尹磊 蔣志明 楊慧瓊 劉燕飛 鄭學(xué)斌

長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院心血管二科（長(zhǎng)沙 410000）

高血壓是常見(jiàn)的慢性疾病，調(diào)查顯示歐洲和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家的高血壓發(fā)病率高達(dá)20%，臨床特征血壓升高和心腦血管疾病[1-2]。而其作用的分子機(jī)制尚未明確。血液循環(huán)和免疫系統(tǒng)的重要組成部分，血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛涉及生物過(guò)程，包括調(diào)節(jié)血壓，血管形成，纖溶和炎癥[3-4]。研究[5]表明血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞不僅充當(dāng)物理屏障，還分泌多種影響血管舒張和收縮功能的物質(zhì)，高血壓期間，內(nèi)皮細(xì)胞受損增加[6]。因此，研究血管內(nèi)皮細(xì)胞在高血壓發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制有助于提高高血壓的診治水平。

線粒體是高度動(dòng)態(tài)的，多任務(wù)的細(xì)胞器，不斷地延長(zhǎng)（融合）和分裂（裂變），動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（Drp1）是線粒體裂變的主要調(diào)控因子[7]。與動(dòng)力蛋白相關(guān)的GTPase經(jīng)歷了許多步驟來(lái)介導(dǎo)線粒體裂變，裂變/融合平衡的中斷（主要是向裂變的轉(zhuǎn)變）擾亂了細(xì)胞生理學(xué)，并與多種疾病有關(guān)，包括心血管系統(tǒng)中的疾病[8]。各種壓力因素如高糖、缺氧和氧化應(yīng)激已被證明可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中依賴Drp1的線粒體裂變并介導(dǎo)內(nèi)皮病變，包括內(nèi)皮依賴性松弛受損、微血管減少以及傷口愈合和血管生成缺陷[9]。Mdivi-1是Drp1的選擇性抑制劑，可在GTPase結(jié)構(gòu)域外結(jié)合到參與寡聚物組裝的表面上，從而抑制Drp1 GTPase激活[10]。Drp1以及線粒體裂變?cè)趦?nèi)皮炎癥中的機(jī)制貢獻(xiàn)尚未明確。

血管生成是由HuR調(diào)控的癌癥發(fā)展的重要方面之一，參與血管生成相關(guān)基因的調(diào)控。絲氨酸/蘇氨酸激酶（PIM1）在細(xì)胞存活、增殖和分化中具有多種生物學(xué)作用[11]。PIM激酶在多種類型的腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞凋亡。研究表明PIM1可促進(jìn)內(nèi)皮遷移和血管生成，并抑制細(xì)胞毒性[12]。在本研究基于HUR/PIM1信號(hào)通路研究線粒體在高血壓血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系培養(yǎng)人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購(gòu)自ATCC，細(xì)胞在M199培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基有20%胎牛血清、50 μg/mL重組人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、25 U/mL肝素、100 U/mL青霉素和0.1 U/mL鏈霉素在37℃，5% CO2中。第3～6代的HUVEC用于所有實(shí)驗(yàn)。將靜止HUVECs隨機(jī)分為3組：control組；AngⅡ組（1 mmol/L）；Mdivi-1（25 μmol/L Mdivi-1+1 mmol/L AngII）組。

1.2 細(xì)胞活力測(cè)定使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活力。將HUVEC以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中。24 h以下以不同濃度的 0.01、0.1、1、10 mmol/L AngⅡ（Sigma）的處理，10 μL CCK-8加入到孔中，溫育在37℃下3 h。Spectra Max 190酶標(biāo)儀（Sunnyvale，USA）進(jìn)行比色分析，并在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。

1.3 線粒體形態(tài)染色采用線粒體選擇性探針，檢測(cè)線粒體形態(tài)。藥物處理24 h后，將活細(xì)胞與50 nmol/L絲粒體追蹤器在37℃下孵育30 min。孵育后，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細(xì)胞3次。使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察波長(zhǎng)為590/516 nm時(shí)的熒光。

1.4 線粒體膜電位通過(guò)JC-1染料用于測(cè)量線粒體膜電位。JC-1是一種陽(yáng)離子染料，在線粒體中表現(xiàn)出電位依賴性積累，在活細(xì)胞中由紅色熒光表示。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，JC-1作為單體存在于細(xì)胞質(zhì)中，由綠色熒光表示。因此，紅色/綠色熒光強(qiáng)度比表明線粒體膜電位的變化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)將HUVEC用胰蛋白酶消化、收集并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次，使用FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD Biosciences）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡。早期凋亡細(xì)胞通過(guò)Annexin V單陽(yáng)性染色鑒定，壞死細(xì)胞通過(guò)碘化丙啶單陽(yáng)性染色鑒定，晚期凋亡細(xì)胞通過(guò)碘化丙啶和Annexin V雙陽(yáng)性染色鑒定。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果使用ModFit v3.2軟件進(jìn)行分析

1.6 內(nèi)皮細(xì)胞的遷移Tinza對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的使用transwell室進(jìn)行評(píng)估，將懸浮有無(wú)血清ECM的HUVEC細(xì)胞以2×104的密度接種在板中，底部腔室充滿0.6 mL新鮮ECM。HUVEC細(xì)胞在37℃培養(yǎng)24 h。用棉簽除去膜表面的非遷移細(xì)胞后，用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色遷移至下膜表面的HUVEC細(xì)胞。圖像通過(guò)EVOS XL Core拍，使用Image-Pro-Plus 6.0分析遷移細(xì)胞。

1.7 體外血管形成試驗(yàn)體外血管生成研究中，體外試管形成試驗(yàn)使用ibidi載玻片進(jìn)行。將200 000個(gè)HUVEC懸浮在1 mL M199培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充有指定濃度的Tinza。將細(xì)胞懸液（50 μL）施加到每個(gè)載玻片孔中，并在37℃的加濕室中孵育。在細(xì)胞接種后0、0.5、3、6、9 h，以10倍放大率對(duì)管形成進(jìn)行成像。9 h后用Image J軟件定量總管長(zhǎng)。

1.8 實(shí)時(shí)定量熒光PCR使用RNAiso Plus試劑提取HUVEC中的總RNA，通過(guò)PrimeScript RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。引物通過(guò)生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)制造商的說(shuō)明，數(shù)據(jù)處理根據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算兩組間目的基因相對(duì)表達(dá)含量的變化。

1.9 蛋白質(zhì)印跡分析使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物（Sigma Chemical Co）的RIPA裂解緩沖液（Beyotime Biotech）中裂解HUVEC細(xì)胞。細(xì)胞裂解物通過(guò)8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。膜在室溫下在5%脫脂牛奶中封閉1 h，與以下一抗一起孵育Drp-1、ROS、HUR（1∶500）和 PIM1均來(lái)自 Cell Signaling Technology（CST）；β-actin（Santa）。洗滌后，將二抗即HRP偶聯(lián)的抗兔或抗小鼠（CST），在室溫下孵育1 h，將膜使用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行可視化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有資料以（）表示，多組間差異通過(guò)單因素方差分析，數(shù)據(jù)表示為來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngII和Mdivi-1對(duì)HUVEC細(xì)胞活力的影響CCK-8測(cè)定測(cè)量AngⅡ?qū)?xì)胞活力的影響，選擇了0.01、0.1、1、10 mmol/L AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果表明，AngⅡ（1 mmol/L）以劑量依賴性方式降低HUVEC細(xì)胞活力，Mdivi-1升高了HUVEC細(xì)胞活力，見(jiàn)圖1A-B。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在用0.1、1、10 mmol/L AngⅡ處理24 h后，Drp-1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1C-D。

圖1 AngⅡ和Mdivi-1對(duì)HUVEC細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of AngⅡand Mdivi-1 on the viability of HUVEC cells

2.2 Mdivi-1對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC線粒體形態(tài)和膜電位的影響免疫熒光結(jié)果，與control組相比，AngⅡ組導(dǎo)致線粒體形態(tài)從細(xì)長(zhǎng)的細(xì)胞器改變?yōu)榫鶆虻狞c(diǎn)狀細(xì)胞器，Mdivi-1組線粒體再次被拉長(zhǎng)，見(jiàn)圖2A。JC-1的結(jié)果顯示AngⅡ組線粒體膜電位降低，Mdivi-1組線粒體膜電位升高，見(jiàn)圖2B。AngⅡ組Drp1蛋白表達(dá)增加，提示線粒體發(fā)生了裂變，Mdivi-1組HUVECs時(shí)，Drp1的表達(dá)被抑制。裂變介導(dǎo)的碎片與細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生有關(guān)，與control組相比，AngⅡ處理24 h的ROS水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Mdivi-1抑制Drp1顯著降低了AngⅡ誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2C-E。

圖2 Mdivi-1對(duì)AngII誘導(dǎo)的HUVEC線粒體形態(tài)和膜電位的影響Fig.2 The effect of Mdivi-1 on AngII-induced HUVEC mitochondrial morphology and membrane potential

2.3 Mdivi-1對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC凋亡、遷移及血管生成的影響流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，數(shù)據(jù)顯示AngⅡ組HUVEC的凋亡率增加。Mdivi-1降低細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖3A-B。Transwell試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，AngⅡ組通過(guò)腔室膜的HUVECs數(shù)顯著高于control組，Mdivi-1組與control組HUVECs數(shù)量無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3C-D。在網(wǎng)絡(luò)形成試驗(yàn)中，結(jié)果表明Mdivi-1抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的管形成，管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量減少并且管狀結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3E。

圖3 Mdivi-1對(duì)AngII誘導(dǎo)的HUVEC凋亡、遷移及血管生成的影響Fig.3 Effects of Mdivi-1 on AngII-induced HUVEC apoptosis，migration and angiogenesis

2.4 Mdivi-1對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞HUR/PIM1的影響qPCR、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HUVEC細(xì)胞HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量，AngⅡ組HUVEC的HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量升高，Mdivi-1組細(xì)胞HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4A-E。

圖4 Mdivi-1對(duì)AngII誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞HUR/PIM1的影響Fig.4 The effect of Mdivi-1 on AngII-induced HUR/PIM1 in HUVEC cells

3 討論

高血壓是由環(huán)境和遺傳因素相互作用引起的復(fù)雜疾病[13]。研究[14]表明線粒體與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在血管組織中的表達(dá)顯著增加。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙是高血壓的重要跡象，線粒體在內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙中起重要作用[15]。本研究實(shí)驗(yàn)表明Mdivi-1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs的HUR/PIM1信號(hào)通路及其凋亡、遷移和血管生成，減少ROS產(chǎn)生。

本研究顯示AngⅡ處理上調(diào)了HUVEC中Drp1的蛋白質(zhì)水平。Drp1蛋白表達(dá)的增加表明線粒體經(jīng)歷了裂變事件，Drp1的增加與線粒體碎片增加相一致[16]。與對(duì)照相比組，用AngⅡ處理導(dǎo)致線粒體形態(tài)從細(xì)長(zhǎng)到均勻碎片細(xì)胞器的變化。最近研究顯示Mdivi-1治療抑制Drp1從而降低了AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙，通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生，抑制凋亡和遷移能力，改善線粒體形態(tài)，細(xì)胞凋亡是通過(guò)線粒體內(nèi)在途徑進(jìn)行的，如線粒體膜電位的喪失，促凋亡[17]。本研究顯示AngⅡ和Mdivi-1孵育HUVECs時(shí)，Drp1的表達(dá)顯著降低，這與最近的研究結(jié)果一致[18]。大量研究[19]表明，AngⅡ可以通過(guò)增加ROS的產(chǎn)生來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞功能障礙，ROS與線粒體功能障礙密切相關(guān)。本研究表明與control組相比，AngⅡ治療顯著提高了HUVECs的ROS水平。AngⅡ促進(jìn)血管系統(tǒng)中氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，是內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵介質(zhì)功能障礙和凋亡[20]。此外，AngⅡ誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，細(xì)胞凋亡是因形態(tài)學(xué)和生化變化而致細(xì)胞死亡的主要模式[21]。研究[22]表明細(xì)胞凋亡是以細(xì)胞收縮、膜起泡和染色質(zhì)凝結(jié)為特征的細(xì)胞死亡類型。當(dāng)線粒體功能減弱或細(xì)胞內(nèi)ATP耗盡時(shí)，AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡導(dǎo)致內(nèi)皮單層的剝除。本研究結(jié)果顯示AngⅡ處理誘導(dǎo)HUVECs線粒體形態(tài)及膜電位降低，細(xì)胞凋亡和遷移能力增加，血管形成升高。而Mdivi-1可以保護(hù)AngⅡ處理誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞功能障礙，其線粒體形態(tài)改善及線粒體膜電位升高，HUVEC細(xì)胞的凋亡、遷移和血管形成能力降低。

研究[23]顯示HuR在巨噬細(xì)胞中的促血管生成作用已在巨噬細(xì)胞Hur敲除小鼠中得到證實(shí)，微血管生成顯著減弱。PIM蛋白家族是原癌基因家族，在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出增加的表達(dá)水平。PIM激酶在多種類型的腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞凋亡[24]。研究[25]表明 PIM1可促進(jìn)內(nèi)皮遷移和血管生成，并抑制細(xì)胞毒性。此外，研究[26]顯示HuR-PIM1軸對(duì)維持血管生成轉(zhuǎn)換非常重要。本研究顯示AngⅡ處理誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞HUR/PIM1信號(hào)通路顯著升高，而Mdivi-1可以降低了AngⅡ處理誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞HUR/PIM1信號(hào)通路的表達(dá)。此外，本研究存在一定的局限性，只有通過(guò)一種細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，并還需要后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示線粒體抑制劑Mdivi-1降低了AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞HUR/PIM1信號(hào)通路，Mdivi-1減少了高血壓血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、遷移及血管生成，這表明抑制了線粒體及相關(guān)途徑，可為預(yù)防心血管疾?。ㄈ绺哐獕海┲械膬?nèi)皮功能障礙提供新策略。