王莎莎，呂 恒，王麗婭，田美惠，高 潔，劉忠義，王佳慧，于 影

蚌埠醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室，2心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233000

膿毒癥相關(guān)性腦病（SAE），是膿毒癥常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其相關(guān)重要機(jī)制極為復(fù)雜，包括內(nèi)皮屏障受損、線粒體的功能障礙、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活以及鞘磷脂代謝紊亂或異常等［1］。血腦屏障（BBB）［2］是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵屏障系統(tǒng)，由周細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）、星形細(xì)胞末端足、基底板細(xì)胞、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞組成。其中BMECs通過緊密連接蛋白構(gòu)成內(nèi)皮細(xì)胞屏障，對維持BBB的完整性尤為重要［3］。緊密連接蛋白主要由跨膜蛋白，如閉鎖帶狀蛋白ZO、咬合蛋白Occludin、閉合蛋白Claudin以及連接黏附分子JAM等組成［4］。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖（LPS）誘導(dǎo)SAE產(chǎn)生活性氧ROS［5］，引起細(xì)胞間緊密連接被破壞，ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)下降，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，造成神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙［6］。

乙醛脫氫酶2（ALDH2）是位于線粒體基質(zhì)內(nèi)重要的醛類氧化酶，催化乙醛氧化為乙酸。值得注意的是，敲除ALDH2小鼠因腦內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）降低，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，引起內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin丟失，內(nèi)皮屏障通透性增加［7］；而在高氧誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用ALDH2激動劑Alda-1干預(yù)，可通過抑制氧化應(yīng)激的增加，恢復(fù)線粒體膜電位并改善線粒體功能［8］。

線粒體在生理狀態(tài)下，處于不斷地融合、分裂動態(tài)平衡中［9］。線粒體的融合蛋白家族成員包含視神經(jīng)萎縮蛋白OPA1、線粒體融合蛋白Mfn2；線粒體的分裂蛋白包括動力相關(guān)蛋白Drp1、線粒體分裂蛋白Fis1等。已有研究表明，線粒體融合和分裂參與了多種細(xì)胞活動，如氧化應(yīng)激［10-12］、細(xì)胞凋亡［13-15］、吞噬有絲分裂［15-17］等。抑制Drp1可以逆轉(zhuǎn)線粒體形態(tài)變化，降低ROS水平，明顯改善了BBB破壞和腦水腫［18］。而Mfn2通過抑制炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞間連接，維持內(nèi)皮屏障的完整性［19］，這表明線粒體融合和分裂與內(nèi)皮細(xì)胞屏障存在一定聯(lián)系。在心肌細(xì)胞中研究顯示［20］，ALDH2可以通過調(diào)控線粒體分裂蛋白Drp1，抑制線粒體分裂發(fā)揮保護(hù)作用。采用線粒體分裂蛋白抑制劑可減弱LPS誘導(dǎo)的膿毒癥時，肺臟［21］、腦組織［22］氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，改善線粒體的功能。然而，有關(guān)ALDH2改善LPS導(dǎo)致的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，相關(guān)報道較少。特別是ALDH2能否通過調(diào)控線粒體融合和分裂，抑制氧化應(yīng)激的增加，進(jìn)而減輕內(nèi)皮細(xì)胞通透性？具體機(jī)制還不清楚。故本實(shí)驗(yàn)通過給予ALDH2 激動劑Alda-1，觀察ALDH2 對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，并探討線粒體融合和分裂在內(nèi)皮屏障中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Procell）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Hyclone）；LPS（Sigma）；Alda-1（MCE）；Dihydroethidium 和DAPI（碧云天）；CCK8 檢測細(xì)胞增殖毒性試劑（Biosharp）；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）氧化應(yīng)激檢測試劑盒（南京建成）；FITC-Dextran（Sigma）；DHE超氧化物陰離子熒光探針（碧云天）；ALDH2單克隆抗體、ZO-1多克隆抗體、Occludin單克隆抗體、OPA1多克隆抗體和Drp1多克隆抗體（Abcam）；Mfn2多克隆抗體和Fis1單克隆抗體（武漢三鷹）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Biosharp）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞加入濃度為25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基，其中包括10%的胎牛血清和雙抗（即青霉素和鏈霉素），在實(shí)驗(yàn)操作過程中，按照約以3×104/cm2的密度，接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，最后放置于溫度為37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞的密度長至約80%～90%左右時，將細(xì)胞進(jìn)行傳代（1傳2），進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為3組，即（1）對照組：將腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基；（2）LPS損傷組（LPS）：LPS加入在DMEM完全培養(yǎng)基中，24 h后處理細(xì)胞；（3）LPS+ALDH2激動劑Alda-1組（LPS+Alda-1）：Alda-1藥物預(yù)先處理1 h，隨之將藥物L(fēng)PS加入DMEM完全培養(yǎng)基中干預(yù)24 h。

1.2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞活性 將bEnd.3 細(xì)胞密度以6000/孔，接種于96 孔板，分別加入LPS（0.1、0.5、1、5 μg/mL）和Alda-1（10、20、40、80、100 μmol/mL）藥物處理24 h后，每個孔加入含有110 μL 的CCK-8稀釋液，放置搖床上勻速混勻5 min，在培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，最后測定各組的A值（波長450 nm處）。

1.2.3 TEER電阻值的測定 每孔接種細(xì)胞2×105/mL，細(xì)胞貼壁生長48 h至單層融合后，利用ESR-電阻儀測量細(xì)胞TEER電阻值；在測量時，將電極插入小室中（上短下長），均取每孔細(xì)胞不同方向的3個點(diǎn)進(jìn)行檢測。TEER=（內(nèi)皮細(xì)胞電阻值-基礎(chǔ)電阻值）×Transwell上室濾膜的底面積。

1.2.4 FITC-Dextran細(xì)胞通透性檢測 將腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞按2×105/cm2接種于小室的濾膜上，待bEnd.3細(xì)胞待匯合成單層后，LPS和Alda-1藥物干預(yù)細(xì)胞24 h后，棄去小室中的培養(yǎng)基，下室加入無FITC 標(biāo)記的葡聚糖的無血清DMEM 600 μL，上室中加入無血清DMEM配制的0.5 mg/mL FITC-Dextran 100 μL，孵育1 h后，在暗室下分別吸取各組上室和下室的溶液，各100 μL/孔，用多功能酶標(biāo)儀檢測其熒光的A值（即激發(fā)的波長為485 nm、發(fā)射的波長為520 nm）。FITC-Dextran通透性的大小，用通透系數(shù)（Pa）表示，計算公式為：Pa=[A]/t×1/A×V/[L]，其中[A]表示下室的熒光值，t為FITC-Dextran的孵育時間（以秒計算為單位），A為FITC-Dextran濾過的面積（以cm2計算），V為下室無血清培養(yǎng)基體積，[L]代表上室熒光的A值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以Pa%表示，即Pa%=（檢測組Pa值/對照組Pa值）×100%。

1.2.5 SOD活性和MDA含量的測定 取藥物干預(yù)后的細(xì)胞上清液于新的1.5 mL于EP管中，接下來進(jìn)行離心（3000 r/min 10 min），取適量于新的EP管中，按照試劑盒的說明書操作步驟，檢測腦內(nèi)皮細(xì)胞MDA的含量和SOD活性。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光ROS測定 將細(xì)胞接種于6孔板，按以1×105/孔的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)，細(xì)胞生長至合適的密度后，LPS、Alda-1單獨(dú)或聯(lián)合藥物干預(yù)24 h后，棄去原有的培養(yǎng)基并用PBS清洗，隨后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞（30 min），清洗細(xì)胞3遍，5 min/遍；應(yīng)用DHE（超氧化物陰離子熒光探針）試劑按5 μmol/L 的濃度在37 ℃水浴鍋中孵育40 min，之后清洗細(xì)胞；接下來，DAPI染胞核5 min（5 μg/mL，37 ℃）左右并清洗細(xì)胞3遍，放置避光的盒子中，利用蔡司熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的表達(dá)變化，并及時拍照保存。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測各蛋白表達(dá) 細(xì)胞藥物干預(yù)24 h后，使用PBS清洗細(xì)胞，隨后加入提前配制好的裂解液和蛋白酶抑制劑（比例為100∶1）的混合液，上下左右搖晃培養(yǎng)皿，在冰上裂解5 min后，用手持型細(xì)胞刮刀刮取腦內(nèi)皮細(xì)胞，然后用1 mL量程的移液槍，收集細(xì)胞懸浮液至新的EP管中，振蕩離心，結(jié)束后吸取各組的蛋白上清液（200 μL EP管）。蛋白濃度檢測后，經(jīng)計算得出各組蛋白的上樣體積。取各組適量的蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，最后用牛奶封閉PVDF膜2 h。封閉結(jié)束后將條帶用TBST洗膜3遍，10 min/遍，隨后將PVDF膜分別與ALDH2（1∶2000）、ZO-1（1∶1000）、Occludin（1∶1000）、OPA1（1∶1500）、Mfn2（1∶8000）、Drp1（1∶1000）、Fis1（1∶3000）、GAPDH（1∶10 000）等一抗，4 ℃冰箱的搖床過夜；隔天上午用配制好的TBST洗膜3遍，10 min/遍，洗膜結(jié)束后，孵育蛋白二抗（1∶10 000），在室溫條件下，孵育1.5 h，最后洗膜并曝光。將顯影液與各條帶進(jìn)行充分的接觸，即在盒子中靜置1 min后，使用Tanon-5200 Multi 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，并用Image J軟件對目的和內(nèi)參條帶，進(jìn)行灰度值分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 將所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05時表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性變化

2.1.1 藥物濃度確定 CCK8結(jié)果顯示，LPS藥物干預(yù)24 h后，與Con組相比，隨著LPS藥物濃度的不斷增高，各藥物濃度的細(xì)胞活性逐漸下降（P＜0.001），其中LPS濃度為1 μg/mL時，細(xì)胞活性最低（P＜0.001），細(xì)胞損傷較強(qiáng)，故選取LPS藥物濃度為1 μg/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖1A）。加入Alda-1干預(yù)24 h后，與Con組相比，隨著Alda-1藥物濃度的不斷增高，細(xì)胞活性均明顯升高（P＜0.001）；結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，選取20 μmol/mL 的Alda-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1B）。

圖1 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞活性Fig.1 Viability of brain microvascular endothelial cells treated with different concentrations of LPS (A),Alda-1 (B) and both (C).Data are presented as Mean±SD(n=6).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs Con;##P＜0.01 vs LPS.

2.1.2 各組內(nèi)皮細(xì)胞活性的變化 CCK-8的結(jié)果顯示（圖1C），與對照組相比，LPS 組細(xì)胞活性下降（P＜0.001）。與LPS組相比，LPS+Alda-1組細(xì)胞活性增高（P＜0.01）。

2.2 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響

采用TEER法檢測細(xì)胞電阻值，結(jié)果如圖2A所示，與Con組相比，LPS組電阻值顯著降低（P＜0.05）；而使用ALDH2激動劑Alda-1預(yù)處理后，LPS+Alda-1組電阻值升高（P＜0.001）。進(jìn)一步采用FITC-Dextran法觀察熒光滲漏A值變化，結(jié)果如圖2B所示，與Con組相比，熒光滲漏A值明顯增高（P＜0.05）；而使用ALDH2激動劑Alda-1 預(yù)處理后，LPS+Alda-1 組熒光值降低（P＜0.001）。

圖2 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響Fig.2 Effects of ALDH2 on LPS-induced increase of permeability of brain microvascular endothelial cells.TEER (A) and FITC-dextran permeability (B) of the cells.Data are presented as Mean±SD(n=6).*P＜0.05 vs Con;###P＜0.001 vs LPS.

2.3 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

采用MDA和SOD試劑盒檢測氧化應(yīng)激變化，如圖3所示，與Con相比，LPS組MDA含量的表達(dá)明顯升高（P＜0.01），然而SOD 的活性表達(dá)降低（P＜0.001）；與LPS組相比，LPS+Alda-1組結(jié)果反之，即MDA含量的表達(dá)明顯下降（P＜0.001），而SOD活性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。

圖3 各組細(xì)胞MDA、SOD水平比較Fig.3 Comparison of MDA(A)and SOD(B)levels in the cells.Data are presented as Mean±SD(n=6).**P＜0.01,***P＜0.001 vs Con,##P＜0.01,###P＜0.001 vs LPS.

2.4 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的影響

免疫熒光結(jié)果如圖4A所示，與Con相比，LPS組胞漿ROS的平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（紅色，圖4B）（P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+Alda-1組胞漿ROS的平均熒光強(qiáng)度弱（紅色，圖4B）（P＜0.05）。

圖4 各組腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS免疫熒光染色Fig.4 Immunofluorescence staining of ROS in the cells.A:Immunofluorescence staining of ROS(red)and DAPI(blue).B:Quantitative analysis of ROS fluorescence intensity(Mean±SD,n=5).**P＜0.01 vs Con;#P＜0.05 vs LPS.

2.5 ALDH2 對LPS 誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中OPA1、Mfn2、Drp1和Fis1蛋白表達(dá)的影響

采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測線粒體融合蛋白和線粒體分裂蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果如圖5所示：與Con組相比，LPS 組OPA1 蛋白（P＜0.01）和Mfn2 蛋白（P＜0.001）表達(dá)明顯降低，Drp1（P＜0.001）和Fis1蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.01）；而與LPS組相比，LPS+Alda-1組OPA1蛋白（P＜0.05）和Mfn2蛋白（P＜0.001）表達(dá)升高，Drp1蛋白（P＜0.001）和Fis1蛋白（P＜0.05）表達(dá)降低。

圖5 各組bEnd.3腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞OPA1、Mfn2、Drp1和Fis1蛋白水平變化Fig.5 Expression of OPA1,Mfn2,Drp1 and Fis1 proteins in bEnd.3 cells in each group.Western blots of OPA1,Mfn2,Drp1,Fis1 and GAPDH(A).OPA1(B),Mfn2(C),Drp1(D),and Fis1 (E) protein levels are normalized by GAPDH levels (Mean±SD, n=5).**P＜0.01,***P＜0.001 vs Con;#P＜0.05,###P＜0.001 vs LPS.

2.6 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ALDH2和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測ALDH2、緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)的變化，結(jié)果如圖6所示：與Con組相比，LPS組ALDH2蛋白表達(dá)降低明顯（P＜0.001），與此同時，ZO-1蛋白（P＜0.001）和Occludin蛋白（P＜0.001）表達(dá)均降低顯著；使用ALDH2激動劑Alda-1預(yù)處理后，LPS+Alda-1組ALDH2（P＜0.01）、ZO-1（P＜0.01）和Occludin（P＜0.05）蛋白表達(dá)均明顯升高。

圖6 各組ALDH2、ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)情況Fig.6 Expression of ALDH2,ZO-1,and occludin protein in each group.A:Western blots of ZO-1,occludin and GAPDH.B-D:ALDH2(B),ZO-1 (C),Occludin(D)protein levels normalized by GAPDH levels(Mean±SD,n=5).***P＜0.001 vs Con,#P＜0.05,##P＜0.01 vs LPS.

3 討論

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是血腦屏障的基本結(jié)構(gòu)，是維持腦微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)態(tài)的第一道屏障［23］。而緊密連接破壞和內(nèi)皮損傷是LPS誘導(dǎo)血腦屏障破壞的主要機(jī)制［24,25］。當(dāng)ROS分泌和清除之間的平衡被打破時，ROS過度積累就會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增加［26］，進(jìn)而破壞內(nèi)皮屏障的完整性。本研究采用LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，結(jié)果顯示：與Con組相比，TEER電阻值降低而FITC-Dextran熒光滲漏值升高；氧化應(yīng)激因子MDA含量增高而SOD活性下降；ROS熒光強(qiáng)度表達(dá)增強(qiáng)；ZO-1和Occludin內(nèi)皮屏障緊密連接蛋白表達(dá)明顯降低，提示LPS可引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷顯著，促進(jìn)氧化應(yīng)激產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加。

線粒體是細(xì)胞的“動力工廠”，也是真核動物細(xì)胞生物氧化、能量轉(zhuǎn)換的主要場所。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)線粒體處于不斷地融合與分裂平衡中，對維持細(xì)胞功能起到重要作用［27,28］。已有研究表明線粒體融合和分裂是影響內(nèi)皮屏障的關(guān)鍵因素之一［22］。抑制線粒體融合或線粒體過度分裂會造成線粒體功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，破壞線粒體膜電位［29］，進(jìn)一步增加血管內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性，使血管內(nèi)皮屏障功能遭到損害［30］。過表達(dá)OPA1能夠促進(jìn)線粒體的融合，抑制氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，減弱內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度［31］。而體內(nèi)缺失線粒體融合蛋白Mfn2，會導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，影響內(nèi)皮屏障的完整性［19］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)的體外血腦屏障細(xì)胞模型中［22］，給予線粒體分裂蛋白Drp1抑制劑，可明顯降低線粒體ROS水平，改善線粒體的膜電位，降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞通透性；同時體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［22］也表明分裂蛋白Drp1抑制劑可以上調(diào)腦組織中ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)。隨后Haileselassie等［22］研究發(fā)現(xiàn)，抑制Drp1-Fis1相互作用，可以減輕LPS誘導(dǎo)的原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá)，進(jìn)而保持血腦屏障的完整性。與此結(jié)果相似的是，我們采用LPS刺激腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，線粒體融合蛋白OPA1、Mfn2表達(dá)下降，分裂蛋白Drp1、Fis1表達(dá)升高，緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)降低，說明LPS抑制線粒體融合、促進(jìn)線粒體分裂并且破壞內(nèi)皮屏障。

已有研究表明，ALDH2可以通過代謝4-羥基壬稀醛（4-HNE）和MDA等毒性醛類物質(zhì)，發(fā)揮間接抗氧化的作用，拮抗ROS生成，減輕乙醛及代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的損傷［32］。作為ALDH2的激動劑Alda-1，可通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白及粘附連接蛋白的表達(dá)，改善內(nèi)皮屏障損傷［33］。Alda-1通過抗氧化作用清除機(jī)體內(nèi)ROS，抑制脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞氧化還原平衡［34］。此外，線粒體ALDH2在防止4-HNE的積累、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和線粒體膜損傷等方面發(fā)揮著重要作用。激動ALDH2可以明顯抑制肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，改善線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能，在急性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用［8］。為進(jìn)一步分析ALDH2是否通過調(diào)控線粒體融合和分裂減輕LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮屏障損傷，本研究使用Alda-1進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示：與LPS組相比，LPS+Alda-1組TEER電阻值升高，F(xiàn)ITC-Dextran熒光滲漏值下降，MDA含量降低，SOD活性升高，ROS釋放減少，內(nèi)皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)增高，提示激動ALDH2可以減輕腦微血管內(nèi)皮屏障損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。同時，我們通過Western blot實(shí)驗(yàn)還測定線粒體融合和分裂蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：ALDH2蛋白表達(dá)增高時，線粒體融合蛋白Mfn2、OPA1升高，分裂蛋白Fis1、Drp1表達(dá)減少。說明ALDH2可能通過促進(jìn)線粒體的融合和抑制線粒體的分裂，減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，減輕對腦內(nèi)皮屏障的破壞。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ALDH2 預(yù)處理可以抑制ROS的釋放，減輕LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的損傷，其機(jī)制可能與維持線粒體融合和分裂平衡有關(guān)，二者之間相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。