王遠(yuǎn)迎，戴興月，陳春彥，程培鈞，陳松江，黎欣悅，畢 炫，程 瑤，吳昌學(xué)，吳 寧

貴州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2麻醉醫(yī)學(xué)院，3臨床醫(yī)學(xué)院，4醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性、炎癥性疾?。?］，致殘率極高，但發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，血管翳作為RA重要病理特征，主要由新生微血管、持續(xù)增生肥大的RA滑膜細(xì)胞、炎性細(xì)胞構(gòu)成，具體形成機(jī)制不清［2］，而VEGF在血管生成中起著至關(guān)重要的作用，包括調(diào)節(jié)血管通透性、破壞血管壁、降解基底膜、增加細(xì)胞外基質(zhì)的遷移和侵襲，以及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子［3］。

研究者發(fā)現(xiàn)［4,5］受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）或受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）激酶活性喪失均會(huì)降低VEGF 表達(dá)以及血管通透性和血管發(fā)芽程度，RIPK1、RIPK3是一種多功能細(xì)胞內(nèi)蛋白，是細(xì)胞壞死性凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，RIPK1的激活促進(jìn)RIPK3的募集，形成RIP1-RIP3復(fù)合物，隨后，RIPK3的激酶磷酸化混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（MLKL），p-MLKL進(jìn)行寡聚化并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，造成質(zhì)膜破裂并向細(xì)胞外空間釋放促炎細(xì)胞內(nèi)容物，這種細(xì)胞壞死和炎癥形成的正反饋回路，即壞死性凋亡［6,7］，而血管翳作為RA重要病理特征，目前普遍認(rèn)為滑膜炎癥因子大量表達(dá)，使得形成利于血管新生的微環(huán)境［8］，壞死性凋亡可加重持續(xù)炎癥反應(yīng)［9］，提示壞死性凋亡可能參與了RA血管新生過(guò)程，目前，壞死性凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病腎病等疾病中研究較多，但基于RIPK1/RIPK3/MLKL通路研究壞死性凋亡與血管新生之間關(guān)系研究較少，有研究者報(bào)道稱，RIPK1、RIPK3和p-MLKL的表達(dá)在CIA小鼠滑膜中增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡介質(zhì)表達(dá)增加［10］，而利用RIPK1抑制劑（NST）-1s可以通過(guò)抑制壞死性凋亡來(lái)減弱CIA 中的病理反應(yīng)［11］。因此基于RIPK1/RIPK3/MLKL探索壞死性凋亡與血管新生的作用將為RA的發(fā)生發(fā)展提供關(guān)鍵線索。

目前，以非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素為代表的治療藥物起效慢，且毒副作用較大［12］。因此開發(fā)療效好、毒副作用小的新藥迫在眉睫，貴州特色苗醫(yī)藥方“四大血”（SX）是由雞血藤、五花血藤、見血飛、黑骨藤四種藤本藥材組成，作為苗族地區(qū)流傳的通氣散血的代表方劑，是治療RA的優(yōu)勢(shì)藥物，但其作用機(jī)制不清，尚處于經(jīng)驗(yàn)用藥階段［13］。課題組前期研究結(jié)果顯示，SX水煎液可減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠（CIA）關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，抑制關(guān)節(jié)滑膜組織增生，通過(guò)下調(diào)VEGF、VEGFR-2的表達(dá)，減少血管生成改善血管新生等病理表現(xiàn)［13-15］，故本研究通過(guò)構(gòu)建CIA大鼠模型，以RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路為靶點(diǎn)，探究SX對(duì)CIA大鼠壞死性凋亡及滑膜血管增生的干預(yù)機(jī)制，為挖掘SX藥用價(jià)值，開發(fā)其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 42只雄性SPF級(jí)SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量為180～220 g，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)[SYXK（黔）2018-001]。SX由五花血藤、雞血藤、見血飛、黑骨藤按15∶22∶15∶8比例組成，藥材均由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院苗醫(yī)藥教研室提供，并經(jīng)田振華副教授鑒定，雷公藤多苷片購(gòu)至黃石飛云制藥公司（批號(hào)：20080301）。

1.1.2 主要試劑與儀器 不完全弗氏佐劑（Sigma），牛II型膠原（Chondrex），TNF-α及、IL-17 及IL-1β試劑盒（上海巧伊生物科技有限公司），一抗VEGF、RIPK3、Caspase-8、β-actin（Bioworld），MMP9（華安生物），Ang-1、STAT-3（HUABIO），RIPK1、MLKL（abcam），p-MLKL（ABclonal），二抗（Bioworld，），PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），水平電泳槽DYY-Ⅲ31D（北京六一儀器廠），酶標(biāo)儀（BIO-TEK），Quanity One凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD），DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 42只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～200 g，隨機(jī)分為空白組（Nor）、模型組（Mod）、“四大血”高劑量組（SX 40 g/kg）、中劑量組（SX 20 g/kg）、低劑量組（SX 10 g/kg）和雷公藤多苷片對(duì)照組（GTW），7只/組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后造模，將2 mg/mL牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑于冰上混合，充分乳化后，以1滴乳化劑于水中不擴(kuò)散為準(zhǔn)，大鼠麻醉后，取乳化后的混合物0.2 mL于尾根部皮下注射進(jìn)行初次免疫，1周后于足跖皮下加強(qiáng)免疫1次，通過(guò)關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分判定造模情況，其中，達(dá)到4分及4分以上，則判定造模成功。

1.2.2 藥物制備與給藥方案 五花血藤、雞血藤、見血飛、黑骨藤，按照15∶22∶15∶8比例配制，共取2000 g，加適量水煮3次（時(shí)間分別為1 h、30 min、30 min），合并濃縮液500 mL，生藥濃度為4 g/mL，4 ℃冰箱備用。第2次造模結(jié)束后開始給藥，給藥方案：SX高、中、低劑量組灌胃給藥濃度分別為40、20、10 g/kg（按生藥計(jì)）；GTW組給藥濃度為40 g/kg，Nor組和Mod組用等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，1次/d，連續(xù)21d。

1.2.3 各組大鼠AI、關(guān)節(jié)腫脹率測(cè)算 每日定期觀察大鼠情況，拍照記錄關(guān)節(jié)紅腫、關(guān)節(jié)畸形情況，初次注射乳化劑當(dāng)天起，采用AI評(píng)分觀察大鼠后足關(guān)節(jié)病變情況，每隔7 d觀察1次，共5次。AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分（無(wú)紅腫）；1分（關(guān)節(jié)有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹）；2分（關(guān)節(jié)病變中度紅腫）；3分（關(guān)節(jié)除中度紅腫外，伴有輕度功能障礙）；4分（關(guān)節(jié)重度紅腫，僵直甚至畸形，嚴(yán)重功能障礙）；將2只后踝關(guān)節(jié)的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)，每只大鼠AI評(píng)分最高為8分，AI評(píng)分越高表示關(guān)節(jié)病變?cè)絿?yán)重。初次免疫起，每隔1周，采用大鼠足部容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠雙后足腫脹度，足腫脹度計(jì)算公式如下：ER（%）=（V1-V2）/V2×100%（其中V2為造模前的容積，V1造模后的容積）。

1.2.4 標(biāo)本采集 給藥21 d后，使用10%水合氯醛麻醉各組大鼠，真空采血管進(jìn)行心臟取血，靜置10 min后4 ℃，3000 r/min 離心10 min，分離血清用于ELISA實(shí)驗(yàn)；取脾臟和胸腺組織并稱量各組織質(zhì)量，計(jì)算脾腺指數(shù)，胸腺指數(shù)（脾指數(shù)）=胸腺（脾）質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%；并取各組大鼠炎性后腿，一部分使用4%多聚甲醛固定，用于HE染色，另一部分使用生理鹽水沖洗后置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot及Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 滑膜組織病理學(xué)觀察 將固定于4%多聚甲醛中的膝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、貼片、染色，并使用光學(xué)顯微鏡觀察周圍組織病理變化。

1.2.6 ELISA檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-17、TNF-α表達(dá)使用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-17、TNF-α表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.7 Real-time PCR檢測(cè)滑膜組織中RIPK1、RIPK3、Caspase-8、MMP-9、VEGF、Ang-1 mRNA 表達(dá) 使用Trizol Reagent試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃300 s；循環(huán)反應(yīng)，95 ℃10 s，60 ℃20 s，循環(huán)40 次。引物序列（表1）。

表1 各基因引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.2.8 Western blot 檢 測(cè)RIPK1、RIPK3、Caspase-8、MLKL、p-MLKL、VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3 蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取滑膜組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜，封閉，加入對(duì)應(yīng)的一抗RIPK1（1∶1000）、RIPK3（1∶1000）、Caspase-8（1∶1000）、MLKL（1∶1000）、p-MLKL（1∶1000）、VEGF（1∶1000）、MMP9（1∶1000）、Ang-1（1∶1000）、STAT-3（1∶1000）、β-actin（1∶5000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5 min/次，共6次，加入二抗（1∶5000），室溫?fù)u床緩慢搖動(dòng)1.5 h，TBST洗滌5 min/次，共6 次，凝膠成像儀上進(jìn)行蛋白條帶檢測(cè)，Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SX對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

第2次造模結(jié)束后，與Nor組相比，各組大鼠雙后肢均出現(xiàn)明顯紅腫，毛發(fā)干枯現(xiàn)象，行動(dòng)遲緩甚至無(wú)法直立行走，連續(xù)給藥3周后，與Mod組相比，各給藥組足腫度均降低，其中GTW組、SX 40 g/kg足腫度降低最顯著（P＜0.001，表2、圖1）。

圖1 各組大鼠足腫脹度Fig.1 Hind limb joint swelling of the rats in each group.A-F:Normal control group,CIA model group,GTW group,SX 40 g/kg group,SX 20 g/kg group,and SX 10 g/kg group,respectively.

表2 SX對(duì)CIA大鼠雙后肢足腫脹度的影響Table 2 Effect of SX on swelling of bilateral hind limb joints in CIArats(Mean±SD,n=7)

2.2 SX對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)AI評(píng)分的影響

AI評(píng)分可以客觀反映出大鼠發(fā)病的情況，連續(xù)給藥3周后，與Nor組相比，Mod組大鼠AI評(píng)分明顯增高（P＜0.001），而與Mod組相比，GTW組和SX 40 g/kg組的AI評(píng)分明顯下降（P＜0.001、P＜0.01），而其余給藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 SX對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)AI評(píng)分的影響Table 3 Effect of SX on arthritis index score in CIArats(Mean±SD,n=7)

2.3 SX對(duì)CIA大鼠脾臟及胸腺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

連續(xù)給藥3周后，與Nor組相比，Mod組胸腺和脾臟指數(shù)均升高（P＜0.001），與Mod組相比，其中，GTW組、SX 40 g/kg組胸腺和脾臟指數(shù)均明顯降低（P＜0.001），SX 20 g/kg胸腺和脾臟指數(shù)有所下降（P＜0.05、P＜0.01），且SX 40 g/kg組與GTW組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 SX對(duì)CIA大鼠脾臟及胸腺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of SX on mass fraction of the spleen and thymus in the rats (n=7).***P＜0.001 vs the Nor group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Model group;▲P＜0.05,▲▲▲P＜0.001 vs GTW group.

2.4 SX對(duì)CIA大鼠滑膜組織病理學(xué)的影響

光鏡下觀察組織病理變化顯示，連續(xù)給藥3周后，Nor組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，層次清楚，關(guān)節(jié)滑膜未見增生，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Mod組關(guān)節(jié)腔內(nèi)見大量炎性細(xì)胞滲出，滑膜上皮明顯增生，滑膜重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；GTW組組織輕度充血及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象發(fā)生；SX 40 g/kg、SX 20 g/kg組關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織充血明顯減輕，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SX 10 g/kg組軟骨組織中度增生，軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較Mod組有所減輕（圖3）。

圖3 SX對(duì)各組大鼠滑膜組織病理改變的影響Fig.3 Effect of SX on pathological changes of the synovial tissue of the rats(HE staining,original magnification:×100).A-F:Normal control group,CIA model group,GTW group,SX 40 g/kg group,SX 20 g/kg group,and SX 10 g/kg group,respectively.

2.5 SX對(duì)CIA大鼠血清細(xì)胞因子的影響

給藥3周后，取各組大鼠的血清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，與Nor組相比，Mod組大鼠血清中IL-17、IL-1β、TNF-α含量均升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）；與Mod組相比，各給藥組IL-1β、TNF-α、IL-17 含量均下降；其中SX 40 g/Kg組中下降更顯著（P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05，表4）。

表4 SX對(duì)CIA大鼠血清細(xì)胞因子的影響Table 4 Effect of SX on serum cytokine levels in CIArats(Mean±SD,n=7)

2.6 SX對(duì)CIA大鼠中RIPK1、RIPK3、Caspase-8、VEGF、MMP9、Ang-1 mRNA表達(dá)水平的影響

給藥21 d后，取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與Nor組相比，Mod組中RIPK1、RIPK3 mRNA表達(dá)水平增高（P＜0.01），Caspase-8 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01）；而與Mod組相比，SX 40 g/kg組RIPK1、RIPK3 的mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.01、P＜0.05），Caspase-9 mRNA表達(dá)水平增加（P＜0.01），而SX 20 g/kg、SX 10 g/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A～C）。

進(jìn)一步檢測(cè)促血管生長(zhǎng)因子VEGF、MMP9、Ang-1 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與Nor組相比，Mod組中VEGF、MMP9、Ang-1 mRNA表達(dá)均增高（P＜0.001、P＜0.001、P＜0.01），而與Mod組相比，SX 40 g/kg、SX 20 g/kg組VEGF、MMP9、Ang-1 mRNA 表達(dá)均降低，其中，SX 40 g/kg組降低更顯著（P＜0.001、P＜0.001、P＜0.01），而SX 10 g/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4D～F）。

圖4 SX對(duì)CIA大鼠中RIPK1、RIPK3、Caspase-8、VEGF、MMP9、Ang-1 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of SX on mRNA expression levels of RIPK1,RIPK3,caspase-8,VEGF,MMP9,and Ang-1 in the synovium of the CIA rats(n=7).**P＜0.01,***P＜0.001 vs the Nor group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs the Mod group;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01,▲▲▲P＜0.001 vs GTW group.

2.7 SX對(duì)CIA大鼠中RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL、Caspase-8、VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3蛋白表達(dá)水平的影響

給藥21 d后，取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與Nor組相比，Mod組中RIPK1、RIPK3、的蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.01、P＜0.001），MLKL磷酸化水平增加（P＜0.01），并降低Caspase-8 蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）；而與Mod組相比，SX 40 g/kg組下調(diào)RIPK1、RIPK3 蛋白表達(dá)（P＜0.01，P＜0.001），MLKL磷酸化水平降低（P＜0.01），并上調(diào)Caspase-8蛋白表達(dá)（P＜0.001、P＜0.01），SX 10 g/kg組RIPK1、RIPK3、Caspase-8、p-MLKL 的蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A～D）。

而進(jìn)一步檢測(cè)促血管生長(zhǎng)因子VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Nor組相比，Mod組中VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.001、P＜0.001、P＜0.01、P＜0.001）；與Mod組相比，SX 40 g/kg、SX 20 g/kg組VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3表達(dá)均降低，其中，SX 40 g/kg組降低更顯著（P＜0.001），SX 10 g/kg中VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5E～I(xiàn)）。

圖5 SX對(duì)CIA大鼠中RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL、Caspase-8、VEGF、MMP9、Ang-1、STAT-3蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of SX on expression level of RIPK1,RIPK3,caspase-8,VEGF,MMP9,Ang-1,and STAT-3 proteins in the synovium of the CIArats(n=7).**P＜0.01,***P＜0.001 vs the Nor group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs the Mod group;▲P＜0.05,▲▲P＜0.01,▲▲▲P＜0.001 vs GTW group.

3 討論

RA是一種慢性、自身性免疫疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［2］，非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等治療RA一線藥物，雖能有效緩解臨床癥狀，但毒副作用明顯［12］，而中草藥具有多組分、多通路、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，已成為治療RA的潛在藥物［17］。貴州苗醫(yī)藥方“四大血”由雞血藤、黑骨藤、見血飛、五花血藤四種藤本藥材構(gòu)成，是貴州苗族地區(qū)治療RA的優(yōu)勢(shì)藥物，但目前正處于經(jīng)驗(yàn)用藥階段。課題組前期證明SX能夠緩解CIA大鼠模型炎癥反應(yīng)和血管新生，但具體機(jī)制不清［13-15］。

RA主要病理特征為血管翳的形成［18］，主要由新生微血管、持續(xù)增生肥大的RA 滑膜細(xì)胞、炎性細(xì)胞構(gòu)成［19］，最重要的特征就是新生血管呈“腫瘤樣”浸潤(rùn)生長(zhǎng)?；ぱ苌L(zhǎng)機(jī)制目前尚不明確，普遍認(rèn)為是由多種致炎因素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子浸潤(rùn)滑膜，滑膜增生肥大，需形成新血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，導(dǎo)致滑膜血管過(guò)度新生，促進(jìn)血管翳形成［20］。

血管新生涉及內(nèi)皮細(xì)胞遷移、微血管基底膜的破壞、ECM重構(gòu)、發(fā)芽、管形成、血管穩(wěn)定等復(fù)雜、多步驟、協(xié)調(diào)連續(xù)過(guò)程，受到各種細(xì)胞因子嚴(yán)密調(diào)節(jié)［21］。血管生成始于血管生長(zhǎng)因子，如：VEGF，VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞同源受體VEGFR-2結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和發(fā)芽［22］，另外，STAT-3被各種細(xì)胞因子激活［23］，與另一種STAT蛋白匹配形成同源二聚體或異源二聚體，此后，它們轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)基因表達(dá)過(guò)程，從而直接影響VEGF 的表達(dá)。MMP9 作為MMPs家族中具有代表性成員，具有明膠酶的作用，可通過(guò)參與基底膜重構(gòu)、降解ECM、刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌相關(guān)血管生長(zhǎng)因子等多種途徑增加血管新生，對(duì)血管新生具有長(zhǎng)期調(diào)控作用［24］。最后，血管被促血管生成因子（Ang-1）穩(wěn)定，將外周細(xì)胞整合到新形成的底膜中，以促進(jìn)血流過(guò)程［25］。

而在本實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)檢測(cè)VEGF、MMP9、Ang-1 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組相比，SX能下調(diào)CIA大鼠滑膜組織中VEGF、MMP9、Ang-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，使用WB檢測(cè)STAT-3蛋白表達(dá)水平，與模型組相比，SX能下調(diào)CIA大鼠滑膜組織中STAT3蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果提示SX具有減緩血管新生的功效。

研究證實(shí)，持續(xù)的炎癥是滑膜血管新生的啟動(dòng)階段，而壞死性凋亡是炎癥發(fā)生的內(nèi)源性誘因［26］。壞死性凋亡是區(qū)別于凋亡、自噬和壞死后新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式［27］，由RIPK1、RIPK3執(zhí)行，當(dāng)細(xì)胞膜表面受體TNFR1與TNF-α結(jié)合后，募集TRAF2（TNFR 相關(guān)因子2）和RIPK1等形成復(fù)合體Ⅰ，復(fù)合體Ⅰ對(duì)RIPK1進(jìn)行不同修飾，從而決定細(xì)胞死亡［28］，此時(shí)，若Caspase-8被抑制，則促進(jìn)RIPK1和RIPK3磷酸化形成復(fù)合物IIb，即壞死小體，壞死小體作為壞死性凋亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［29］，可通過(guò)介導(dǎo)RIPK3募集MLKL使其磷酸化，使大量Ca2+和Na+內(nèi)流、細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞膜完整性破壞，部分細(xì)胞內(nèi)含物將作為損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)進(jìn)入周圍組織，釋放內(nèi)源性危險(xiǎn)分子［30］，誘導(dǎo)IL-17、TNF-α、IL-1β等促炎因子引起炎性細(xì)胞聚集，放大局部炎癥反應(yīng)［31］，細(xì)胞因子募集血液中白細(xì)胞遷移至滑膜處，造成炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成利于血管新生的炎性微環(huán)境［32］。

越來(lái)越多證據(jù)證明，壞死性凋亡在心血管疾病和炎癥性疾病中扮演重要角色，如，動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病腎病等［33,34］。在本項(xiàng)研究中，我們?cè)贑IA模型大鼠中發(fā)現(xiàn)了壞死性凋亡的證據(jù)，與Nor組相比，Mod組大鼠滑膜組織中RIPK1、RIPK3 mRNA表達(dá)水平也顯著增加，且Caspase-8 mRNA及蛋白表達(dá)水平較空白組顯著下降，而與Mod 組相比，SX 治療組的滑膜組織中RIPK1、RIPK3、p-MLKL蛋白表達(dá)水平較空白組顯著減少，同時(shí)Caspase-8 mRNA及蛋白表達(dá)水平較空白組顯著增加，提示SX可抑制CIA大鼠滑膜組織RIPK1/RIPK3/MLKL信號(hào)通路的激活，從而減少壞死性凋亡的發(fā)生。

另外，ELISA結(jié)果中顯示，與Mod組相比，SX各劑量組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-17表達(dá)水平均下降；HE病理切片中發(fā)現(xiàn)，Mod組大鼠的滑膜明顯增生，滑膜細(xì)胞排無(wú)規(guī)則列，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而SX治療組滑膜細(xì)胞排列整齊、視野內(nèi)滑膜細(xì)胞增生減少。脾臟和胸腺是體內(nèi)重要免疫器官，胸脾指數(shù)可以在一定程度上反映機(jī)體免疫水平高低，臟器指數(shù)結(jié)果顯示，SX各劑量組胸脾指數(shù)較模型組均降低，同時(shí)，SX能降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、緩解大鼠足趾紅腫。以上結(jié)果提示：SX可能通過(guò)抑制CIA 大鼠滑膜組織RIPK1/RIPK3/MLKL 信號(hào)通路的激活，減少壞死性凋亡的發(fā)生，從而緩解大鼠的炎性癥狀。

綜上所述，本研究提示，SX可以改善CIA大鼠滑膜血管新生，其機(jī)制可能與抑制RIP1/RIP3/MLKL信號(hào)通路激活，阻止滑膜組織壞死性凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，從而下調(diào)促血管生長(zhǎng)因子VEGF、Ang-1、MMP9、STAT-3表達(dá)有關(guān)。提示SX有重大的藥用價(jià)值，為尋找RA治療提供思路，對(duì)開展SX藥物的研發(fā)以及指導(dǎo)其臨床運(yùn)用具有重要意義。然而，壞死性凋亡與血管新生之間作用關(guān)系較復(fù)雜，后續(xù)，我們將繼續(xù)深入探究壞死性凋亡與血管新生之間具體的調(diào)控機(jī)制以及SX在其中發(fā)揮的作用。