如脊髓性肌萎縮癥(spinal mus?cular atrophy,SMA)、脆性X綜合征和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(congenital adrenal hyperplasia,CAH)。在517例受檢者中,12例(2.32%,12/517)為SMN1基因雜合缺失的攜帶者;13例(2.51%,13/517)為CAH攜帶者。此外,還檢出1例(0.19%,1/517)男性脆性X綜合征前突變攜帶者。

        2.2 各目標(biāo)基因的變異檢出情況本研究共檢出51種致病基因變異(表3)。共檢出18例GJB2攜帶者,最常見的突變位點是c.235delC(p.L79Cfs*3)(52.6%);檢出14例SLC26A4突變的攜帶者,最常見的突變位點是c.919?2A > G(57.1%);CYP21A2最常見的變異是c.293?13A/C > G(30.8%);外顯子7和8缺失是本研究人群中最常見的SMN1突變(100%)。本研究中GJB2、SLC26A4、CYP21A2和SMN1的突變譜與之前關(guān)于中國人群的報告一致[7,9-11]。此外,最常見的兩種 HBA 缺失是?α3.7(66.7%)和??SEA(25.0%);MMACHC最常見的突變位點是c.609G >A(p.W203*)(33.3%)和c.482G >A(p.R161Q)(33.3%);c.2333G > T(p.R778L)(20.0%)和c.3316G > A(p.V1106I)(20.0%)是ATP7B最常見的突變。本研究中HBA、MMACHC和ATP7B的突變譜與之前的報告相似[12-14]。

        表3 本研究人群中檢測到的基因變異Tab.3 Genetic variants detected in this study population

        在本研究隊列中,PAH最常見的變異是c.721C>T(p.R241C)(36.4%),其次是c.728G>A(p.R243Q)(18.2%),這與之前關(guān)于對中國人群的研究報告不一致[15]。

        2.3 檢出高風(fēng)險夫妻對及其后續(xù)遺傳咨詢本研究共檢出5對(3.57%,5/140)高危夫婦,其中4對夫婦為同一常染色體致病基因突變的攜帶者,包括1對GJB2相關(guān)的非綜合征性耳聾攜帶者、1對α?地中海貧血攜帶者和2對苯丙酮尿癥攜帶者,另1例育齡期女性為線粒體耳聾疾病攜帶者(表2)。對本研究中的5對高危夫婦進(jìn)行了遺傳咨詢,由于侵入性產(chǎn)前檢測的風(fēng)險,其中2對夫婦拒絕了產(chǎn)前診斷,另外2對攜帶苯丙酮尿癥致病基因的高危夫婦進(jìn)行了羊膜穿刺術(shù),羊水驗證結(jié)果均未檢出指定基因范圍內(nèi)的致病變異。此外,1例女性受檢者為線粒體耳聾疾病攜帶者,其遺傳模式為母系遺傳,相關(guān)研究[16]顯示,使用氨基糖苷類藥物會導(dǎo)致耳聾的發(fā)生,建議對該受檢者進(jìn)行遺傳咨詢和相關(guān)用藥指導(dǎo)。

        3 討論

        本研究采用毛細(xì)管電泳的多重PCR分析技術(shù)對來我院就診的表型正常、無遺傳病家族史的育齡夫婦進(jìn)行攜帶者篩查,該篩查體系納入了中國高發(fā)的15種遺傳病中21個相關(guān)基因或區(qū)域的410個明確致病變異,基本覆蓋高發(fā)遺傳病已知致病突變的約85%以上致病突變位點,在本研究中,94例被確定為至少一種疾病的攜帶者,總攜帶率為18.2%,高風(fēng)險夫妻對的攜帶率為3.57%,體現(xiàn)了在我國開展擴(kuò)展性攜帶者篩查的必要性。

        在本研究中,攜帶者篩查的總攜帶率為18.2%,這與 HU 和 TAN 等[17](18.5%)的結(jié)果相似,低于ZHAO 等[8](27.5%)和 LAZARIN 等[18](24.0%)的研究結(jié)果,表4總結(jié)了國內(nèi)外人群的相關(guān)研究。本研究中攜帶率居于首位的遺傳病為遺傳性耳聾(6.4%),文鋮等[19]的數(shù)據(jù)分析顯示,GJB2基因單雜合突變率為2.43%,SLC26A4基因單雜合突變率為1.99%。本研究中最常見的耳聾基因是GJB2,攜帶率為3.45%,其次是SLC26A4基因(2.70%),均高于文鋮等人的結(jié)果,因此對本地區(qū)人群進(jìn)行遺傳性耳聾疾病篩查,有利于早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早干預(yù)。而α?地中海貧血和β?地中海貧血的攜帶率遠(yuǎn)低于ZHAO等[8]的研究,這可能是由于其研究人群為我國地貧高發(fā)的南方地區(qū)。本研究中肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因的攜帶率為3.13%,高于山東青島1.46%[20];苯丙酮尿癥PAH基因攜帶率為2.13%,高于中國東部1.73%[21];甲基丙二酸血癥MMACHC基因和MMUT基因總攜帶率為1.35%,低于青島2.50%[20]。此外,本研究還納入了二代測序無法檢測的導(dǎo)致高發(fā)且嚴(yán)重致病疾病的特殊變異類型,包括CAH、SMA和脆性X綜合征,其中SMA和脆性X綜合征癥狀嚴(yán)重,并且是ACOG建議所有育齡婦女篩查的疾病[3]。本研究中CAH的攜帶率為1/40,SMA的攜帶率為2.3%,這兩種疾病的攜帶率與之前在中國人群中報告的一致[22-23]。此外,研究中檢出1例男性脆性X綜合征前突變攜帶者,前突變的男性攜帶者有患遲發(fā)性脆性X染色體相關(guān)震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征的風(fēng)險,在向下一代傳遞時CGG重復(fù)順序并不擴(kuò)增,因此男性前突變攜帶者一般不會增加胎兒患病風(fēng)險,但若生育女兒,為前突變攜帶者[24-25]。本研究與西方人群[18]篩查結(jié)果相比,篩查出的疾病種類和攜帶率有顯著差異,這表明西方國家推薦篩查的部分疾病種類可能不適用于其他人群。綜上,本研究分析結(jié)果與以往的報道有所不同的可能原因是與所研究人群的地域不同、種族不同、樣本量不同、篩查的疾病種類不同以及測序平臺的差異有關(guān)。因此針對不同地區(qū)和種族,需要制訂合適的人群攜帶者篩查模式與實施方案。

        表4 國內(nèi)外人群攜帶率比較Tab.4 Comparison of carrying rate between the Chinese and foreign population

        本研究發(fā)現(xiàn)140對夫婦中5對(3.57%)為高危夫婦,其中4對(80%)夫婦為同一常染色體致病基因攜帶者和1例(20%)女性為線粒體耳聾疾病攜帶者。所有這些高危夫婦都需進(jìn)行遺傳咨詢,檢測結(jié)果有利于臨床醫(yī)生對受檢者進(jìn)行生育指導(dǎo),有效避免和減少單基因遺傳病患兒的出生。

        本研究的優(yōu)勢在于其檢測成本顯著低于二代測序,且報告結(jié)果易于臨床醫(yī)生進(jìn)行解讀,減輕遺傳咨詢負(fù)擔(dān)和患者的焦慮,并可以對一些特殊基因變異進(jìn)行檢測,如假基因、倒位和CGG重復(fù)突變等,有利于在臨床上開展實施ECS,有效預(yù)防常見單基因病患兒的發(fā)生。其次,中國人群中許多罕見疾病的發(fā)病率和疾病基因的突變譜仍不確定[26],某些罕見的遺傳病篩查可能會給臨床醫(yī)生評估殘余風(fēng)險帶來挑戰(zhàn),因此,在中國,包含數(shù)十種遺傳病的篩查體系更適用于攜帶者篩查[27],本研究為ECS提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方案。最后本研究還報告了中國人群中幾種常見疾病的攜帶率,為構(gòu)建屬于中國人群的基因變異數(shù)據(jù)庫積累相關(guān)數(shù)據(jù)。而本研究還有一些值得注意的局限性。首先,本研究的樣本量相對較小,研究人群所處地域相對集中,還需進(jìn)一步擴(kuò)大研究。第二,我們目前在研究人群中觀察到了15種遺傳病中的8種疾病,可能與樣本量較小和所篩查的疾病種類有關(guān),未來將納入更多的受檢者,并根據(jù)研究結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化篩查體系中包括的基因和致病變異種類。第三,本研究納入的是有限的明確致病位點,無法識別檢測范圍外的致病變異和新發(fā)變異,這可能增加殘余風(fēng)險,需要在檢測前和檢測后的咨詢中予以強(qiáng)調(diào),告知受檢者本研究的益處、局限性和潛在風(fēng)險。

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