方玉琴 張苗苗 李景然 唐俊湘 王朝紅 朱健生

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院（合肥 230000）

單基因遺傳病是影響人口出生缺陷的一個重要原因，我國是出生缺陷發(fā)生率較高的國家之一，出生缺陷嚴(yán)重影響兒童的生命和生存質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重的精神與經(jīng)濟負擔(dān)[1]。2011年BELL等首次采用二代測序進行攜帶者篩查，發(fā)現(xiàn)人均攜帶2.8個致病基因，突出了人群中進行攜帶者篩查的必要性。因此在表型正常的人群中進行ECS，從中篩出攜帶常染色體隱性或X連鎖隱性遺傳病相關(guān)致病基因的個體，結(jié)合遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和輔助生殖等措施，可以有效減少缺陷兒的出生[2]。近年來，美國多家專業(yè)協(xié)會針對單基因病的攜帶者篩查先后發(fā)布了多個指南和聲明[3-5]，建議針對所有有生育需求的女性及其配偶進行篩查，同時也對疾病的選擇標(biāo)準(zhǔn)、遺傳咨詢等提出指導(dǎo)意見。

目前，中國關(guān)于ECS的研究正處于起步階段，大眾人群對單基因遺傳病普遍認識不足，國內(nèi)尚缺乏大量專業(yè)的遺傳咨詢?nèi)藛T，也無相關(guān)的指南或共識指導(dǎo)，且現(xiàn)階段中國的攜帶者篩查多針對單種遺傳病的篩查[6-7]，偶有關(guān)于ECS相關(guān)報道的研究數(shù)據(jù)，例如ZHAO等[8]對中國11種隱性遺傳病的擴展性攜帶者篩查證明了ECS在中國的可行性。為了有效預(yù)防和減少嚴(yán)重單基因隱性遺傳病的發(fā)生，并了解本地區(qū)單基因病的攜帶情況和常見變異位點，本研究通過毛細管電泳一代測序基因分析技術(shù)對來我院就診的表型正常、無遺傳病家族史的育齡人群進行ECS，ECS包含了與15種疾病相關(guān)的21個基因中的410種致病變異，涵蓋了中國人群中最常見的遺傳病及相關(guān)致病突變，其中還包括了一些難以通過二代測序評估的特殊的高發(fā)遺傳病基因突變類型，從而幫助育齡夫婦篩查高發(fā)遺傳病突變攜帶情況，降低新生兒遺傳缺陷風(fēng)險。研究分析本地區(qū)人群的攜帶率和致病變異類型等情況，可為尋找適用于中國人群的擴展性攜帶者篩查模式提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料2021年1月至2022年8月期間，收集了534例在孕前或孕早期來安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院進行攜帶者篩查的表型正常的育齡人群，研究對象為517例接受15種擴展性攜帶者篩查者和17例接受目標(biāo)基因測序者，其中包括140對夫婦。研究人群的平均年齡（31±4.30）歲，其中男142例（26.6%），女392例（73.4%），大多數(shù)受檢者來自中國的安徽省。在所有檢測的女性中，72.96%（286/392）在采集血樣時的生育狀態(tài)是已懷孕，孕周5～21周。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有表型正常的育齡期夫婦（包括妊娠早期的夫婦）；（2）不孕不育欲輔助生殖的夫婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：高度懷疑為遺傳疾病的患者（有家族史、表型高度符合某單基因?。?。在檢查前，所有受檢者都接受了關(guān)于擴展性攜帶者篩查的目標(biāo)疾病范圍、目的、意義、局限性和殘余風(fēng)險的宣教以及專業(yè)的遺傳咨詢，對受檢者進行詳細的知情告知。本研究通過安徽省婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：YYLL2020?Hwk2020yb008?10?01），所有受檢者自愿接受ECS，在采血前均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測內(nèi)容本研究篩查的15種目標(biāo)疾病為針對中國人群常見的基因型?表型聯(lián)系明確的發(fā)病率較高或預(yù)后較嚴(yán)重的單基因隱性遺傳病，選擇了21個疾病相關(guān)基因或區(qū)域的410個突變進行檢測，這些疾病的選擇基于美國婦產(chǎn)科學(xué)會（ACOG）所發(fā)布的共識中描述的攜帶者篩查的篩選標(biāo)準(zhǔn)[3]，所有致病變異的選擇是基于文獻綜述中中國人群報道的高頻突變位點，且在HGMD和ClinVar數(shù)據(jù)庫中明確致病的位點。表1列出了15種遺傳病及篩查基因信息。

表1 15種遺傳病及篩查基因信息表Tab.1 Information table of fifteen genetic diseases and related genes

1.2.2 檢測方法本研究主要依托臨床基因分析金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)平臺-毛細管電泳一代測序平臺，使用EDTA抗凝管采集受檢者外周血2 mL，用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技）提取DNA，然后進行探針連接、多重PCR、上機測序，使用ABI3730和ABI3500一代測序平臺完成對于目標(biāo)疾病基因多種突變類型（點突變、缺失重復(fù)、短串聯(lián)重復(fù)、倒位、基因融合等）的精準(zhǔn)測序，對數(shù)據(jù)進行結(jié)果分析。檢測技術(shù)包括SNP scan技術(shù)（檢測點突變），CNV plex技術(shù)（檢測拷貝數(shù)變異），AQ?PLP技術(shù)（檢測倒位），特殊熒光PCR（檢測CGG重復(fù)數(shù)），iMLDR技術(shù)（檢測點突變），Gap?PCR以及Sanger測序等。

研究中所有檢測到的基因變異均通過替代方法進行結(jié)果驗證，對于點突變、小片段插入和缺失突變，直接通過Sanger測序驗證；另外采用Gap?PCR和MLPA（多重連接探針擴增技術(shù)）等方法學(xué)對大片段缺失和重復(fù)突變進行驗證。

1.2.3 篩查模式本研究包括兩種篩查模式，第一種為112對夫婦同時采集外周血進行ECS；第二種為282例受檢者率先進行ECS，在282例受檢者中檢出57例（20.2%）攜帶者，經(jīng)門診遺傳咨詢建議召回此部分攜帶者的配偶進行基因檢測，目前有28例（28/57，49.1%）配偶進行了后續(xù)基因檢測，其中11例（39.3%）接受了ECS，另外17例（60.7%）選擇針對其配偶所攜帶的基因突變進行目標(biāo)基因測序。

1.2.4 檢測結(jié)果咨詢對本研究人群中檢測出的所有陽性攜帶者進行遺傳咨詢。建議被檢出的高危夫婦進行產(chǎn)前診斷和或胚胎植入前單基因病遺傳檢測，以降低遺傳風(fēng)險。

2 結(jié)果

2.1 總體攜帶情況在517例接受ECS的受檢者中，檢出了51個（12.4%，51/410）位于13（61.9%，13/21）個基因中的不同突變位點。所有檢測到的基因變異均通過其他方法學(xué)進行驗證，如Sanger測序、MLPA、Gap?PCR等，結(jié)果顯示，研究中檢測出的突變位點與驗證結(jié)果具有100%的一致性。在本研究中，94例（18.2%，94/517）為至少一種目標(biāo)疾病的攜帶者，表2列出了研究中所檢出的目標(biāo)疾病的攜帶情況。其中92例（97.87%，92/94）為常染色體隱性疾病攜帶者，1例（1.06%，1/94）為X連鎖疾病攜帶者，1例（1.06%，1/94）為線粒體遺傳疾病的攜帶者（圖1）。最常見的常染色體隱性疾病是遺傳性耳聾，人群攜帶率為6.38%（33/517），其次是肝豆?fàn)詈俗冃裕?.09%，16/517）和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（2.51%，13/517）。在94例已確認的攜帶者中，75例（79.8%）攜帶一種基因變異，18例（19.1%）攜帶兩種基因變異，1例（1.1%）攜帶三種基因變異，見表2。

圖1 女性受檢樣本MTRNR1異質(zhì)數(shù)據(jù)圖Fig.1 Map of heterogeneous data of Female sample MTRNR1

表2 517例中目標(biāo)疾病致病基因的攜帶率Tab.2 Carrying rate of target disease pathogenic gene in 517 people

同時，本研究檢測到一些難以通過二代測序進行評估的疾病，如脊髓性肌萎縮癥（spinal mus?cular atrophy，SMA）、脆性X綜合征和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）。在517例受檢者中，12例（2.32%，12/517）為SMN1基因雜合缺失的攜帶者；13例（2.51%，13/517）為CAH攜帶者。此外，還檢出1例（0.19%，1/517）男性脆性X綜合征前突變攜帶者。

2.2 各目標(biāo)基因的變異檢出情況本研究共檢出51種致病基因變異（表3）。共檢出18例GJB2攜帶者，最常見的突變位點是c.235delC（p.L79Cfs*3）（52.6%）；檢出14例SLC26A4突變的攜帶者，最常見的突變位點是c.919?2A ＞ G（57.1%）；CYP21A2最常見的變異是c.293?13A/C ＞ G（30.8%）；外顯子7和8缺失是本研究人群中最常見的SMN1突變（100%）。本研究中GJB2、SLC26A4、CYP21A2和SMN1的突變譜與之前關(guān)于中國人群的報告一致[7，9-11]。此外，最常見的兩種 HBA 缺失是?α3.7（66.7%）和??SEA（25.0%）；MMACHC最常見的突變位點是c.609G ＞A（p.W203*）（33.3%）和c.482G ＞A（p.R161Q）（33.3%）；c.2333G ＞ T（p.R778L）（20.0%）和c.3316G ＞ A（p.V1106I）（20.0%）是ATP7B最常見的突變。本研究中HBA、MMACHC和ATP7B的突變譜與之前的報告相似[12-14]。

表3 本研究人群中檢測到的基因變異Tab.3 Genetic variants detected in this study population

在本研究隊列中，PAH最常見的變異是c.721C＞T（p.R241C）（36.4%），其次是c.728G＞A（p.R243Q）（18.2%），這與之前關(guān)于對中國人群的研究報告不一致[15]。

2.3 檢出高風(fēng)險夫妻對及其后續(xù)遺傳咨詢本研究共檢出5對（3.57%，5/140）高危夫婦，其中4對夫婦為同一常染色體致病基因突變的攜帶者，包括1對GJB2相關(guān)的非綜合征性耳聾攜帶者、1對α?地中海貧血攜帶者和2對苯丙酮尿癥攜帶者，另1例育齡期女性為線粒體耳聾疾病攜帶者（表2）。對本研究中的5對高危夫婦進行了遺傳咨詢，由于侵入性產(chǎn)前檢測的風(fēng)險，其中2對夫婦拒絕了產(chǎn)前診斷，另外2對攜帶苯丙酮尿癥致病基因的高危夫婦進行了羊膜穿刺術(shù)，羊水驗證結(jié)果均未檢出指定基因范圍內(nèi)的致病變異。此外，1例女性受檢者為線粒體耳聾疾病攜帶者，其遺傳模式為母系遺傳，相關(guān)研究[16]顯示，使用氨基糖苷類藥物會導(dǎo)致耳聾的發(fā)生，建議對該受檢者進行遺傳咨詢和相關(guān)用藥指導(dǎo)。

3 討論

本研究采用毛細管電泳的多重PCR分析技術(shù)對來我院就診的表型正常、無遺傳病家族史的育齡夫婦進行攜帶者篩查，該篩查體系納入了中國高發(fā)的15種遺傳病中21個相關(guān)基因或區(qū)域的410個明確致病變異，基本覆蓋高發(fā)遺傳病已知致病突變的約85%以上致病突變位點，在本研究中，94例被確定為至少一種疾病的攜帶者，總攜帶率為18.2%，高風(fēng)險夫妻對的攜帶率為3.57%，體現(xiàn)了在我國開展擴展性攜帶者篩查的必要性。

在本研究中，攜帶者篩查的總攜帶率為18.2%，這與 HU 和 TAN 等[17]（18.5%）的結(jié)果相似，低于ZHAO 等[8]（27.5%）和 LAZARIN 等[18]（24.0%）的研究結(jié)果，表4總結(jié)了國內(nèi)外人群的相關(guān)研究。本研究中攜帶率居于首位的遺傳病為遺傳性耳聾（6.4%），文鋮等[19]的數(shù)據(jù)分析顯示，GJB2基因單雜合突變率為2.43%，SLC26A4基因單雜合突變率為1.99%。本研究中最常見的耳聾基因是GJB2，攜帶率為3.45%，其次是SLC26A4基因（2.70%），均高于文鋮等人的結(jié)果，因此對本地區(qū)人群進行遺傳性耳聾疾病篩查，有利于早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早干預(yù)。而α?地中海貧血和β?地中海貧血的攜帶率遠低于ZHAO等[8]的研究，這可能是由于其研究人群為我國地貧高發(fā)的南方地區(qū)。本研究中肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因的攜帶率為3.13%，高于山東青島1.46%[20]；苯丙酮尿癥PAH基因攜帶率為2.13%，高于中國東部1.73%[21]；甲基丙二酸血癥MMACHC基因和MMUT基因總攜帶率為1.35%，低于青島2.50%[20]。此外，本研究還納入了二代測序無法檢測的導(dǎo)致高發(fā)且嚴(yán)重致病疾病的特殊變異類型，包括CAH、SMA和脆性X綜合征，其中SMA和脆性X綜合征癥狀嚴(yán)重，并且是ACOG建議所有育齡婦女篩查的疾病[3]。本研究中CAH的攜帶率為1/40，SMA的攜帶率為2.3%，這兩種疾病的攜帶率與之前在中國人群中報告的一致[22-23]。此外，研究中檢出1例男性脆性X綜合征前突變攜帶者，前突變的男性攜帶者有患遲發(fā)性脆性X染色體相關(guān)震顫/共濟失調(diào)綜合征的風(fēng)險，在向下一代傳遞時CGG重復(fù)順序并不擴增，因此男性前突變攜帶者一般不會增加胎兒患病風(fēng)險，但若生育女兒，為前突變攜帶者[24-25]。本研究與西方人群[18]篩查結(jié)果相比，篩查出的疾病種類和攜帶率有顯著差異，這表明西方國家推薦篩查的部分疾病種類可能不適用于其他人群。綜上，本研究分析結(jié)果與以往的報道有所不同的可能原因是與所研究人群的地域不同、種族不同、樣本量不同、篩查的疾病種類不同以及測序平臺的差異有關(guān)。因此針對不同地區(qū)和種族，需要制訂合適的人群攜帶者篩查模式與實施方案。

表4 國內(nèi)外人群攜帶率比較Tab.4 Comparison of carrying rate between the Chinese and foreign population

本研究發(fā)現(xiàn)140對夫婦中5對（3.57%）為高危夫婦，其中4對（80%）夫婦為同一常染色體致病基因攜帶者和1例（20%）女性為線粒體耳聾疾病攜帶者。所有這些高危夫婦都需進行遺傳咨詢，檢測結(jié)果有利于臨床醫(yī)生對受檢者進行生育指導(dǎo)，有效避免和減少單基因遺傳病患兒的出生。

本研究的優(yōu)勢在于其檢測成本顯著低于二代測序，且報告結(jié)果易于臨床醫(yī)生進行解讀，減輕遺傳咨詢負擔(dān)和患者的焦慮，并可以對一些特殊基因變異進行檢測，如假基因、倒位和CGG重復(fù)突變等，有利于在臨床上開展實施ECS，有效預(yù)防常見單基因病患兒的發(fā)生。其次，中國人群中許多罕見疾病的發(fā)病率和疾病基因的突變譜仍不確定[26]，某些罕見的遺傳病篩查可能會給臨床醫(yī)生評估殘余風(fēng)險帶來挑戰(zhàn)，因此，在中國，包含數(shù)十種遺傳病的篩查體系更適用于攜帶者篩查[27]，本研究為ECS提供了一種經(jīng)濟有效的方案。最后本研究還報告了中國人群中幾種常見疾病的攜帶率，為構(gòu)建屬于中國人群的基因變異數(shù)據(jù)庫積累相關(guān)數(shù)據(jù)。而本研究還有一些值得注意的局限性。首先，本研究的樣本量相對較小，研究人群所處地域相對集中，還需進一步擴大研究。第二，我們目前在研究人群中觀察到了15種遺傳病中的8種疾病，可能與樣本量較小和所篩查的疾病種類有關(guān)，未來將納入更多的受檢者，并根據(jù)研究結(jié)果進一步優(yōu)化篩查體系中包括的基因和致病變異種類。第三，本研究納入的是有限的明確致病位點，無法識別檢測范圍外的致病變異和新發(fā)變異，這可能增加殘余風(fēng)險，需要在檢測前和檢測后的咨詢中予以強調(diào)，告知受檢者本研究的益處、局限性和潛在風(fēng)險。