方玉琴 張苗苗 李景然 唐俊湘 王朝紅 朱健生

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院（合肥 230000）

單基因遺傳病是影響人口出生缺陷的一個(gè)重要原因，我國(guó)是出生缺陷發(fā)生率較高的國(guó)家之一，出生缺陷嚴(yán)重影響兒童的生命和生存質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的精神與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。2011年BELL等首次采用二代測(cè)序進(jìn)行攜帶者篩查，發(fā)現(xiàn)人均攜帶2.8個(gè)致病基因，突出了人群中進(jìn)行攜帶者篩查的必要性。因此在表型正常的人群中進(jìn)行ECS，從中篩出攜帶常染色體隱性或X連鎖隱性遺傳病相關(guān)致病基因的個(gè)體，結(jié)合遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和輔助生殖等措施，可以有效減少缺陷兒的出生[2]。近年來(lái)，美國(guó)多家專業(yè)協(xié)會(huì)針對(duì)單基因病的攜帶者篩查先后發(fā)布了多個(gè)指南和聲明[3-5]，建議針對(duì)所有有生育需求的女性及其配偶進(jìn)行篩查，同時(shí)也對(duì)疾病的選擇標(biāo)準(zhǔn)、遺傳咨詢等提出指導(dǎo)意見(jiàn)。

目前，中國(guó)關(guān)于ECS的研究正處于起步階段，大眾人群對(duì)單基因遺傳病普遍認(rèn)識(shí)不足，國(guó)內(nèi)尚缺乏大量專業(yè)的遺傳咨詢?nèi)藛T，也無(wú)相關(guān)的指南或共識(shí)指導(dǎo)，且現(xiàn)階段中國(guó)的攜帶者篩查多針對(duì)單種遺傳病的篩查[6-7]，偶有關(guān)于ECS相關(guān)報(bào)道的研究數(shù)據(jù)，例如ZHAO等[8]對(duì)中國(guó)11種隱性遺傳病的擴(kuò)展性攜帶者篩查證明了ECS在中國(guó)的可行性。為了有效預(yù)防和減少嚴(yán)重單基因隱性遺傳病的發(fā)生，并了解本地區(qū)單基因病的攜帶情況和常見(jiàn)變異位點(diǎn)，本研究通過(guò)毛細(xì)管電泳一代測(cè)序基因分析技術(shù)對(duì)來(lái)我院就診的表型正常、無(wú)遺傳病家族史的育齡人群進(jìn)行ECS，ECS包含了與15種疾病相關(guān)的21個(gè)基因中的410種致病變異，涵蓋了中國(guó)人群中最常見(jiàn)的遺傳病及相關(guān)致病突變，其中還包括了一些難以通過(guò)二代測(cè)序評(píng)估的特殊的高發(fā)遺傳病基因突變類型，從而幫助育齡夫婦篩查高發(fā)遺傳病突變攜帶情況，降低新生兒遺傳缺陷風(fēng)險(xiǎn)。研究分析本地區(qū)人群的攜帶率和致病變異類型等情況，可為尋找適用于中國(guó)人群的擴(kuò)展性攜帶者篩查模式提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料2021年1月至2022年8月期間，收集了534例在孕前或孕早期來(lái)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院進(jìn)行攜帶者篩查的表型正常的育齡人群，研究對(duì)象為517例接受15種擴(kuò)展性攜帶者篩查者和17例接受目標(biāo)基因測(cè)序者，其中包括140對(duì)夫婦。研究人群的平均年齡（31±4.30）歲，其中男142例（26.6%），女392例（73.4%），大多數(shù)受檢者來(lái)自中國(guó)的安徽省。在所有檢測(cè)的女性中，72.96%（286/392）在采集血樣時(shí)的生育狀態(tài)是已懷孕，孕周5～21周。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有表型正常的育齡期夫婦（包括妊娠早期的夫婦）；（2）不孕不育欲輔助生殖的夫婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：高度懷疑為遺傳疾病的患者（有家族史、表型高度符合某單基因?。?。在檢查前，所有受檢者都接受了關(guān)于擴(kuò)展性攜帶者篩查的目標(biāo)疾病范圍、目的、意義、局限性和殘余風(fēng)險(xiǎn)的宣教以及專業(yè)的遺傳咨詢，對(duì)受檢者進(jìn)行詳細(xì)的知情告知。本研究通過(guò)安徽省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：YYLL2020?Hwk2020yb008?10?01），所有受檢者自愿接受ECS，在采血前均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)內(nèi)容本研究篩查的15種目標(biāo)疾病為針對(duì)中國(guó)人群常見(jiàn)的基因型?表型聯(lián)系明確的發(fā)病率較高或預(yù)后較嚴(yán)重的單基因隱性遺傳病，選擇了21個(gè)疾病相關(guān)基因或區(qū)域的410個(gè)突變進(jìn)行檢測(cè)，這些疾病的選擇基于美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)（ACOG）所發(fā)布的共識(shí)中描述的攜帶者篩查的篩選標(biāo)準(zhǔn)[3]，所有致病變異的選擇是基于文獻(xiàn)綜述中中國(guó)人群報(bào)道的高頻突變位點(diǎn)，且在HGMD和ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中明確致病的位點(diǎn)。表1列出了15種遺傳病及篩查基因信息。

表1 15種遺傳病及篩查基因信息表Tab.1 Information table of fifteen genetic diseases and related genes

1.2.2 檢測(cè)方法本研究主要依托臨床基因分析金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)平臺(tái)-毛細(xì)管電泳一代測(cè)序平臺(tái)，使用EDTA抗凝管采集受檢者外周血2 mL，用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技）提取DNA，然后進(jìn)行探針連接、多重PCR、上機(jī)測(cè)序，使用ABI3730和ABI3500一代測(cè)序平臺(tái)完成對(duì)于目標(biāo)疾病基因多種突變類型（點(diǎn)突變、缺失重復(fù)、短串聯(lián)重復(fù)、倒位、基因融合等）的精準(zhǔn)測(cè)序，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果分析。檢測(cè)技術(shù)包括SNP scan技術(shù)（檢測(cè)點(diǎn)突變），CNV plex技術(shù)（檢測(cè)拷貝數(shù)變異），AQ?PLP技術(shù)（檢測(cè)倒位），特殊熒光PCR（檢測(cè)CGG重復(fù)數(shù)），iMLDR技術(shù)（檢測(cè)點(diǎn)突變），Gap?PCR以及Sanger測(cè)序等。

研究中所有檢測(cè)到的基因變異均通過(guò)替代方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，對(duì)于點(diǎn)突變、小片段插入和缺失突變，直接通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證；另外采用Gap?PCR和MLPA（多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)）等方法學(xué)對(duì)大片段缺失和重復(fù)突變進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 篩查模式本研究包括兩種篩查模式，第一種為112對(duì)夫婦同時(shí)采集外周血進(jìn)行ECS；第二種為282例受檢者率先進(jìn)行ECS，在282例受檢者中檢出57例（20.2%）攜帶者，經(jīng)門(mén)診遺傳咨詢建議召回此部分?jǐn)y帶者的配偶進(jìn)行基因檢測(cè)，目前有28例（28/57，49.1%）配偶進(jìn)行了后續(xù)基因檢測(cè)，其中11例（39.3%）接受了ECS，另外17例（60.7%）選擇針對(duì)其配偶所攜帶的基因突變進(jìn)行目標(biāo)基因測(cè)序。

1.2.4 檢測(cè)結(jié)果咨詢對(duì)本研究人群中檢測(cè)出的所有陽(yáng)性攜帶者進(jìn)行遺傳咨詢。建議被檢出的高危夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷和或胚胎植入前單基因病遺傳檢測(cè)，以降低遺傳風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié)果

2.1 總體攜帶情況在517例接受ECS的受檢者中，檢出了51個(gè)（12.4%，51/410）位于13（61.9%，13/21）個(gè)基因中的不同突變位點(diǎn)。所有檢測(cè)到的基因變異均通過(guò)其他方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，如Sanger測(cè)序、MLPA、Gap?PCR等，結(jié)果顯示，研究中檢測(cè)出的突變位點(diǎn)與驗(yàn)證結(jié)果具有100%的一致性。在本研究中，94例（18.2%，94/517）為至少一種目標(biāo)疾病的攜帶者，表2列出了研究中所檢出的目標(biāo)疾病的攜帶情況。其中92例（97.87%，92/94）為常染色體隱性疾病攜帶者，1例（1.06%，1/94）為X連鎖疾病攜帶者，1例（1.06%，1/94）為線粒體遺傳疾病的攜帶者（圖1）。最常見(jiàn)的常染色體隱性疾病是遺傳性耳聾，人群攜帶率為6.38%（33/517），其次是肝豆?fàn)詈俗冃裕?.09%，16/517）和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（2.51%，13/517）。在94例已確認(rèn)的攜帶者中，75例（79.8%）攜帶一種基因變異，18例（19.1%）攜帶兩種基因變異，1例（1.1%）攜帶三種基因變異，見(jiàn)表2。

圖1 女性受檢樣本MTRNR1異質(zhì)數(shù)據(jù)圖Fig.1 Map of heterogeneous data of Female sample MTRNR1

表2 517例中目標(biāo)疾病致病基因的攜帶率Tab.2 Carrying rate of target disease pathogenic gene in 517 people

同時(shí)，本研究檢測(cè)到一些難以通過(guò)二代測(cè)序進(jìn)行評(píng)估的疾病，如脊髓性肌萎縮癥（spinal mus?cular atrophy，SMA）、脆性X綜合征和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）。在517例受檢者中，12例（2.32%，12/517）為SMN1基因雜合缺失的攜帶者；13例（2.51%，13/517）為CAH攜帶者。此外，還檢出1例（0.19%，1/517）男性脆性X綜合征前突變攜帶者。

2.2 各目標(biāo)基因的變異檢出情況本研究共檢出51種致病基因變異（表3）。共檢出18例GJB2攜帶者，最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是c.235delC（p.L79Cfs*3）（52.6%）；檢出14例SLC26A4突變的攜帶者，最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是c.919?2A ＞ G（57.1%）；CYP21A2最常見(jiàn)的變異是c.293?13A/C ＞ G（30.8%）；外顯子7和8缺失是本研究人群中最常見(jiàn)的SMN1突變（100%）。本研究中GJB2、SLC26A4、CYP21A2和SMN1的突變譜與之前關(guān)于中國(guó)人群的報(bào)告一致[7，9-11]。此外，最常見(jiàn)的兩種 HBA 缺失是?α3.7（66.7%）和??SEA（25.0%）；MMACHC最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是c.609G ＞A（p.W203*）（33.3%）和c.482G ＞A（p.R161Q）（33.3%）；c.2333G ＞ T（p.R778L）（20.0%）和c.3316G ＞ A（p.V1106I）（20.0%）是ATP7B最常見(jiàn)的突變。本研究中HBA、MMACHC和ATP7B的突變譜與之前的報(bào)告相似[12-14]。

表3 本研究人群中檢測(cè)到的基因變異Tab.3 Genetic variants detected in this study population

在本研究隊(duì)列中，PAH最常見(jiàn)的變異是c.721C＞T（p.R241C）（36.4%），其次是c.728G＞A（p.R243Q）（18.2%），這與之前關(guān)于對(duì)中國(guó)人群的研究報(bào)告不一致[15]。

2.3 檢出高風(fēng)險(xiǎn)夫妻對(duì)及其后續(xù)遺傳咨詢本研究共檢出5對(duì)（3.57%，5/140）高危夫婦，其中4對(duì)夫婦為同一常染色體致病基因突變的攜帶者，包括1對(duì)GJB2相關(guān)的非綜合征性耳聾攜帶者、1對(duì)α?地中海貧血攜帶者和2對(duì)苯丙酮尿癥攜帶者，另1例育齡期女性為線粒體耳聾疾病攜帶者（表2）。對(duì)本研究中的5對(duì)高危夫婦進(jìn)行了遺傳咨詢，由于侵入性產(chǎn)前檢測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)，其中2對(duì)夫婦拒絕了產(chǎn)前診斷，另外2對(duì)攜帶苯丙酮尿癥致病基因的高危夫婦進(jìn)行了羊膜穿刺術(shù)，羊水驗(yàn)證結(jié)果均未檢出指定基因范圍內(nèi)的致病變異。此外，1例女性受檢者為線粒體耳聾疾病攜帶者，其遺傳模式為母系遺傳，相關(guān)研究[16]顯示，使用氨基糖苷類藥物會(huì)導(dǎo)致耳聾的發(fā)生，建議對(duì)該受檢者進(jìn)行遺傳咨詢和相關(guān)用藥指導(dǎo)。

3 討論

本研究采用毛細(xì)管電泳的多重PCR分析技術(shù)對(duì)來(lái)我院就診的表型正常、無(wú)遺傳病家族史的育齡夫婦進(jìn)行攜帶者篩查，該篩查體系納入了中國(guó)高發(fā)的15種遺傳病中21個(gè)相關(guān)基因或區(qū)域的410個(gè)明確致病變異，基本覆蓋高發(fā)遺傳病已知致病突變的約85%以上致病突變位點(diǎn)，在本研究中，94例被確定為至少一種疾病的攜帶者，總攜帶率為18.2%，高風(fēng)險(xiǎn)夫妻對(duì)的攜帶率為3.57%，體現(xiàn)了在我國(guó)開(kāi)展擴(kuò)展性攜帶者篩查的必要性。

在本研究中，攜帶者篩查的總攜帶率為18.2%，這與 HU 和 TAN 等[17]（18.5%）的結(jié)果相似，低于ZHAO 等[8]（27.5%）和 LAZARIN 等[18]（24.0%）的研究結(jié)果，表4總結(jié)了國(guó)內(nèi)外人群的相關(guān)研究。本研究中攜帶率居于首位的遺傳病為遺傳性耳聾（6.4%），文鋮等[19]的數(shù)據(jù)分析顯示，GJB2基因單雜合突變率為2.43%，SLC26A4基因單雜合突變率為1.99%。本研究中最常見(jiàn)的耳聾基因是GJB2，攜帶率為3.45%，其次是SLC26A4基因（2.70%），均高于文鋮等人的結(jié)果，因此對(duì)本地區(qū)人群進(jìn)行遺傳性耳聾疾病篩查，有利于早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早干預(yù)。而α?地中海貧血和β?地中海貧血的攜帶率遠(yuǎn)低于ZHAO等[8]的研究，這可能是由于其研究人群為我國(guó)地貧高發(fā)的南方地區(qū)。本研究中肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因的攜帶率為3.13%，高于山東青島1.46%[20]；苯丙酮尿癥PAH基因攜帶率為2.13%，高于中國(guó)東部1.73%[21]；甲基丙二酸血癥MMACHC基因和MMUT基因總攜帶率為1.35%，低于青島2.50%[20]。此外，本研究還納入了二代測(cè)序無(wú)法檢測(cè)的導(dǎo)致高發(fā)且嚴(yán)重致病疾病的特殊變異類型，包括CAH、SMA和脆性X綜合征，其中SMA和脆性X綜合征癥狀嚴(yán)重，并且是ACOG建議所有育齡婦女篩查的疾病[3]。本研究中CAH的攜帶率為1/40，SMA的攜帶率為2.3%，這兩種疾病的攜帶率與之前在中國(guó)人群中報(bào)告的一致[22-23]。此外，研究中檢出1例男性脆性X綜合征前突變攜帶者，前突變的男性攜帶者有患遲發(fā)性脆性X染色體相關(guān)震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征的風(fēng)險(xiǎn)，在向下一代傳遞時(shí)CGG重復(fù)順序并不擴(kuò)增，因此男性前突變攜帶者一般不會(huì)增加胎兒患病風(fēng)險(xiǎn)，但若生育女兒，為前突變攜帶者[24-25]。本研究與西方人群[18]篩查結(jié)果相比，篩查出的疾病種類和攜帶率有顯著差異，這表明西方國(guó)家推薦篩查的部分疾病種類可能不適用于其他人群。綜上，本研究分析結(jié)果與以往的報(bào)道有所不同的可能原因是與所研究人群的地域不同、種族不同、樣本量不同、篩查的疾病種類不同以及測(cè)序平臺(tái)的差異有關(guān)。因此針對(duì)不同地區(qū)和種族，需要制訂合適的人群攜帶者篩查模式與實(shí)施方案。

表4 國(guó)內(nèi)外人群攜帶率比較Tab.4 Comparison of carrying rate between the Chinese and foreign population

本研究發(fā)現(xiàn)140對(duì)夫婦中5對(duì)（3.57%）為高危夫婦，其中4對(duì)（80%）夫婦為同一常染色體致病基因攜帶者和1例（20%）女性為線粒體耳聾疾病攜帶者。所有這些高危夫婦都需進(jìn)行遺傳咨詢，檢測(cè)結(jié)果有利于臨床醫(yī)生對(duì)受檢者進(jìn)行生育指導(dǎo)，有效避免和減少單基因遺傳病患兒的出生。

本研究的優(yōu)勢(shì)在于其檢測(cè)成本顯著低于二代測(cè)序，且報(bào)告結(jié)果易于臨床醫(yī)生進(jìn)行解讀，減輕遺傳咨詢負(fù)擔(dān)和患者的焦慮，并可以對(duì)一些特殊基因變異進(jìn)行檢測(cè)，如假基因、倒位和CGG重復(fù)突變等，有利于在臨床上開(kāi)展實(shí)施ECS，有效預(yù)防常見(jiàn)單基因病患兒的發(fā)生。其次，中國(guó)人群中許多罕見(jiàn)疾病的發(fā)病率和疾病基因的突變譜仍不確定[26]，某些罕見(jiàn)的遺傳病篩查可能會(huì)給臨床醫(yī)生評(píng)估殘余風(fēng)險(xiǎn)帶來(lái)挑戰(zhàn)，因此，在中國(guó)，包含數(shù)十種遺傳病的篩查體系更適用于攜帶者篩查[27]，本研究為ECS提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的方案。最后本研究還報(bào)告了中國(guó)人群中幾種常見(jiàn)疾病的攜帶率，為構(gòu)建屬于中國(guó)人群的基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)積累相關(guān)數(shù)據(jù)。而本研究還有一些值得注意的局限性。首先，本研究的樣本量相對(duì)較小，研究人群所處地域相對(duì)集中，還需進(jìn)一步擴(kuò)大研究。第二，我們目前在研究人群中觀察到了15種遺傳病中的8種疾病，可能與樣本量較小和所篩查的疾病種類有關(guān)，未來(lái)將納入更多的受檢者，并根據(jù)研究結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化篩查體系中包括的基因和致病變異種類。第三，本研究納入的是有限的明確致病位點(diǎn)，無(wú)法識(shí)別檢測(cè)范圍外的致病變異和新發(fā)變異，這可能增加殘余風(fēng)險(xiǎn)，需要在檢測(cè)前和檢測(cè)后的咨詢中予以強(qiáng)調(diào)，告知受檢者本研究的益處、局限性和潛在風(fēng)險(xiǎn)。