王慶武，叢倩倩，孔 怡，李秀梅，崔 曉，安秀榮

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 泰安 271000）

黑木耳（Auricularia auricula）是我國(guó)第二大食用菌栽培品種，產(chǎn)量占世界的90%以上[1]。隨著北耳南擴(kuò)及鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興的發(fā)展，黑木耳規(guī)?；?、工廠化栽培逐步加速，原有固體菌種制作技術(shù)已跟不上產(chǎn)業(yè)發(fā)展的節(jié)奏。液體菌種因具有培養(yǎng)周期短、菌齡一致、發(fā)菌快等優(yōu)點(diǎn)，且有利于進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，越來(lái)越受到食用菌生產(chǎn)企業(yè)的青睞，已成為當(dāng)前食用菌制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[2]。液體菌種同固體菌種一樣，需要一定的培養(yǎng)條件，才能制備出優(yōu)質(zhì)菌種，以滿足生產(chǎn)需要[3]。本研究以菌絲體生物量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)黑木耳液體菌種制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在獲得菌絲體含量高、菌絲活力強(qiáng)、成本低的優(yōu)質(zhì)液體菌種，為黑木耳菌種工廠化生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)提供技術(shù)支持[4-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

黑木耳菌株“黑威11號(hào)”，黑龍江省科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基配方：馬鈴薯20%（去皮煮汁）、麥麩4%（煮汁）、葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、瓊脂2%，水1 L。

液體培養(yǎng)基配方：玉米粉3%、淀粉4%、酵母膏0.1%、麥麩0.2%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、維生素B10.015%、花生油0.03%，水1 L，pH自然。

1.1.3 發(fā)酵罐

容積為100 L的發(fā)酵罐，氣流式攪拌，裝液量為容積的75%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母種制備

取冰箱內(nèi)保藏的黑木耳母種，在無(wú)菌條件下挑取邊長(zhǎng)為4 mm×4 mm的菌種塊，接種于新的斜面培養(yǎng)基上，于溫度為24℃～28℃下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面，待用。

1.2.2 不同接種塊大小處理

250 mL三角燒瓶中裝入150 mL液體培養(yǎng)基，0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫備用。無(wú)菌條件下各取1 cm×1 cm的母種塊，分別平均分成大小為10 mm×10 mm、10 mm×5 mm、5 mm×5 mm、2.5 mm×2.5 mm、小于2.5 mm×2.5 mm的母種塊，接入液體培養(yǎng)基中，靜置24 h。置于轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的恒溫?fù)u床上，25℃～28℃培養(yǎng)7 d。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.3 不同培養(yǎng)溫度處理

液體培養(yǎng)基制備方法同1.2.2，無(wú)菌條件下接入1.2.2制備的菌絲生物量最高的液體菌種，接種量1%。置于轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的搖床中，分別于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃條件下培養(yǎng)5 d。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.4 不同裝液量處理

250 mL三角燒瓶中分別加入100 mL、150 mL、200 mL液體培養(yǎng)基，0.11 MPa條件下高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫后接種。接種量、接種方法同1.2.3。于24℃～28℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.5 不同接種量處理

液體培養(yǎng)基制備同1.2.2。無(wú)菌條件下接入1.2.3中制備的液體菌種，接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，于24℃～28℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的搖床培養(yǎng)5 d。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.6 不同轉(zhuǎn)速處理

液體培養(yǎng)基制備同1.2.2，接種量、接種方法同1.2.3。分別置于轉(zhuǎn)速為 120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1的恒溫?fù)u床上，于 24 ℃～28℃條件下培養(yǎng)5 d。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.7 不同通氣量處理

在100 L發(fā)酵罐中裝入液體培養(yǎng)基75 L，于0.11 MPa的高壓下蒸汽滅菌50 min，冷卻后無(wú)菌條件下在搖瓶中接入液體菌種700 mL，24℃～28℃條件下培養(yǎng)，設(shè)置4個(gè)不同通氣量處理。每分鐘通氣量以體積比表示，分別為1.0∶0.4、1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.8 不同培養(yǎng)時(shí)間處理

液體培養(yǎng)基的制備方法、接種方式、培養(yǎng)溫度與1.2.7中相同，每分鐘通氣量的體積比為1.0∶0.8。研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)液體菌種培養(yǎng)的影響。

1.2.9 菌絲體生物量的測(cè)定

將各處理菌液移入50 mL離心管中，離心機(jī)中10 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，稱量鮮菌絲體的質(zhì)量。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析

記錄每個(gè)處理菌絲生長(zhǎng)情況，以菌絲體生物量為衡量指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種塊大小對(duì)液體菌種的影響

接種塊大小對(duì)液體菌種的影響見表1。

從表1可以看出，接種塊大小對(duì)液體菌種有影響。同等大小的母種塊分成不同大小的接種塊，隨接種塊越來(lái)越小，液體菌種菌絲體生物量越來(lái)越高，菌絲球球徑也越來(lái)越小，且部分成菌絲段。接種塊小于2.5mm×2.5mm時(shí)，菌絲體生物量最高、球徑最小、菌絲球與菌絲段共存。

表1 接種塊大小對(duì)液體菌種的影響Tab.1 Effect of inoculation block size on liquid spawn

2.2 溫度對(duì)液體菌種的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)液體菌種的影響見表2。

從表2可以看出，培養(yǎng)溫度對(duì)液體菌種有影響。低溫和高溫均不利于菌絲的生長(zhǎng)，菌絲體生物量低；培養(yǎng)溫度為24℃～28℃時(shí)，菌絲體生物量差異不顯著，菌絲體均以菌絲球的形態(tài)存在，且球徑小，培養(yǎng)溫度為26℃時(shí)，菌絲體生物量最高。

表2 溫度對(duì)液體菌種的影響Tab.2 Effect of temperature on liquid spawn

2.3 裝液量對(duì)液體菌種的影響

裝液量對(duì)液體菌種的影響見表3。

從表3可以看出，裝液量對(duì)液體菌種有影響。在相同接種量下，裝液量越多，菌絲體生物量越低，菌絲球的直徑越大，大菌絲球的占比增加；適宜的裝液量為150 mL，即液體部分約占容器的60%。

表3 裝液量對(duì)液體菌種的影響Tab.3 Effect of medium volume on liquid spawn

2.4 轉(zhuǎn)速對(duì)液體菌種的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)液體菌種的影響見表4。

表4 轉(zhuǎn)速對(duì)液體菌種的影響Tab.4 Effect of rotation speed on liquid spawn

從表4可以看出，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)液體菌種有影響。轉(zhuǎn)速過(guò)低，菌絲體生物量少，菌絲體以菌絲球狀態(tài)存在，球徑大，大球占比高；轉(zhuǎn)速過(guò)高，菌絲體生物量也減少，菌絲體以菌絲球和菌絲段共存，菌絲段較多，球徑小，大球占比最小。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r·min-1時(shí)，菌絲體生物量最高，菌絲球和菌絲段共存，菌絲段少，球徑小，大球占比較少；其次是轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時(shí)，菌絲體生物量較高，菌絲球球徑相對(duì)較小，大球占比相對(duì)較少。

2.5 通氣量對(duì)發(fā)酵菌種的影響

通氣量對(duì)發(fā)酵菌種的影響見表5。

表5 通氣量對(duì)發(fā)酵菌種的影響Tab.5 Effect of aeration on fermentation spawn

從表5可以看出，通氣量對(duì)發(fā)酵菌種有影響。隨通氣量的增加，菌絲體生物量增加，菌絲球含量減少，黏稠度增加。當(dāng)通氣量增加到1.0∶0.8時(shí)，菌絲體生物量最高，菌液黏稠；當(dāng)通氣量增加到1.0∶1.0時(shí)，菌絲體生物量次之，菌絲完全以菌絲段的形態(tài)存在，菌液黏稠。

2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵菌種的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵菌種的影響見表6。

從表6可以看出，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵菌種有影響。培養(yǎng)1 d，菌絲體生物量增加緩慢；培養(yǎng)2 d，菌絲擴(kuò)增倍數(shù)顯著提高，菌絲體生物量逐漸增加；培養(yǎng)6 d，菌絲擴(kuò)增倍數(shù)提高緩慢，菌絲體生物量也增加緩慢；培養(yǎng)9 d，菌絲擴(kuò)增倍數(shù)降低，菌絲體生物量也隨之降低。菌液pH隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，第6天開始逐漸升高，直到培養(yǎng)結(jié)束。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌液黏稠度逐漸增加、氣味逐漸加濃、色澤逐漸加深；培養(yǎng)9 d，菌液黏稠度降低、氣味變淡、色澤變淺。各培養(yǎng)時(shí)間段，菌絲體形態(tài)均為絮狀。

表6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵菌種的影響Tab.6 Effect of culture time on fermentation spawn

3 結(jié)論與討論

用搖瓶培養(yǎng)黑木耳液體菌種時(shí)，接種塊過(guò)大，形成的菌絲量少，且接種塊易堵塞接種口和接種槍。培養(yǎng)溫度應(yīng)根據(jù)菌絲生物學(xué)特性，控制在適宜范圍內(nèi)，過(guò)高或過(guò)低均不利于菌絲的生長(zhǎng)。搖瓶裝液量過(guò)多，培養(yǎng)時(shí)易溢出，瓶口有菌液，容易造成污染。搖床轉(zhuǎn)速過(guò)低，菌絲打不碎，形成的菌絲球大，易堵槍口，且形成的菌絲量少，接種后萌發(fā)點(diǎn)少；搖床轉(zhuǎn)速越高，液體培養(yǎng)基中氧氣交換頻率就越高，菌絲生長(zhǎng)越快，菌絲生物量越多，但當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)一定值時(shí)菌絲生長(zhǎng)就不隨轉(zhuǎn)速提高而加大了。

液體發(fā)酵菌種制備時(shí)，通氣量少，菌液翻動(dòng)慢，菌絲不易碎，形成的菌絲量少，菌絲球大，易堵槍口；通氣量大，菌液翻動(dòng)快，菌絲易碎，菌絲球小，菌絲量多。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體生物量先快速增加，后緩慢增加，菌液逐漸黏稠，達(dá)到一定時(shí)間后，菌絲開始自溶，繼續(xù)培養(yǎng)，菌絲量逐漸降低，直至菌絲自溶消失。

綜上所述，黑木耳液體菌種制備時(shí)接種塊應(yīng)不大于2.5 mm×2.5 mm、培養(yǎng)溫度為24℃～28℃、裝液量約為 60%、搖床轉(zhuǎn)速為 140 r·min-1～160 r·min-1；發(fā)酵菌種制備適宜的通氣量為1.0∶0.8～1.0∶1.0、培養(yǎng)時(shí)間為6 d～7 d。在該培養(yǎng)條件下，制備的液體菌種菌絲體生物量高、菌絲球小、菌液黏稠、菌齡短、菌絲活力強(qiáng)。