周先桃 李瑜 沈陽(yáng) 王正華

1武漢血液中心（武漢 430030）；2湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（武漢 430015）

在炎癥應(yīng)激、傷口愈合、膿毒癥等疾病的進(jìn)展中，患者極易出現(xiàn)“血小板減少癥”[1]。研究[2]顯示血小板凋亡是導(dǎo)致“血小板減少癥”中的關(guān)鍵事件。研究[3]顯示血小板的核糖體能合成B淋巴細(xì)胞瘤?xl（B cell lymphoma?xl，Bcl?xl）、Bcl?2同源拮抗劑/殺傷劑蛋白（Bcl?2 homologous antagonist/killer，Bak）等凋亡相關(guān)蛋白。YADAV等[4]研究顯示血小板的線粒體的形態(tài)與“血小板減少癥”病癥的進(jìn)展關(guān)系密切。血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是血小板生成重要的調(diào)控因子。隨著生化技術(shù)的進(jìn)步，重組人血小板生成素（recombinant human TPO，rhTPO）的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)之一。有研究[5]顯示皮下注射rhTPO對(duì)腦腫瘤患兒化療所致血小板減少癥的預(yù)防效果較好，且不良反應(yīng)發(fā)生率低，但是有關(guān)rhTPO在血小板凋亡中的作用報(bào)道較少。凝血酶（thrombin，TMB）是一種血小板激動(dòng)劑，ROKA?MOIIA 等[6]研究報(bào)道 TMB 能明顯抑制血小板中細(xì)胞色素 C（cytochrome c，Cyt?c）的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，誘導(dǎo)其凋亡。本研究旨在探討rhTPO對(duì)TMB誘導(dǎo)血小板凋亡的作用機(jī)制，以為藥物的推廣應(yīng)用提供可靠的事實(shí)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料分別收集10例健康成年男性的空腹靜脈血10 mL，血型均為O型，年齡（20.35±6.66）歲。本研究已獲取研究對(duì)象的知情同意書(shū)，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（編號(hào)：2021?1207?QV03）。

1.2 試劑與儀器TMB購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，2′，7′?二氯熒光素二乙酸酯（2，7?dichlorodihydro?fluoresceindiacetate，DCDHF?DA）染色試劑盒購(gòu)自美國(guó) Sigma?Aldrich 公司，兔抗大鼠分裂蛋白1（mi?tochondrial fission 1 protein，F(xiàn)is?1）、融合蛋白 2（mi?tofusin2，Mfn 2）、動(dòng)力相關(guān)蛋白 1（dynamin?related protein 1，Drp?1）、視神經(jīng)萎縮蛋白 1（optic atrophy 1，Opa 1）、Cyt?c、Bcl?xl、Bak 抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam公司。

定量反轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction，qRT?PCR）擴(kuò)增儀、BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Bio?Rad公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 血小板的制備參照SHPAKOVA等[7]介紹的方法將獲取的空腹靜脈血與檸檬酸葡萄糖緩沖液以7∶1稀釋比例混合，加入適量抗凝劑，300 μg離心15 min，留取上層，即為富含血小板的血漿，再以1 500×g離心5 min，棄掉上清，以預(yù)制緩沖液將細(xì)胞沉淀重懸，再次以1 500×g離心5 min，棄掉上清，以改良的臺(tái)式緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，獲得血小板懸液，加入適量的氯化鈣和氯化鎂，室溫下避光靜置1 h后，即洗滌血小板制備成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組[8]將制備的洗滌血小板懸液分組如下：Normal組：在1 mL的洗滌血小板中加1 μL生理鹽水孵育30 min后添加5 μL生理鹽水刺激；TMB組：在1 mL的洗滌血小板中加1 μL生理鹽水孵育30 min后添加5 μL的200 U/mL TMB刺激；rhTPO低、中、高劑量組（TMB+10/50/100 ng/mL rhT?PO）組：在1 mL的洗滌血小板中加1 μL的rhTPO（濃度為10/50/100 ng/mL）孵育30 min后添加5 μL的200 U/mLTMB刺激。

1.5 血小板中線粒體的形態(tài)洗滌血小板的分組處理同1.4，在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后，按線粒體紅色熒光探針（MitoTracker Red CMXRos）染色試劑盒要求進(jìn)行染色，室溫下避光孵育30 min，中性甲醛固定，激光共聚焦顯微鏡觀察各組血小板中線粒體形態(tài)的改變，Image J圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞內(nèi)線粒體的完整性[9]。

1.6 血小板的細(xì)胞的凋亡率實(shí)驗(yàn)分組同1.4，無(wú)菌操作臺(tái)上，加入200 μL的緩沖液，重懸后，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V?異硫氰酸熒光素（Annexin V?FITC），室溫下避光孵育15 min，加入10 μL/碘化丙啶（PI），BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[10]。

1.7 血小板中ROS的水平洗滌血小板的分組處理同1.4，在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后，添加適量DCDHF?DA染色液，37℃恒溫水浴鍋中避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察，Image J圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)分析視野中的綠色熒光強(qiáng)度均值[11]。

1.8 血小板中相關(guān)基因的表達(dá)洗滌血小板的分組處理同1.4，在各組血小板接受TMB或生理鹽水刺激2 h后，按Trizol reagent試劑盒要求提取血小板中的總RNA，其完整性和濃度經(jīng)Q1AGEN RNeasy Mini Kit確定后，在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)下合成cDNA，CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以β?肌動(dòng)蛋白（β?actin）為參照物，目的基因的相對(duì)表達(dá)以 2?ΔΔCt進(jìn)行表示[12]。各基因的序列見(jiàn)表1。

表1 各基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

1.9 血小板中Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的表達(dá)常規(guī)提取樣本中的總蛋白，以50 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗，孵育，加入二抗，化學(xué)發(fā)光后，顯影，掃描，統(tǒng)計(jì)分析各條帶的灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用（）進(jìn)行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板中線粒體分裂程度與Normal組相比，TMD組、rhTPO（低、中、高）組中血小板中完整線粒體的比例明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=76.374，P＜0.05），與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組中血小板中完整線粒體的比例明顯升高，并且具有明顯的劑量依賴(lài)性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.129，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 血小板中的線粒體分裂程度（MitoTracker Red CMXRos染色，×400）Fig.1 The comparison of the degree of mitochondrial fission in platelets（MitoTracker Red CMXRos staining，× 400）

2.2 血小板的細(xì)胞的凋亡率與Normal組相比，TMD組、rhTPO（低、中、高）組血小板中的細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.435，P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中的細(xì)胞凋亡率明顯降低，并且具有明顯的劑量依賴(lài)性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.371，P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 血小板中的細(xì)胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate in platelets

2.3 血小板中ROS的水平與Normal組相比，TMD組、rhTPO（低、中、高）組血小板中ROS熒光強(qiáng)度明顯升高，ROS的水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.028，P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中ROS熒光強(qiáng)度明顯降低，ROS的水平明顯下降，并且具有明顯的劑量依賴(lài)性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.664，P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 血小板中ROS的水平（DCDHF?DA染色，×400）Fig.3 The comparison of the levels of ROS in platelets（DCDHF?DA staining，× 400）

2.4 qRT?PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)與Normal組相比，TMD、rhTPO（低、中、高）組血小板中Opa1（F=10.124）、Bcl?xl（F=9.648）、Mfn2（F=9.771）的mRNA的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)is?1（F=11.617）、Drp?1（F=9.258）、Cyt?c（F=10.035）和 Bak（F=9.884）的mRNA的表達(dá)明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中 Opa1（F=7.229）、Bcl?xl（F=6.943）、Mfn2（F=6.872）的mRNA的表達(dá)明顯升高，F(xiàn)is?1（F=7.336）、Drp?1（F=6.058）、Cyt?c（F=6.948）和Bak（F=6.325）的mRNA的表達(dá)明顯降低，并且具有明顯的劑量依賴(lài)性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1 、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的mRNA的表達(dá)Fig.4 The mRNA expression of Fis?1，Mfn 2，Drp?1，Opa 1，Cyt?c，Bcl?xl and Bak in platelets

2.5 洗滌血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和 Bak 的表達(dá)與 Normal組相比，TMD、rhTPO（低、中、高）組血小板中 Opa1（F=11.032）、Bcl?xl（F=10.255）、Mfn2（F=10.682）的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)is?1（F=11.967）、Drp?1（F=9.875）、Cyt?c（F=10.524）和 Bak（F=10.147）的表達(dá)明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TMD組相比，rhTPO（低、中、高）組血小板中Opa1（F=8.246）、Bcl?xl（F=7.559）、Mfn2（F=7.127）的表達(dá)明顯升高，F(xiàn)is?1（F=8.539）、Drp?1（F=7.691）、Cyt?c（F=7.484）和 Bak（F=6.724）的表達(dá)明顯降低，并且具有明顯的劑量依賴(lài)性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 血小板中 Fis?1、Mfn 2、Drp?1、Opa 1、Cyt?c、Bcl?xl和Bak的表達(dá)Fig.5 The expression of Fis?1，Mfn 2，Drp?1，Opa 1，Cyt?c，Bcl?xl and Bak in platelets

3 討論

臨床上將rhTPO用于實(shí)體腫瘤放化療誘導(dǎo)的血小板減少癥以及過(guò)敏性紫癜引起的血小板減少的輔助治療中[11]，取得了較為滿意的療效，但是rhTPO如何調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，抑制血小板的凋亡，尚未有定論[12]。因此深入揭示血小板凋亡的分子機(jī)制，對(duì)于血小板生成類(lèi)藥物的開(kāi)發(fā)、推廣都具有重大意義。

輸注血小板是治療重度血小板減少癥的常用方法，療效明顯，但維持時(shí)間短，且易出現(xiàn)過(guò)敏、高熱、感染等副反應(yīng)，而TPO是特異性的調(diào)控血小板生成的因子，可直接增加血小板的分泌量[13]。但因其儲(chǔ)存、來(lái)源等限制了其臨床應(yīng)用，而基于基因重組技術(shù)誕生的rhTPO，能更好的彌補(bǔ)TPO的不足，在各種原因引起的血小板減少癥中發(fā)揮作用[14]。MEI等[15]研究顯示將rhTPO用于治療成年免疫性血小板減少癥時(shí)，療效顯著，不良反應(yīng)較少。YAO等[16]研究顯示rhTPO能明顯安全、有效的促進(jìn)造血干細(xì)胞移植患者術(shù)后的血小板恢復(fù)，不良反應(yīng)低。本研究結(jié)果顯示rhTPO能明顯抑制TMD誘導(dǎo)的血小板凋亡，并且具有良好的劑量依賴(lài)性。

線粒體是血小板的“動(dòng)力源”，消除ROS的重要武器[17]。研究顯示[18-19]細(xì)胞內(nèi)的線粒體處于動(dòng)態(tài)的平衡中，Drp?1、Fis?1以及 Mfn2、Opa1 基因分別是線粒體膜裂解與融合的關(guān)鍵調(diào)控因子。XU等[20]研究顯示在血小板減少癥患者中的血清中，血小板的線粒體呈現(xiàn)碎片化狀態(tài)，凋亡率明顯升高。XIANG等[21]研究顯示及時(shí)清除ROS后，能明顯維系血小板線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，抑制其細(xì)胞凋亡。在病理狀態(tài)中，凋亡信號(hào)被炎癥等激活，Bak的轉(zhuǎn)錄與翻譯驟增，Bcl?xl的活性受限，誘導(dǎo)血小板的細(xì)胞凋亡[22]。MIAO等[23]研究報(bào)道對(duì)免疫性血小板減少癥進(jìn)行抗Bak治療，能明顯升高Bcl?xl的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示經(jīng)rhTPO干預(yù)后Opa1、Bcl?xl、Mfn2、Fis?1、Drp?1、Cyt?c和 Bak 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)對(duì)rhTPO具有明顯的劑量依賴(lài)性。

綜合上述，rhTPO能明顯抑制TMD誘導(dǎo)的血小板的細(xì)胞凋亡，這可能與抑制ROS的富集，改善線粒體的形態(tài)有關(guān)，但如何更為有效的將rhTPO用于臨床相關(guān)疾病的治療，仍需考慮患者體質(zhì)的特異性。