殷春前

（宣城市標(biāo)準(zhǔn)計量所，安徽宣城 242000）

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中氮含量的一種方法。在催化劑作用下，用濃硫酸消解樣品，使氮化合物轉(zhuǎn)變?yōu)殇@鹽，在堿性條件下蒸餾，將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨氣，隨水蒸氣被冷凝，并用過量的硼酸溶液吸收，以酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量計算出樣品中的氮含量[1]。凱式定氮儀是根據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行氮含量測定的儀器，分為全自動和半自動兩類。由于其安全可靠，根據(jù)樣品不同可選擇蒸餾速度，操作簡便，近些年來廣泛應(yīng)用于檢測谷物、食品、飼料、水、土壤、淤泥、沉淀物和化學(xué)品中的氨、蛋白質(zhì)氮含量。

目前，我國尚未對凱氏定氮儀制訂統(tǒng)一的檢定規(guī)程或校準(zhǔn)規(guī)范，對于該類計量儀器，至今尚無進(jìn)行量值溯源可依據(jù)的國家計量檢定規(guī)程和校準(zhǔn)規(guī)范，也無一個全面、具體的參考依據(jù)。在具體工作實踐中，大部分是參照J(rèn)JF 1321—2011《元素分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》對該類儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。由于JJF 1321—2011是一個通用的元素分析儀校準(zhǔn)規(guī)范，未針對凱氏定氮法消化、滴定做出具體規(guī)定，實際操作中結(jié)果差異很大[2-3]。為更好地解決當(dāng)前凱氏定氮儀校準(zhǔn)溯源問題，服務(wù)于相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)及使用單位，使該類儀器生產(chǎn)、溯源更加科學(xué)和規(guī)范，根據(jù)有關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)及計量技術(shù)規(guī)范并結(jié)合工作中的實際情況，筆者探討了凱式定氮儀的校準(zhǔn)方法，并在此基礎(chǔ)上主持起草了安徽省地方計量技術(shù)規(guī)范JJF(皖)127—2022《全自動凱氏定氮儀校準(zhǔn)規(guī)范》，該規(guī)范已于2022年1月發(fā)布實施[4-5]。

1 凱式定氮儀的組成和原理

凱式定氮儀作為一種依照凱式定氮法基礎(chǔ)上所設(shè)計的儀器，用于對混合物、化合物內(nèi)總氮含量的測量，主要由消解、蒸餾、滴定裝置組成[6]。常見凱氏定氮儀的消解和蒸餾裝置見圖1。在有催化劑的條件下，用濃硫酸消解樣品，轉(zhuǎn)變有機(jī)氮成為無機(jī)銨鹽，之后堿化并蒸餾處理游離氨，用硼酸吸收蒸餾出的水蒸氣，再以鹽酸、硫酸等標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計算樣品中的氮含量。由于蛋白質(zhì)的含氮量系數(shù)較為恒定，該方法可作為定量測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法[7-10]。

圖1 常見凱氏定氮消解和蒸餾裝置

2 校準(zhǔn)項目及技術(shù)指標(biāo)

2.1 校準(zhǔn)項目的確立

凱氏定氮儀通常分為全自動凱氏定氮儀和半動凱氏定氮儀，均依據(jù)凱氏定氮法原理設(shè)計制造。全自動凱氏定氮儀對消解后的樣品進(jìn)行自動定量添加試劑、蒸餾、吸收、滴定并輸出測試結(jié)果；而半自動凱氏定氮儀對消解后的樣品進(jìn)行自動定量添加試劑、蒸餾、吸收，僅滴定步驟需要人工操作[11]。

根據(jù)GB/T 33862—2017《全(半)自動凱氏定氮儀》中4.4條的規(guī)定：“全自動儀器示值誤差應(yīng)不超過1%”，儀器示值誤差是保證檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠的一個重要參數(shù)。

根據(jù)GB/T 33862—2017《全(半)自動凱氏定氮儀》中4.5條的規(guī)定：“半自動儀器的回收率應(yīng)在99%～101%之間”，儀器回收率是確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要技術(shù)指標(biāo)。

根據(jù)GB/T 33862—2017《全(半)自動凱氏定氮儀》中4.6條的規(guī)定：“儀器的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于0.5%”，儀器重復(fù)性采用測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，其結(jié)果應(yīng)不大于0.5%。

綜上所述，凱氏定氮儀校準(zhǔn)的主要參數(shù)確定為示值誤差、回收率、測量重復(fù)性。

2.2 主要計量性能指標(biāo)

根據(jù)儀器的組成和工作原理，以及GB/T 33862—2017《全(半)自動凱氏定氮儀》對該類儀器的具體要求，凱氏定氮儀測量氮元素質(zhì)量為0.1～210 mg，其主要計量性能指標(biāo)見表1。

表1 凱氏定氮儀主要計量性能指標(biāo)

3 校準(zhǔn)條件和校準(zhǔn)方法

3.1 環(huán)境條件

校準(zhǔn)的環(huán)境條件應(yīng)確保儀器正常穩(wěn)定的工作，采用GB/T 33862—2017《全(半)自動凱氏定氮儀》規(guī)定的工作條件作為校準(zhǔn)的環(huán)境條件。環(huán)境溫度：15～35 ℃；相對濕度：不大于85%；電源：額定交流電壓為(220±20) V，頻率為(50±0.5) Hz，儀器接地良好；無易燃易爆和腐蝕性氣體；設(shè)備周圍應(yīng)無強(qiáng)烈振動及影響儀器正常工作的外磁場，應(yīng)避免其它冷、熱源影響。

3.2 校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

凱氏定氮儀測定氮含量的三個步驟為消化、蒸餾、自動滴定。其工作原理表明，可選擇含銨根離子的化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。常見的含銨根離子的化合物有尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和碳酸銨等。校準(zhǔn)過程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需經(jīng)烘干、稱量、溶解后再進(jìn)行后續(xù)的測量，要求校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)必須具備高溫穩(wěn)定以及吸濕點(diǎn)相對較高的特點(diǎn)。硝酸銨易吸濕結(jié)塊和受熱爆炸性分解，碳酸銨對光和熱均不穩(wěn)定，因此這兩種物質(zhì)不適于作為選擇對象。分別選擇尿素、硫酸銨、氯化銨三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開展校準(zhǔn)工作[12-14]，配制后的標(biāo)準(zhǔn)溶液含氮質(zhì)量和不確定度列于表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的含氮質(zhì)量及其不確定度

3.3 主要儀器與試劑

全自動凱氏定氮儀：VELP UDK-159型，意大利威爾普公司。

電子分析天平：ATX224R型，感量0.1 mg，島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

尿素溶液：(1)A 溶液。0.014 0 g/mL(以氮質(zhì)量計)，用天平稱取3.003 0 g 尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用水溶解定容于100 mL 容量瓶中，搖勻；(2)B 溶液。0.001 4 g/mL(以氮質(zhì)量計)，取10 mL的A溶液，用水定容于100 mL容量瓶中，搖勻。

硫酸銨溶液：(1)A 溶液。0.014 0 g/mL(以氮質(zhì)量計)。用天平稱取6.606 5 g硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用水溶解定容于100 mL 容量瓶中，搖勻；(2)B 溶液。0.000 14 g/mL(以氮質(zhì)量計)，取10 mL 的A 溶液用水定容于100 mL容量瓶中，搖勻。

氯化銨溶液：(1)A 溶液。0.014 0 g/mL(以氮質(zhì)量計)，用天平稱取5.349 0 g 氯化銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用水溶解定容于100 mL 容量瓶中，搖勻；(2)B 溶液。0.001 4 g/mL，取10 mL 的A 溶液用水定容于100 mL容量瓶中，搖勻備用。

硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.05 mol/L，0.25 mol/L。

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.1 mol/L，0.5 mmol/L。

甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、乙醇、硼酸、氫氧 化 鈉、硫 酸、硫 酸 銅(CuSO4·5H2O)、硫 酸 鉀(K2SO4)：分析純。

甲基紅乙醇溶液：1 g/L，稱取0.1 g甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

溴甲酚綠乙醇溶液：1 g/L，稱取0.1 g溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

混合指示劑：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨使用時混合。

氫氧化鈉溶液：稱取400 g 氫氧化鈉于500 mL燒杯中，用水溶解，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容至標(biāo)線，搖勻。

硼酸溶液：稱取20.00 g 硼酸，用水溶解并定容至1 000 mL容量瓶中，搖勻，轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，按體積比100∶1 加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，混勻。

硫酸鉀-硫酸銅混合催化劑：將1 000 g硫酸鉀和50 g硫酸銅充分混合并仔細(xì)研磨。

校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液使用濃度及其參數(shù)見表3。

表3 校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液使用濃度及其參數(shù)

實驗用水為二次蒸餾水或去離子水。

3.4 校準(zhǔn)方法

按照儀器使用說明書操作要求，將儀器調(diào)至正常工作狀態(tài)。檢查儀器外觀是否整潔，不應(yīng)有刻痕和脫漆，主機(jī)箱體、連接線、玻璃部件等應(yīng)無劃痕或破損，各控制調(diào)整開關(guān)和旋鈕等應(yīng)操作靈活，零件表面不得銹蝕，產(chǎn)品銘牌及標(biāo)志應(yīng)耐久和清楚[15]。

3.4.1 儀器示值誤差

待儀器穩(wěn)定運(yùn)行后，按照覆蓋儀器設(shè)定量程低、中、高范圍或者根據(jù)客戶要求，選擇含氮質(zhì)量分別為7、14、28、140、210 mg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，加入消化管中，再依次加入0.5 g 硫酸鉀-硫酸銅混合催化劑、10 mL 濃硫酸進(jìn)行消解，同時取相同體積的水做空白對照。消解完全后，按照規(guī)定流程對儀器進(jìn)行操作，每種濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別重復(fù)測量3次，按照式(1)計算儀器示值誤差。

式中：E——儀器示值誤差，%；

-X——3 次測量標(biāo)準(zhǔn)溶液含氮質(zhì)量平均值，mg；

Xs——標(biāo)準(zhǔn)溶液含氮質(zhì)量標(biāo)稱值，mg。

3.4.2 儀器回收率

儀器選定的量程范圍內(nèi)，選用含氮質(zhì)量為14 mg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，或者按照客戶要求選擇標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入消化管中，再依次加入0.5 g硫酸鉀-硫酸銅混合催化劑、10 mL濃硫酸進(jìn)行消解，同時取相同體積的水做空白對照。消解完全后，按照規(guī)定流程對儀器進(jìn)行操作，根據(jù)式(2)計算氮含量m，連續(xù)測量3次，按照式(3)計算儀器回收率：

式中：m——含氮質(zhì)量，mg；

V1——滴定消耗的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

V2——滴定空白時消耗的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

c——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；14.01——氮的摩爾質(zhì)量；

K——回收率，%；

-m——3 次測量標(biāo)準(zhǔn)溶液含氮質(zhì)量的平均值，mg；

ms——標(biāo)準(zhǔn)溶液含氮質(zhì)量，ms=14 mg。

3.4.3 儀器重復(fù)性

在3.4.1的測量條件下，選用含氮質(zhì)量為140 mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測量6 次，按照式(4)計算儀器重復(fù)性。

式中：Sr——相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，%；

mi——第i次測量值，mg；

n——測量次數(shù)，n=6。

4 校準(zhǔn)結(jié)果與方法驗證

選取常見的意大利威爾普公司VELP UDK-159型全自動凱氏定氮儀，按照上述校準(zhǔn)方法，采用氯化銨、硫酸銨、尿素3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別進(jìn)行校準(zhǔn)。

4.1 驗證用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

表4 驗證用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一覽表

因市場上暫時無法購買到國家級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的硫酸銨，以硫酸銨基準(zhǔn)試劑代替。

4.2 校準(zhǔn)試驗結(jié)果

4.2.1 儀器示值誤差

按照3.4.1方法，儀器示值誤差試驗結(jié)果見表5。由表5可知，儀器示值誤差均不超過±1%，滿足正常使用要求。

表5 儀器示值誤差試驗結(jié)果

4.2.2 儀器回收率

按照3.4.2 方法，采用氯化銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[16]，吸取10 mL氯化銨基準(zhǔn)試劑溶液于凱氏定氮儀中進(jìn)行校準(zhǔn)測試，測量10 次，結(jié)果見表6。由表6 可見，儀器回收率為99.31%～101.38%，平均回收率為100.21%，試驗結(jié)果理想。

表6 采用氯化銨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時儀器回收率試驗數(shù)據(jù)

分別采用硫酸銨基準(zhǔn)試劑[17]、尿素為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)測試，所得儀器回收率分別為99.67%～100.88%、98.66%～99.32%，平均回收率分別為100.32%、99.02%。結(jié)果表明，使用氯化銨、硫酸銨校準(zhǔn)結(jié)果較好，使用尿素校準(zhǔn)結(jié)果一般。

4.2.3 儀器測量重復(fù)性

按照3.4.3方法，儀器測量重復(fù)性試驗結(jié)果見表7。由表7 可知，儀器測量重復(fù)性不大于0.5%，滿足正常使用要求。

表7 測量重復(fù)性試驗結(jié)果

4.3 結(jié)果分析

結(jié)合以上數(shù)據(jù)分析，以氯化銨、硫酸銨為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于計量校準(zhǔn)，示值誤差、回收率和重復(fù)性均優(yōu)于尿素[18]。究其原因，硫酸銨和氯化銨中氮元素均為銨態(tài)氮，而尿素中的氮為酰胺態(tài)氮，消化過程中銨態(tài)氮更為穩(wěn)定，另外尿素較氯化銨、硫酸銨更容易吸潮、水解，影響測量結(jié)果。

5 結(jié)語

選取儀器示值誤差、儀器回收率、儀器測量重復(fù)性3個計量特性對凱氏定氮儀進(jìn)行校準(zhǔn)。分別以氯化銨、硫酸銨、尿素3 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對儀器校準(zhǔn)，試驗結(jié)果表明氯化銨、硫酸銨更為理想。