盧凌霄，高珊，于洋，王銀月，鄒春野，于鴻雪，呂小飛

（遼源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 遼源 136200）

1 材料

1.1 植物材料

常規(guī)水稻、哥倫比亞生態(tài)型（Columbia，Col）擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 質(zhì)粒與菌株

中間載體pUC-19、黃色熒光融合瞬時(shí)表達(dá)載體pSAT6-EYFP 均由本實(shí)驗(yàn)室保存，pEASY-T5 cloning vector 購(gòu)于北京Transgen 公司，大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京Transgen 公司。

1.3 試劑盒

PCR 擴(kuò)增所需引物均在上海生工生物工程公司合成，KOD FX 及rTaq 購(gòu)買(mǎi)于TOYOBO 生物技術(shù)公司，各種DNA 限制性?xún)?nèi)切酶、T4 連接酶均購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)New England Biolabs（北京）公司，DNA Marker 和蛋白Marker 購(gòu)買(mǎi)于TaKaRa 公司。

質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于GeneStar 公司，DNA 膠回收試劑盒購(gòu)于Omega 公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 克隆啟動(dòng)子

1）Act2-1啟動(dòng)子克隆。CTAB法提取水稻總DNA，NCBI檢索Os Actin2-1 序列（GenBank:EU259512.1 1 008 bp），設(shè)計(jì)引物，分段PCR 法擴(kuò)增目標(biāo)片段P1（880 bp）、P2（120 bp），膠回收片段P1、P2，T4 DNA 連接酶連接兩片段得到完整Actin2-1 啟動(dòng)子，克隆載體測(cè)序與目標(biāo)序列比對(duì)。啟動(dòng)子序列中存在一個(gè)PstI 酶切位點(diǎn)，影響后續(xù)載體構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物突變掉克隆所得片段中的PstI 酶切位點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 設(shè)計(jì)引物序列

2）Ubi 啟動(dòng)子改造。玉米Ubiquitin 啟動(dòng)子為實(shí)驗(yàn)室保存，序列中有一個(gè)EcoR I 酶切位點(diǎn)，影響后續(xù)載體構(gòu)建，需設(shè)計(jì)引物將酶切位點(diǎn)鈍化，改造后的Ubi 啟動(dòng)子需進(jìn)行功能驗(yàn)證。

2.2 啟動(dòng)子功能驗(yàn)證

2.2.1 黃色熒光瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建

利用 In-Fusion 方法構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pACT-EYFP 和pUBI-EYFP，利用AgeI 和EcoR V 酶切位點(diǎn)以In-Fusion 無(wú)縫克隆方法將35S 啟動(dòng)子分別替換為克隆并改造得到的Act2-1 和Ubi 啟動(dòng)子，利用QIAGEN 大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。

2.2.2 原生質(zhì)體制備及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化所需母液

配制200 mL 0.8 mol/L 甘露醇，0.2 mol/L MES，1 mol/L CaCl2，1 mol/L KCl，2 mol/L MgCl2，5 mol/L NaCl，50 mL 10%BSA，滅菌室溫保存。

2.2.3 配制工作液

1）酶解液（20 mL）：取0.2 mol/L MES 母液20 mL于70 ℃預(yù)熱3 min后，加入1.5%Cellulase R10、0.4%Macerozyme R10、0.4 mol/L mannitol、1 mol/L KCl 母液0.4 mL，55 ℃水浴10 min，冷卻后加入1 mol/L CaCl2200 μL、10%BSA 200 μL。

2）W5 溶液（100 mL）：取0.2 mol/LMES 1 mL、5 mol/L NaCl 6.16 mL、1 mol/L CaCl212.5 mL、1 mol/L KCl 500μL，加入滅菌的ddH2O 至100 mL。

3）MMG 溶液（100 mL）：取0.2 mol/L MES 2 mL、0.8mol/L mannitol 50 mL、2 mol/L MgCl21.5 mL，加入滅菌的ddH2O 至100 mL。

4）WI 溶液（100 mL）：取0.2 mol/L MES 2 mL、0.8 mol/L mannitol 62.5 mL、1 mol/L KCl 2 mL，加入滅菌的ddH2O 至100 mL。

5）PEG 溶液（10 mL）：稱(chēng)取PEG4 g、0.2 mol/Lmannitol 1 mL、1 mol/L CaCl21 mL，加入滅菌的ddH2O 8 mL，55 ℃水浴促進(jìn)溶解，提前1 h 配制。

2.2.4 制備擬南芥原生質(zhì)體，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體

1）剪取21 d 左右的未抽薹擬南芥葉片，用刀片將葉片切成細(xì)條，浸于5 mL 酶解液中，輕輕搖晃。

2）放入25 ℃培養(yǎng)箱中，用錫箔紙包住避光酶解3 h 后形成綠色酶/原生質(zhì)體溶液，期間可以汲取少量液體在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體狀態(tài)。

3）加入W5 溶液5 mL，用75 μm 過(guò)濾篩過(guò)濾到圓底離心管中。

4）使用水平低速離心機(jī)，配平后100 rpm 離心2 min，小心吸出上清液。

5）加入W5 溶液2 mL 重懸，冰上放置30 min，原生質(zhì)體會(huì)沉降至管底。

6）小心吸出清液，加入MMG 溶液2 mL 重懸，按轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒數(shù)均勻地分到無(wú)菌的離心管中。

7）按每100 μL 原生質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)化1 μg 質(zhì)粒，將質(zhì)粒稀釋后加到原生質(zhì)體細(xì)胞中，輕輕混勻后，緩慢加入PEG 溶液110 μL（邊加邊混勻），避光放置10 min。

8）加入W5 溶液400 μL，輕輕混勻后，終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

9）以離心力100 g 離心2 min，吸出上清液，加入WI 溶液1 mL 重懸，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中。

10）25 ℃避光過(guò)夜孵育。

11）取100 μL 溶液于激光共聚焦顯微鏡下觀察啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)熒光蛋白的情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 Act2-1 啟動(dòng)子的克隆、改造及測(cè)序結(jié)果分析

PCR 擴(kuò)增出的P1、P2 片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見(jiàn)圖1（a），HindⅢ和BamHⅠ雙酶切中間載體pUC-19，與酶切處理過(guò)的P1、P2 片段連接，獲得pUC-Act，菌落PCR 和雙酶切驗(yàn)證，見(jiàn)圖1（b）和圖1（c）。

使用突變PstI 位點(diǎn)引物PCR 擴(kuò)增，可分別得到830 bp 和210 bp 的兩個(gè)片段，見(jiàn)圖1（d），回收兩個(gè)片段作為模板擴(kuò)增得到突變了酶切位點(diǎn)的完整Act2-1啟動(dòng)子片段，回收片段連接到克隆載體pEASY-Blunt Zero上，進(jìn)行菌落PCR 和雙酶切驗(yàn)證，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得突變了PstI 位點(diǎn)完整Act2-1 啟動(dòng)子，見(jiàn)圖2。

圖1 Act2-1 啟動(dòng)子的克隆

圖2 Act2-1 啟動(dòng)子序列

3.2 Ubi 啟動(dòng)子的改造及測(cè)序結(jié)果分析

Ubi 啟動(dòng)子全長(zhǎng)2 035 bp，使用鈍化酶切位點(diǎn)EcoR I 引物擴(kuò)增兩片段大小分別為1 415 bp、651 bp，回收兩個(gè)片段作為模板，使用上下游引物第二輪擴(kuò)增出Ubi 啟動(dòng)子全長(zhǎng)，連接到克隆載體上挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得突變EcoR I 酶切位點(diǎn)的Ubi 啟動(dòng)子。

3.3 黃色熒光瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建及啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光蛋白表達(dá)能力觀察

利用In-Fusion 方法構(gòu)建表達(dá)載體pACT-EYFP和pUBI-EYFP，大提質(zhì)粒。與攜帶35s 啟動(dòng)子的對(duì)照載體一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體，激光共聚焦顯微鏡下觀察啟動(dòng)子是否能正常啟動(dòng)黃色熒光蛋白表達(dá)。對(duì)照35S::YFP 能夠正常表達(dá)熒光蛋白，經(jīng)克隆改造得到的Act2-1 和Ubi 啟動(dòng)子也均觀測(cè)到黃色熒光蛋白，見(jiàn)圖3，證明試驗(yàn)所得啟動(dòng)子具有啟動(dòng)蛋白表達(dá)功能。

圖3 擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)黃色熒光蛋白

4 結(jié)論

根據(jù)NCBI 檢索Os Actin2-1 序列，PCR 法克隆得到Actin2-1 啟動(dòng)子，與檢索序列同源性達(dá)100%，在此基礎(chǔ)上突變掉礙于下一步載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn)，得到新的Act2-1 啟動(dòng)子；在已有的玉米Ubiquitin 啟動(dòng)子基礎(chǔ)上使用PCR 法突變掉EcoR I 酶切位點(diǎn)，使其便于下一步自有載體構(gòu)建體系的應(yīng)用。

使用擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化Act2-1、Ubiquitin啟動(dòng)子構(gòu)建的黃色熒光瞬時(shí)表達(dá)載體，以黃色熒光蛋白基因作為報(bào)告基因，激光共聚焦顯微鏡下觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，可觀測(cè)到黃色熒光蛋白的表達(dá)，證明克隆得到的新啟動(dòng)子具有啟動(dòng)功能，可以用于單子葉植物表達(dá)載體的構(gòu)建。