王歡嵐，劉 紅，張燕敏，陳偉棟

武漢市第一醫(yī)院（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）腎內(nèi)科，湖北 武漢 430022

糖尿病腎?。―N）主要是由糖尿病所致慢性腎病，臨床表現(xiàn)為蛋白尿、高血壓以及水腫等癥狀［1］。DN的發(fā)病機制較為復(fù)雜，普遍認為是因高糖環(huán)境引起機體糖代謝紊亂、腎臟的血流動力學(xué)發(fā)生改變和氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)過度活化，導(dǎo)致系膜細胞增大肥厚、細胞外基質(zhì)聚集、腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，降低腎功能［2,3］。足細胞即為腎小球上皮細胞，其微結(jié)構(gòu)改變在DN蛋白尿產(chǎn)生過程匯中發(fā)揮重要作用［4］。微小RNAs（miRNAs）是具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平的內(nèi)源性非編碼單鏈的小分子RNA，可參與細胞增殖、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生以及病毒感染等病理過程［5］。研究表明miRNAs也參與DN發(fā)病過程［6,7］。有研究通過基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在早期DN中miR-34a的表達顯著降低［8］，但其對DN所致足細胞損傷的相關(guān)研究尚未有相關(guān)報道。Notch信號通路是高度保守的信號通路，參與細胞、組織、器官的發(fā)育和分化過程，同時也參與多種病理生理過程［9-11］。有研究證實，輻射照射后大鼠腎組織中miR-34a 能夠靶向Notch配體表達降低［12］，提示miR-34a能夠靶向Notch調(diào)控腎組織的內(nèi)皮細胞變化。本研究主要探究miR-34a對DN足細胞損傷和凋亡的影響，以期為DN藥物研發(fā)提供參考意見。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

MPC5小鼠足細胞系（ATCC），SPF級雄性8周齡C57BL/6J小鼠。動物實驗遵循3R原則，通過實驗動物的福利倫理審查。

1.2 主要試劑

甘露醇（上海源葉生物科技有限公司），miR-34a mimic及其陰性對照、pcDNA3.1質(zhì)粒載體和pc-Notch 1過表達質(zhì)粒載體、agomir-34a和agomir-NC、miR-34a結(jié)合位點缺失突變型（Notch 1-mut）及其野生型（Notch 1-wt）的3'UTR的熒光素酶的報告載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），Lipofectamine?2000（Invitrogen），熒光素酶試劑盒（中國臺灣亞諾法生技股份有限公司），RNA純化提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國天根生化科技北京有限公司），RT-PCR試劑盒（中國北京莊盟國際生物基因科技有限公司），CCK-8（北京百奧萊博科技有限公司），兔抗鼠caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2抗體（上海康朗生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

Vilber Fusion Fx7 凝膠成像儀（Vilber Lourmat），LightCycler?96實時定量PCR儀（中國羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司），Aurora 3L-5L 流式細胞儀（Cytek Biosciences），SpectraMax iD3 酶標(biāo)儀（Molecular Devices），DFM-60D熒光顯微鏡（中國上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）。

1.4 體外實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng)和高糖誘導(dǎo) 使用含有10%胎牛血清、50 U/L γ干擾素的RPMI 1640培養(yǎng)基將MPC5小鼠足細胞置于I 型鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細胞融合至90%左右，進行消化傳代，然后用不含γ干擾素的完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化14 d，用于后續(xù)實驗。將成熟的足細胞在無血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，分為正常糖組、高糖組和高滲透組，正常糖組給予5.3 mmol/L葡萄糖、高糖組給予30 mmol/L葡萄糖、高滲透組給予5.3 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇刺激48 h，然后收集細胞，使用RT-PCR法檢測細胞中miR-34a表達水平。

1.4.2 RT-PCR檢測 提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄生成第一條鏈cDNA，然后使用RT-PCR法檢測miR-34a表達水平，以U6作為內(nèi)參基因，計算方法使用2-△△Ct。

1.4.3 細胞轉(zhuǎn)染 成熟的足細胞在無血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞融合度為70%～90%時，參照Lipofectamine?2000 說明書將miR-34a mimic 及其陰性對照轉(zhuǎn)染足細胞，分別記為miR-34a組、miR-NC組，孵育6 h后，更換為含有血清培養(yǎng)基，48 h后，收集細胞，在聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，RT-PCR驗證細胞miR-34a表達水平，明確成功轉(zhuǎn)染后，將pc-Notch 1過表達質(zhì)粒載體及其空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染miR-34a組和miR-NC組足細胞，分別記為miR-34a+Notch 1組、Notch 1組。

1.4.4 熒光素酶實驗 采用熒光素酶報告載體來驗證miR-34a和Notch 1的關(guān)系。軟件預(yù)測在Notch 1 3'-UTR的190～196 是與miR-34a 結(jié)合的位點，并合成該位點的DNA片段（Notch 1 wt）以及含該位點突變體（Notch 1 mut）DNA片段，退火后克隆到雙熒光素酶啟動子載體pGL3，將miR-34a mimic共轉(zhuǎn)染至足細胞，孵育48 h，依據(jù)試劑盒說明書操作比較各組細胞熒光素酶活力值。

1.4.5 CCK-8法檢足細胞增殖情況 將轉(zhuǎn)染成功的足細胞以1×105/孔接種至24孔板，均給予高糖（30 mmol/L葡萄糖）刺激，同1.4.1，分別與培養(yǎng)1、2、3、4、5 d時，加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，在波長450 nm處檢測光密度A450nm。每組設(shè)置6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4.6 流式細胞法檢測足細胞凋亡情況 收集高糖刺激48 h足細胞，1000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，加入1×Binding Buffer 300 μL 重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混合均勻，室溫避光孵育15 min，上樣流式細胞儀，檢測細胞凋亡率。

1.4.7 Western blot法檢測蛋白表達水平 提取高糖刺激48 h足細胞總蛋白，Bradford蛋白定量，SDS-PAGE分離，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉密封2 h，加入兔抗鼠caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入HRP標(biāo)記二抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗，顯色、定影，使用成像儀子代系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

1.5 體內(nèi)實驗

1.5.1 糖尿病腎病模型制備 將35只C57BL/6J小鼠參考文獻［13］中高脂飲食+鏈脲佐菌素（一次性腹腔注射100 mg/kg）DN模型制備方法進行2型DN造模，另選15只C57BL/6J小鼠給予正常飲食和腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液，35只小鼠造模不成功5只。動物實驗遵循3R原則。

1.5.2 動物分組和干預(yù) 將制模成功的DN小鼠隨機均分為模型組、miR-34a組，15只/組。miR-34a組和模型組小鼠分別尾靜脈注射agomir-34a（80 mg/kg-1·d-1）［14］、agomir-NC（80 mg/kg-1·d-1），連續(xù)注射3 d。4周后，麻醉處死小鼠，快速取出腎組織，一部分腎組織固定于甲醛中性溶液，余下腎組織于-20 ℃保存?zhèn)溆?，使用RT-PCR檢測各組小鼠腎組織miR-34a表達水平。

1.5.3 腎組織HE染色和TUNEL凋亡檢測 將已固定腎組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片，所得切片用于HE染色觀察腎組織病理結(jié)果變化和TUNEL檢測腎組織凋亡情況，詳細操作見文獻［15］。

1.5.4 腎組織凋亡、Notch信號通路相關(guān)蛋白表達水平檢測 提取腎組織中總蛋白水平，參照1.4.7中操作方法檢測腎組織中caspase-3、caspase-9、Notch 1蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，滿足正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，兩組比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境對足細胞miR-34a表達水平的影響

在高糖環(huán)境誘導(dǎo)下足細胞中miR-34a表達水平低于正常糖誘導(dǎo)下足細胞和高滲透壓下作用下的足細胞（P＜0.05，圖1）。

圖1 miR-34a表達水平Fig.1 Expression level of miR-34a in the podocytes with different treatments.*P＜0.05 vs normal glucose group.

2.2 轉(zhuǎn)染足細胞系驗證及miR-34a與Notch1靶向關(guān)系驗證

miR-34a細胞轉(zhuǎn)染效率為86.75%，Notch 1細胞轉(zhuǎn)染率效為81.69%，miR-34a組足細胞中的miR-34a表達水平高于miR-NC組（P＜0.05），雙色熒光素酶實驗結(jié)果顯示Notch 1 wt/miR-34a 組熒光素酶活力值低于Notch 1 wt組（P＜0.05），而Notch 1 mut/miR-34a組熒光素酶活力值和Notch 1 mut/miR-NC組差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。miR-34a組足細胞中Notch 1表達水平低于miR-NC組（P＜0.05）；Notch 1組足細胞中Notch 1表達水平高于其空質(zhì)粒組（P＜0.05，圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染足細胞系驗證及miR-34a與Notch 1靶向關(guān)系驗證Fig.2 Verification of mRNA-target relationship between miR-34a and Notch 1 in transfected podocytes.A:Expression level of miR-34a in transfected podocytes (*P＜0.05 vs miR-NC group).B: Luciferase activity in the podocytes (*P＜0.05 vs Notch 1 wt group).C:Expression level of Notch 1 in the transfected podocytes(*P＜0.05).

2.3 各組足細胞在高糖情況下存活情況比較

高糖組足細胞的A 值與miR-NC 組差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05），miR-34a組足細胞的A值高于miR-NC組（P＜0.05），Notch 1組足細胞的A值低于miR-NC組（P＜0.05），miR-34a+Notch 1 組足細胞的A 值低于miR-34a組（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組足細胞在高糖情況下細胞存活曲線Fig.3 Survival curves of the podocytes with different treatments.*P＜0.05 vs miR-NC group;#P＜0.05 vs miR-34a group.

2.4 各組足細胞凋亡情況比較

高糖組足細胞細胞凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平與miR-NC 組差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05），miR-34a 組足細胞凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平均低于miR-NC 組（P＜0.05），Notch 1組足細胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平均高于miR-NC 組（P＜0.05），miR-34a+Notch 1 組足細胞凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白水平均高于miR-34a 組（P＜0.05，圖4、5）。

圖4 各組足細胞流式凋亡結(jié)果Fig.4 Flow cytometry of podocyte apoptosis in each group.

圖5 各組足細胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白水平Fig.5 Podocyte apoptosis and expressions of apoptosis-related proteins in each group.A and C:Levels of Caspase-3,Caspase-9 and Bax/Bcl-2 proteins(1:High glucose group;2:miR-NC group;3:miR-34a group;4:Notch 1 group;5:miR-34a+Notch 1 group);B:Apoptosis rate of podocytes.*P＜0.05 vs miR-NC group;#P＜0.05 vs miR-34a group.

2.5 各組小鼠腎組織病理情況和腎組織miR-34a表達比較

對照組小鼠腎組織細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，模型組小鼠腎組織細胞結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出腎小球腫脹、體積增大以及部分伴有纖維化，miR-34a組小鼠的腎組織損傷程度降低（圖6）。模型組小鼠腎組織miR-34a表達水平低于對照組（P＜0.05），miR-34a組小鼠的腎組織miR-34a表達水平高于對照組（P＜0.05，圖7）。

圖6 各組小鼠腎組織HE染色Fig.6 HE staining of renal tissues in each group(Original magnification:×200).

圖7 各組小鼠腎組織miR-34a表達Fig.7 Expression of miR-34a in the renal tissues in each group.*P＜0.05 vs control group.

2.6 各組小鼠腎組織凋亡情況

模型組小鼠腎組織凋亡指數(shù)和caspase-3、caspase-9、Notch 1 蛋白水平高于對照組（P＜0.05），miR-34a組小鼠腎組織凋亡指數(shù)和caspase-3、caspase-9、Notch 1蛋白水平低于模型組（P＜0.05，圖8、9）。

圖8 各組小鼠腎組織TUNEL染色Fig.8 TUNELstaining of renal tissues in each group(×400).

圖9 各組小鼠腎組織凋亡相關(guān)蛋白水平Fig.9 Apoptosis index and expressions of apoptosis-related proteins in the renal tissues in each group.A and C:Expressions of caspase-3,caspase-9 and Notch 1 proteins detected by Western blotting(1:Control group;2:model group;3:miR-34a group);B:Apoptosis index of renal tissues.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group.

3 討論

DN是臨床糖尿病患者常見的遠期微血管并發(fā)癥之一，隨著病情惡化，可進展為腎功能衰竭，因此也是糖尿病患者致死因素之一［16,17］。DN早期發(fā)病具有隱匿特點，導(dǎo)致大部分DN確診者的腎功損傷程度較大，目前主要采取早發(fā)現(xiàn)、早治療的方式以延緩糖尿病患者腎功能降低進程［18］。目前尚無治療DN的特效藥，積極探索DN發(fā)病機制對控制DN病情進展具有重要意義。DN患者臨床常見癥狀為蛋白尿，足細胞有助于維持腎小球濾過屏障的完整性，預(yù)防蛋白尿發(fā)生［19］。因此，足細胞損傷可能會影響DN發(fā)生以及患者預(yù)后。

miRNAs具有高度保守性、特異性，參與多種正常生理、病理生理過程［20,21］，本研究結(jié)果顯示高糖條件誘導(dǎo)下小鼠足細miR-34a表達水平降低，有研究表明高糖刺激能夠促使足細胞miR-34a表達下調(diào)，誘導(dǎo)足細胞損傷［22］。本研究結(jié)果與其趨勢相似，說明高糖環(huán)境確實可以誘導(dǎo)產(chǎn)生足細胞損傷，并且miR-34a也參與足細胞損傷過程。已有研究表明miR-145-5p也參與高糖誘導(dǎo)足細胞損傷過程，其作用機制可能是靶向作用于Notch信號通路減輕高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡［23］。本研究結(jié)果顯示miR-34a組足細胞中Notch 1表達水平呈降低趨勢，此結(jié)果與上述前人研究結(jié)果相似，說明miR-34a對高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷可能與Notch信號通路有關(guān)。

本研究通過熒光素酶實驗明確miR-34a與Notch 1存在靶向關(guān)系，Notch信號通路參與腎臟導(dǎo)管上皮細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，Notch 1是Notch信號通路的主要受體之一，該信號通路中的受體及其相應(yīng)配體結(jié)合后，能夠使Notch 1的構(gòu)象發(fā)生改變并釋放Notch胞內(nèi)域，從而激活下游基因，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等過程［24,25］。研究表明Notch信號通路在DN中呈明顯活化狀態(tài)，能夠?qū)ρ苌?、胰腺?nèi)分泌、外分泌細胞發(fā)生等產(chǎn)生影響，發(fā)揮介導(dǎo)足細胞損傷、凋亡等作用，還可促進腎小管間質(zhì)損傷、纖維化，加重DN進展［26,27］。本研究結(jié)果顯示miR-34a表達水平升高可以提高足細胞存活情況并降低足細胞的凋亡率和caspase-3、caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白水平，而在miR-34a過表達水平基礎(chǔ)上過表達Notch 1可以緩解上述指標(biāo)的趨勢，但是單純Notch 1表達水平升高的足細胞的上述指標(biāo)趨勢呈完全相反狀態(tài)，說明miR-34a過表達可以降低高糖誘導(dǎo)足細胞損傷和凋亡，可能與直接靶向作用Notch 1有關(guān)，而有研究證實，MicroRNA-34a通過負靶向脊髓損傷中的Notch通路來抑制神經(jīng)元凋亡并減輕小膠質(zhì)細胞炎癥［28］，與本研究結(jié)果一致。本研究通過建立動物DN實驗發(fā)現(xiàn)DN小鼠腎組織存在腎小球腫脹、體積增大以及部分伴有纖維化現(xiàn)象，腎組織miR-34a表達水平降低，并且腎組織凋亡指數(shù)和促凋亡蛋白、Notch 1表達水平較正常小鼠升高，而給予miR-34a干預(yù)可以部分逆轉(zhuǎn)DN小鼠的腎組織損傷和凋亡情況，還能抑制腎組織Notch 1蛋白水平，說明miR-34a表達水平升高可以通過介導(dǎo)Notch信號通路緩解DN足細胞損傷和凋亡情況。研究證實糖尿病腎病小鼠足細胞損傷與Numb依賴性Notch 1通路激活有關(guān)［29］，提示miR-34a可能作為減輕DN足細胞損傷的靶向位點。

綜上所述，miR-34a表達升高可以改善DN足細胞損傷和凋亡情況，可能與直接靶向抑制Notch 1表達進而抑制Notch信號通路激活有關(guān)。