張佳仁，吳成新，李耀悅

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 201114）

細(xì)胞是有機(jī)體和生命活動(dòng)的基本單位，是具有獨(dú)立、有序的自控代謝體系，深入研究細(xì)胞對(duì)于揭開(kāi)生命奧秘和疾病治療等具有十分重要的意義。開(kāi)展細(xì)胞研究離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，這是一種可以直接觀察活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)及其變化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是實(shí)驗(yàn)室模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的常用研究方法[1]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需要提供適宜的溫度、濕度、二氧化碳濃度和酸度等滿足其生長(zhǎng)和發(fā)育的生理?xiàng)l件與環(huán)境，一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度控制在37 ℃，pH 控制在7.2～7.4，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)控制在5.0%[2-3]。二氧化碳對(duì)細(xì)胞膜具有直接作用，一般認(rèn)為二氧化碳和細(xì)胞膜的脂質(zhì)發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性能變化，降低了細(xì)胞攝取離子和營(yíng)養(yǎng)的能力；細(xì)胞外的二氧化碳濃度直接影響影響細(xì)胞內(nèi)pH，改變細(xì)胞活性[4-5]。二氧化碳濃度的不合理偏差和波動(dòng)性會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)減慢和細(xì)胞分化，降低細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量[6]。

二氧化碳培養(yǎng)箱通常由二氧化碳濃度控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)和空氣循環(huán)系統(tǒng)等組成，可以在箱體內(nèi)模擬形成細(xì)胞在生物體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，提供穩(wěn)定的溫度(37 ℃)、二氧化碳濃度(體積分?jǐn)?shù)5.0%)，是細(xì)胞培養(yǎng)的一種先進(jìn)儀器和必需的關(guān)鍵設(shè)備[7]。培養(yǎng)箱的二氧化碳體積分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在(0～20)%，且當(dāng)二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5.0%時(shí)，示值誤差應(yīng)不大于0.5%[8]。培養(yǎng)箱對(duì)于二氧化碳濃度的技術(shù)要求較高，因此保證二氧化碳培養(yǎng)箱的量值準(zhǔn)確性與溯源性具有非常重要的意義。

JJF 1101—2019《環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備溫度、濕度參數(shù)校準(zhǔn)規(guī)范》只適用于培養(yǎng)箱、霉菌試驗(yàn)箱、腐蝕氣體箱等設(shè)備的溫度及濕度參數(shù)校準(zhǔn)[9]，二氧化碳培養(yǎng)箱溫度、濕度的量值溯源可參照此規(guī)程。然而其二氧化碳濃度的量值溯源沒(méi)有相應(yīng)的檢定規(guī)程或校準(zhǔn)規(guī)范，導(dǎo)致該儀器的性能無(wú)法評(píng)價(jià)。為了更好地服務(wù)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)與使用單位，筆者根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8-10]及儀器說(shuō)明書(shū)，建立了二氧化碳培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度的在線校準(zhǔn)方法。在線校準(zhǔn)方法以紅外吸收法為理論依據(jù)，可在培養(yǎng)箱正常工作的情況下，將紅外濃度傳感器放置于箱體內(nèi)部，或者通過(guò)校準(zhǔn)口抽取箱體內(nèi)部氣體至紅外濃度傳感器的檢測(cè)室，即可測(cè)量二氧化碳培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于：保證被檢設(shè)備結(jié)構(gòu)完整的情況下，無(wú)需停機(jī)，允許保持被檢設(shè)備的運(yùn)行狀態(tài)，校準(zhǔn)過(guò)程可與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

目前二氧化碳的檢測(cè)方法較多，主要有紅外吸收法、氣相色譜法、滴定法、固體電解質(zhì)法、熱量法和光纖檢測(cè)法等[11]。紅外吸收法因其準(zhǔn)確度高、響應(yīng)快和便捷性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于二氧化碳濃度的在線測(cè)量[12]，即不停機(jī)無(wú)損測(cè)量。

每種氣體分子在化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在差異性，導(dǎo)致各氣體對(duì)特定波長(zhǎng)的紅外輻射吸收程度具有唯一性。特定氣體的紅外吸收強(qiáng)度與濃度成正比關(guān)系。紅外吸收法是基于二氧化碳對(duì)4.26 μm的紅外線具有選擇性吸收的能力，且二氧化碳對(duì)紅外輻射的吸收能力與二氧化碳濃度之間符合朗伯-比耳定律，即吸收強(qiáng)度與濃度成正比關(guān)系。因此，通過(guò)檢測(cè)二氧化碳的紅外光強(qiáng)度的變化，便可以定量地確定二氧化碳的濃度[13]。

1.2 環(huán)境條件

環(huán)境溫度：10～35 ℃；相對(duì)濕度：不大于80%；供電電壓：(220±22)V；周圍無(wú)強(qiáng)烈震動(dòng)，無(wú)強(qiáng)電磁場(chǎng)干擾。

1.3 主要儀器

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)器

二氧化碳濃度通常采用二氧化碳測(cè)定儀來(lái)測(cè)定，該儀器的核心部件為傳感器，由標(biāo)準(zhǔn)光源、測(cè)量室、濾波器和紅外檢測(cè)器組成[14]。紅外輻射從光源通過(guò)測(cè)量的氣體傳到檢測(cè)器，位于檢測(cè)器前面的濾波器防止非測(cè)量氣體特有的波長(zhǎng)抵達(dá)檢測(cè)器，檢測(cè)光強(qiáng)度并將其轉(zhuǎn)換為氣體濃度值。

1.3.2 傳感器

傳感器分為擴(kuò)散式和抽吸式，這兩種類型的傳感器均可用于二氧化碳濃度的在線測(cè)量[15]，主要區(qū)別在于擴(kuò)散式的濃度傳感器需要被放置于培養(yǎng)箱箱體內(nèi)，傳感器內(nèi)部測(cè)量室與箱體二氧化碳濃度需要達(dá)到平衡；抽吸式的濃度傳感器需要連接至培養(yǎng)箱外部的氣體校準(zhǔn)口，用自帶的氣泵將箱體內(nèi)濃度抽吸至傳感器的測(cè)量室。對(duì)于有氣體校準(zhǔn)口的培養(yǎng)箱，優(yōu)先選擇抽吸式傳感器。若選擇擴(kuò)散式的傳感器，則將傳感器放置于培養(yǎng)箱箱體內(nèi)部，位置盡量靠近被檢濃度檢測(cè)器附近，柜門與傳感器引線的夾縫處用膠泥填滿；若選擇抽吸式傳感器，則用專用軟管連接培養(yǎng)箱氣體校準(zhǔn)口與傳感器的進(jìn)氣口。

2 校準(zhǔn)項(xiàng)目與校準(zhǔn)方法

2.1 二氧化碳濃度偏差

定義：培養(yǎng)箱在穩(wěn)定狀態(tài)下的一段時(shí)間內(nèi)，二氧化碳濃度的顯示值與測(cè)定平均值的差值。

二氧化碳濃度偏差按式(1)計(jì)算：

式中：Δφ——二氧化碳濃度偏差，%；

φd——培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度的顯示值，%；

φs——二氧化碳體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定平均值，%。操作步驟：(1)檢查柜門與箱體的密封性，確保校準(zhǔn)過(guò)程無(wú)氣體泄露。(2)若選擇擴(kuò)散式的濃度傳感器，則將傳感器至于箱體內(nèi)部，盡量靠近箱體本身濃度檢測(cè)器的位置；若先擇抽吸式濃度傳感器，則用專用軟管連接箱體校準(zhǔn)口與傳感器進(jìn)氣口。(3)設(shè)定培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度值，開(kāi)啟運(yùn)行。(4)待箱體內(nèi)二氧化碳濃度穩(wěn)定后開(kāi)始記錄濃度實(shí)測(cè)值，記錄時(shí)間間隔為2 min，30 min 內(nèi)共記錄15 組數(shù)據(jù)。二氧化碳濃度穩(wěn)定時(shí)間以說(shuō)明書(shū)為依據(jù)，說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有給出的，一般按以下原則執(zhí)行：培養(yǎng)箱的顯示儀表達(dá)到設(shè)定值后，等待至少30 min且儀表顯示值波動(dòng)范圍不大于0.03%，最長(zhǎng)的的穩(wěn)定時(shí)間不超過(guò)60 min[16]。(5)計(jì)算培養(yǎng)箱顯示值與15組實(shí)測(cè)值的平均值之差。

2.2 二氧化碳濃度波動(dòng)性

定義：培養(yǎng)箱在穩(wěn)定狀態(tài)下的一段時(shí)間內(nèi)，培養(yǎng)箱箱體內(nèi)二氧化碳濃度的測(cè)定值隨時(shí)間的變化量，具體為測(cè)定值中的最大值與最小值之差的一半，冠以±號(hào)，按式(2)計(jì)算：

式中：Δφt——溫度波動(dòng)性，%；

φs，max——二氧化碳濃度測(cè)定值中的最大值，%；

φs，min——二氧化碳濃度測(cè)定值中的最小值，%。

操作步驟：二氧化碳濃度波動(dòng)性可與二氧化碳濃度測(cè)定值偏差一同進(jìn)行校準(zhǔn)，計(jì)算15組濃度測(cè)定值中極差值的一半。

3 校準(zhǔn)實(shí)例

樣品：Herocell 240 型二氧化碳培養(yǎng)箱，顯示分辨力為0.1%，穩(wěn)定時(shí)長(zhǎng)為15 min。

主要標(biāo)準(zhǔn)器：MI70 型二氧化碳測(cè)定儀(擴(kuò)散式)，配GMP251 傳感器，測(cè)量值最大允差(MPE)為±0.20%，分辨力為0.001%，維薩拉(北京)測(cè)量技術(shù)有限公司。

環(huán)境條件：溫度為21～22 ℃，相對(duì)濕度為62%～67%，周圍無(wú)強(qiáng)烈震動(dòng)，無(wú)強(qiáng)電磁場(chǎng)干擾，箱體密封性完好。

培養(yǎng)箱二氧化碳濃度設(shè)定為5.00%，擴(kuò)散式傳感器置于培養(yǎng)箱內(nèi)，靠近內(nèi)部檢測(cè)器。待箱內(nèi)二氧化碳濃度穩(wěn)定后，記錄二氧化碳濃度測(cè)定值，記錄時(shí)間間隔為2 min，30 min 內(nèi)共記錄15 組數(shù)據(jù)。測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 數(shù)據(jù)計(jì)算可知，二氧化碳濃度偏差為0.158%，二氧化碳濃度波動(dòng)性為±0.071%。

表1 二氧化碳體積分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 %

4 不確定度評(píng)定示例

4.1 輸入量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.1.1 二氧化碳濃度的測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u(φ)

二氧化碳濃度的測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u(φ)按照A類評(píng)定，重復(fù)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)偏差按式(3)計(jì)算：

將表1 二氧化碳濃度的測(cè)量數(shù)據(jù)代入式(3)，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)偏差s(φ)=0.083%，則由15 次獨(dú)立重復(fù)測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

4.1.2 二氧化碳測(cè)定儀的準(zhǔn)確度引入的不確定度u(φs)

4.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

濃度偏差數(shù)學(xué)模型：Δφ=φd-φs，靈敏系數(shù)：C1=1，C2=-1。則合成不確定度：

5 結(jié)語(yǔ)

針對(duì)二氧化碳培養(yǎng)箱建立了二氧化碳濃度偏差和波動(dòng)性的校準(zhǔn)方法。此校準(zhǔn)方法合理性、可操作性強(qiáng)。校準(zhǔn)用的標(biāo)準(zhǔn)器可溯源至公用計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以保證測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠。此校準(zhǔn)方法可為出廠檢驗(yàn)、第三方驗(yàn)證、計(jì)量機(jī)構(gòu)校準(zhǔn)提供參考借鑒。