魏慧珍 允文晶 崔西春

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1兒童重癥監(jiān)護(hù)室，2綜合重癥監(jiān)護(hù)室，3小兒外科（鄭州 450000）

肝母細(xì)胞瘤是目前臨床中較為常見的在胚胎時期已經(jīng)發(fā)生的祖細(xì)胞腫瘤，也是目前主要兒童腫瘤之一[1]。現(xiàn)階段雖然采用化療方案和手術(shù)技術(shù)對肝母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行干預(yù)可有效改善患者生存率，但患者的臨床預(yù)后質(zhì)量仍相對較差[2]。因此，積極尋找和探尋導(dǎo)致肝母細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，為選擇合理有效的臨床治療靶標(biāo)和預(yù)后評價標(biāo)志物具有十分重要的意義[3]。有學(xué)者指出，表觀遺傳修飾與腫瘤的識別高度相關(guān)，并可與多種分子生物學(xué)機(jī)制研究密切相關(guān)[4]。研究結(jié)果表明，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中核糖核酸（RNA）靶向修飾具重要生物學(xué)意義[5]。N6-腺苷酸甲基化（m6A）在多種信使RNA（mRNA）內(nèi)部修飾和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色，并與腫瘤發(fā)生和演進(jìn)高度相關(guān)。此外，在不同腫瘤基因組亞型或背景中m6A修飾扮演不同角色[6]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中METTL3起到重要的調(diào)控作用，并可有效調(diào)節(jié)mRNA降解和翻譯以及RNA穩(wěn)定性[7]。但在兒童肝母細(xì)胞瘤中METTL3介導(dǎo)IGF2BP3 m6A修飾的作用仍鮮有報道，因此，筆者通過分析METTL3介導(dǎo)IGF2BP3 m6A修飾對兒童肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移的影響，為臨床治療應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 方法采用qRT-PCR檢測小兒肝母細(xì)胞瘤HuH-6（購買自ATCC公司）中METTL3和IGF2BP3 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測METTL3和IGF2BP3蛋白表達(dá)（抗體購買自CST公司）。通過慢病毒轉(zhuǎn)染，在HuH-6細(xì)胞中敲低METTL3，并通過免疫印跡驗證METTL3蛋白表達(dá)，采用qRT-PCR與Western blot檢測IGF2BP3的表達(dá)，m6A甲基化RNA免疫沉淀技術(shù)分析IGF2BP3 mRNA m6A修飾的情況；CCK-8和Transwell小室實驗檢測細(xì)胞增殖及遷移能力。

1.1.1 sgMETTL3載體構(gòu)建利用CRISPR-sgRNA設(shè)計網(wǎng)站設(shè)計METTL3基因外顯子sgRNA序列，合成上游（5'-CACCGCACTGGGCTGTCACTACGGA-3'）和下游（5'-AAACTCCGTAGTGACAGCCCAGTGC-3'）基因序列，制備雙鏈DNA，通過BsmB I對lenti-CRISPR V2載體行后續(xù)的酶切、回收操作，并進(jìn)行連接。通過測序獲得正確的lenti-CRISPR V2-sgMETTL3質(zhì)粒。質(zhì)粒交由通用生物科技有限公司合成和測序。

1.1.2 METTL3低表達(dá)細(xì)胞系建立參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行慢病毒包裝，后曝光293FT細(xì)胞，病毒包裝質(zhì)粒ps PAX2、病毒膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G，lentiCRISPR v2-sgMETTL3質(zhì)?；騦entiCRISPR v2質(zhì)?；旌暇鶆?，后采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)染后收集加入HuH-6細(xì)胞培養(yǎng)基，后加入嘌呤霉素2 μg/mL行抗性篩選，篩選1周后的lentiCRISPR v2-sgMETTL3和lentiCRISPR v2穩(wěn)定細(xì)胞系。后將所有細(xì)胞分為空載體組和sgRNA組進(jìn)行處理。

1.1.3 m6A甲基化RNA免疫沉淀采用TRIzol抽提細(xì)胞RNA后打斷RNA，RNA片段與m6A抗體復(fù)4℃孵育4 h，室溫與磁珠孵育2 h，漂洗4次，洗脫m6A抗體并富集RNA。

1.1.4 免疫沉淀利用RIPA Buffer裂解液裂解細(xì)胞，后超聲破碎，4℃下采用IGF2BP2抗體、磁珠、IgG抗體孵育30 min，磁珠抗體孵育2 h，漂洗6次，洗脫IGF2BP3結(jié)合復(fù)合物，抽提RNA。

1.1.5 qPCR檢測逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，采用qPCR MIX試劑盒（THUNDER BIRD）檢測目的基因。利用CFX96 Touch實時熒光定量PCR儀檢測，預(yù)變性60 s、95℃，變性10 s、95℃，退火延伸30 s、60℃，共持續(xù)40個循環(huán)。METTL3基因、IGF2BP3基因、GAPDH基因、IGF2BP3 m6A甲基化基因和GAPDH m6A甲基化基因引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成提供。

1.1.6 Western blot檢測RIPA細(xì)胞裂解液抽提總蛋白，采用SDS-PAGE法分離總蛋白，后電轉(zhuǎn)至PCDF膜，后采用5% BSA封閉1 h，后在4℃條件下一抗孵育過夜，TBST洗滌4次，每次10 min，后室溫條件下使用二抗孵育1 h，采用ECL顯影液采集數(shù)據(jù)。

1.1.7 免疫熒光染色培養(yǎng)細(xì)胞爬片24 h，室溫4%多聚甲醛固定15 min，室溫通透10 min（0.5% Triton X-100），室溫下5% BSA封閉1 h，室溫一抗孵育2 h，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h，DPAI室溫下孵育5 min，后封片采集數(shù)據(jù)。

1.1.8 細(xì)胞劃痕檢測6孔板接種細(xì)胞后在底部畫橫線4條，采用PBS洗滌每孔3次并將漂浮細(xì)胞去除后加入無血清培養(yǎng)基2 mL，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0、24、48 h時使用顯微鏡拍照并計算。

1.1.9 Transwell實驗12孔板置入Transwell小室，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，后在Transwell小室上室中進(jìn)行接種，在下室加入完全培養(yǎng)基，并置于培養(yǎng)箱中24 h，后甲醛固定，甲醇通透，結(jié)晶紫染色，使用顯微鏡拍照并計算。

1.1.10 細(xì)胞增殖檢測使用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，后接種在96孔板中并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h和72 h，后利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖情況，采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測光密度值。

1.2 統(tǒng)計學(xué)方法本研究使用Graphpad和SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件包行統(tǒng)計學(xué)分析，采用百分率表示計數(shù)資料并行χ2檢驗分析數(shù)據(jù)資料差異，計量資料利用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示并行LSD-t檢驗和方差檢驗分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 METTL3敲低細(xì)胞系檢測本組研究結(jié)果顯示，采用METTL3 sgRNA干預(yù)后會顯著降低細(xì)胞METTL3表達(dá)水平，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1及圖2。

圖1 METTL3蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果Fig.1 Detection Results of METTL3 Protein Expression Level

圖2 免疫熒光染色檢測結(jié)果Fig.2 Results of immunofluorescence staining

2.2 各組細(xì)胞增殖結(jié)果本組研究結(jié)果顯示，sgRNA組細(xì)胞48 h和72 h時細(xì)胞增殖水平明顯低于空載體組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖結(jié)果Tab.1 Investigation results of cell proliferation in each group ±s，%

表1 各組細(xì)胞增殖結(jié)果Tab.1 Investigation results of cell proliferation in each group ±s，%

組別空載體組sgRNA組復(fù)孔數(shù)3 3 48 h 65.84±4.43 43.95±5.02 72 h 73.29±4.19 48.91±3.23

2.3 各組細(xì)胞遷移與侵襲檢測結(jié)果本組研究結(jié)果顯示，sgRNA組細(xì)胞24 h和48 h時細(xì)胞遷移明顯低于空載體組，sgRNA組細(xì)胞侵襲水平明顯低于空載體組，見圖3及圖4。

圖3 各組細(xì)胞遷移檢測結(jié)果Fig.3 Cell Migration Test Results of Each Group

圖4 各組細(xì)胞Transwell檢測結(jié)果Fig.4 Transwell Test Results of Cells in Each Group

2.4 各組IGF2BP3蛋白及mRNA檢測結(jié)果本組研究結(jié)果顯示，sgRNA組細(xì)胞中IGF2BP3蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯低于空載體組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組IGF2BP3蛋白及mRNA檢測結(jié)果Tab.2 Detection Results of IGF2BP3 Protein and mRNA in Each Group ±s

表2 各組IGF2BP3蛋白及mRNA檢測結(jié)果Tab.2 Detection Results of IGF2BP3 Protein and mRNA in Each Group ±s

組別空載體組sgRNA組復(fù)孔數(shù)3 3蛋白0.64±0.08 0.21±0.04 mRNA 0.71±0.12 0.34±0.08

2.5 IGF2BP3 m6A修飾水平檢測結(jié)果本組研究結(jié)果顯示，sgRNA組細(xì)胞中m6A-IP及IGF2BP3 m6A相對表達(dá)量明顯低于空載體組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 IGF2BP3 m6A修飾水平檢測結(jié)果Tab.3 IGF2BP3 m6A Modification Level Test Results ±s

表3 IGF2BP3 m6A修飾水平檢測結(jié)果Tab.3 IGF2BP3 m6A Modification Level Test Results ±s

組別空載體組sgRNA組復(fù)孔數(shù)3 3 m6A-IP/Input（%）1.02±0.14 0.63±0.08 IGF2BP3 m6A相對表達(dá)量1.03±0.09 0.57±0.08

3 討論

小兒肝母細(xì)胞瘤是現(xiàn)階段臨床中較為常見的嚴(yán)重惡性肝臟腫瘤之一，通常情況下該病患者多在出生后2年時發(fā)病，且臨床發(fā)病率約為百萬分之1.5左右，在全部兒童癌癥患者中約占1%左右，且近年來每年均呈現(xiàn)明顯的快速、持續(xù)增長狀態(tài)[8]。有學(xué)者指出，小兒肝母細(xì)胞瘤的組織學(xué)類型主要包括混合型、上皮型兩種[9]。研究發(fā)現(xiàn)，作為常見的散發(fā)性腫瘤，小兒肝母細(xì)胞瘤患者的三分之一患者可能存在家族性腺瘤性息肉病、貝克威斯。韋德曼綜合征、唐氏綜合征、Edward綜合征、腎母細(xì)胞瘤等均高度相關(guān)[10]。近年來，研究指出體質(zhì)量較輕嬰兒臨床中罹患肝母細(xì)胞瘤的風(fēng)險較高[11]?，F(xiàn)階段臨床中小兒肝母細(xì)胞瘤患兒的臨床分期是對患者預(yù)后質(zhì)量進(jìn)行評估和判斷的關(guān)鍵因素，且5年低風(fēng)險生存率約為80%，且復(fù)發(fā)或高風(fēng)險后5年生存率降低30%左右[12]。因此臨床中尋找和探尋新的治療兒童肝母細(xì)胞瘤的生物標(biāo)志物，具有十分重要的意義。

m6A修飾是現(xiàn)階段受到人們廣泛關(guān)注的重要轉(zhuǎn)錄后修飾方法，其中約60%左右RNA修飾通過m6A形式完成，該修飾方法也是最為主要和豐富的RNA修飾方案，且其序列中多存在高度保守的RRACH序列[13]。目前臨床中m6A修飾已成為主要和受到人們廣泛關(guān)注的表觀遺傳修飾新熱點。有研究指出RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶是調(diào)控m6A的主要方式，甲基轉(zhuǎn)移酶作為核心甲基化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白，METTL3有效催化m6A形成。去甲基化酶包括FTO、ALKBH5等，其中還有包括HNRNPA2B1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3等負(fù)責(zé)識別m6A修飾蛋白[14-15]。

METTL3目前公認(rèn)的可有效催化m6A功能蛋白的重要生物活性物質(zhì)，有研究指出，METTL3在細(xì)胞內(nèi)可有效催化RRACH出現(xiàn)m6A修飾[16-17]。METTL3廣泛分布在真核生物中并具高度保守性，METTL3具多種調(diào)控生物學(xué)功能的作用，早期胚胎會由于出現(xiàn)METTL3基因敲除而出現(xiàn)致死[18]。研究結(jié)果顯示，在哺乳動物胚胎發(fā)育中METTL3扮演十分重要的作用，并屬于生物調(diào)劑過程中扮演不可或缺角色[19]。有研究結(jié)果顯示，氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中可通過將METTL3敲除后有效抑制角膜新生血管形成，結(jié)果顯示血管生成與METTL3緊密相關(guān)，許多生理和病理過程均與血管生存高度相關(guān)，包括傷口愈合、胚胎發(fā)育、腫瘤生長、組織再生[20]。在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中METTL3扮演十分重要作用，并可有效調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。

自首次發(fā)現(xiàn)m6A修飾依賴作用，相關(guān)研究也逐漸受到人們的廣泛關(guān)注，且在正常的生物發(fā)育過程中扮演十分重要角色，m6A修飾起到動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)作用。RNA m6A修飾可有效通過m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物執(zhí)行，通過依賴Fe（Ⅱ）和αKG去甲基化酶有效去除后實現(xiàn)生理和病理條件m6A甲基化動態(tài)調(diào)節(jié)。作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化中心，METTL3以YTHDF2依賴促進(jìn)細(xì)胞信號因子抑制子2 mRNA降解，并在多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要作用[21]。但METTL3是否可介導(dǎo)m6A修飾影響兒童肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展仍鮮有報道。本組研究結(jié)果顯示，采用METTL3 sgRNA干預(yù)后會顯著降低細(xì)胞METTL3表達(dá)水平，sgRNA組細(xì)胞48 h和72 h時細(xì)胞增殖水平明顯低于空載體組。進(jìn)一步分析細(xì)胞遷移和侵襲顯示，sgRNA組細(xì)胞24 h和48 h時細(xì)胞遷移和侵襲水平明顯低于空載體組。通過分析METTL3與IGF2BP3關(guān)系分析顯示，sgRNA組細(xì)胞中IGF2BP3蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯低于空載體組。對m6A甲基化水平進(jìn)行檢測顯示，sgRNA組細(xì)胞中m6A-IP及IGF2BP3 m6A相對表達(dá)量明顯低于空載體組。在METTL3敲低后會有效介導(dǎo)IGF2BP3 m6A修飾途徑，METTL3缺失后持續(xù)調(diào)節(jié)mRNA甲基化。分析認(rèn)為，通過有效調(diào)節(jié)METTL3可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)一步分析其作用機(jī)制認(rèn)為，METTL3會有效調(diào)節(jié)IGF2BP3 m6A修飾而發(fā)揮其生理學(xué)活性和作用。通過降低METTL3水平會有效抑制和調(diào)控細(xì)胞周期信號通路，激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路，且其可促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，具有十分重要的作用。

綜上所述，METTL3可有效調(diào)節(jié)IGF2BP3 m6A修飾并對兒童肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移進(jìn)行調(diào)控。但METTL3是否可作為臨床治療兒童肝母瘤細(xì)胞的潛在靶點，還有待深入研究和分析。