王建國(guó)，常虹，王芳，雷凱，籍術(shù)良，張國(guó)峰，王艷春

（1. 北京市通州區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 101100； 2. 北京市通州區(qū)婦幼保健院，北京 101101）

糠醛、5-羥甲基糠醛是兩種在食品熱加工過(guò)程中產(chǎn)生的糠醛化合物，屬于內(nèi)源性污染物。高濃度下5-羥甲基糠醛對(duì)人體黏膜、橫紋肌和內(nèi)臟均具有刺激和損傷作用，具有基因毒性和遺傳毒性[1-2]?？Х染哂刑嵘裥涯X、消除疲勞、生津止渴、利尿等功效[3]，逐漸成為人們不可缺少的日常飲品。速溶咖啡是咖啡的一種，是采用物理方法，以水為唯一載體從焙炒咖啡粉中提取的干的水溶性產(chǎn)品[4]，由于在居家旅行中食用方便、物美價(jià)廉，為消費(fèi)者喜愛(ài)，產(chǎn)銷量逐年增加[5]?？啡?、5-羥甲基糠醛廣泛存在于咖啡中[6]，5-羥甲基糠醛為美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，在咖啡中含量較高，有研究發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛咖啡中最高含量達(dá)到13.5 g/kg[7]。目前食品中糠醛、5-羥甲基糠醛的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[8]、比色法[9]、液相色譜法[10-12]氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]，但文獻(xiàn)中鮮有速溶咖啡中糠醛、5-羥甲基糠醛的報(bào)道。筆者按照QuEChERS 原則對(duì)樣品進(jìn)行凈化，以同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，建立了靈敏度高、準(zhǔn)確性好的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法，滿足速溶咖啡中糠醛、5-羥甲基糠醛檢測(cè)的需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A/7000B型，美國(guó)安捷倫科技公司。

渦旋混合器：Vortex-2型，德國(guó)艾卡公司。

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：5810R 型，德國(guó)艾本德公司。

糠醛、5-羥甲基糠醛、糠醛-d4、5-羥甲基糠醛-13C6溶液：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯：色譜純，美國(guó)費(fèi)希爾公司。

凈化管：(1)AN50E011 型(內(nèi)置100 mg C18、50 mg 強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑及150 mg 無(wú)水MgSO4)，北京納鷗科技有限公司；(2)5982-5021 型(內(nèi)置25 mgN-丙基乙二胺、150 mg MgSO4)，5982-5321 型(內(nèi)置25 mgN-丙基乙二胺、7.5 mg 石墨化碳黑及150 mg MgSO4)，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

速溶咖啡樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；柱溫：程序升溫，初始溫度為65 ℃，保持2 min，然后以20 ℃/min 升至165 ℃，再以30 ℃/min 升至240 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流；柱流量：1.00 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源溫度：240 ℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：240 ℃；溶劑延遲時(shí)間：4.5 min。

1.3 樣品處理

先用中藥粉碎機(jī)粉碎樣品，過(guò)250 μm (60 目)篩，取0.5 g 樣品于50 mL 塑料離心管中，加入純水10 mL，漩渦混勻1 min，加入乙腈10 mL，漩渦混勻1 min，置于高速離心機(jī)上，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，吸取上層清液2.0 mL 加入凈化管中，漩渦混勻2 min，經(jīng)微孔濾膜(孔徑為0.22 μm)濾至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行GC-MS測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

通過(guò)全掃描模式獲得待測(cè)組分的保留時(shí)間和特征離子峰，以選擇離子掃描模式建立質(zhì)譜分析方法，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 糠醛類化合物色譜保留時(shí)間及特征離子

2.2 色譜柱的優(yōu)化

分 別 考 察 了HP-INNOWAX、HP-5MS、HP-35MS 等3 種不同極性的色譜柱對(duì)4 種糠醛類化合物的分離效果，使用HP-5MS、HP-35MS色譜柱分離時(shí)，4種糠醛類化合物色譜峰拖尾嚴(yán)重，使用極性強(qiáng)的HP-INNOWAX色譜柱分離時(shí)，有較高的響應(yīng)值，色譜峰形尖銳，糠醛類化合物均含有醛基，極性較強(qiáng)，故選用HP-INNOWAX色譜柱分離4種糠醛類化合物，4 種糠醛類化合物SIM 模式總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 4種糠醛類化合物SIM模式總離子流色譜圖

2.3 定量方法的確定

準(zhǔn)確稱取0.5 g 樣品，于50 mL 塑料離心管中，加入0.5 mL 10.0 μg/mL 糠醛-d4、5-羥甲基糠醛-13C6混合標(biāo)準(zhǔn)工作液以及20 μL 0.5 mg/mL的糠醛、5-羥甲基糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)使用液；另取0.5 g 樣品，于50 mL塑料離心管中，只加入20 μL 0.5 mg/mL的糠醛、5-羥甲基糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。兩組樣品均按照1.3進(jìn)行樣品處理，上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，相較于外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法測(cè)定樣品的回收率和線性相關(guān)系數(shù)更好，因此采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，其中糠醛以糠醛-d4作為內(nèi)標(biāo)，5-羥甲基糠醛以5-羥甲基糠醛-13C6作為內(nèi)標(biāo)，均為同位素內(nèi)標(biāo)。同位素內(nèi)標(biāo)是一種理想的內(nèi)標(biāo)物，具有與待測(cè)化合物極為相似的理化性質(zhì)，所以在測(cè)試過(guò)程中的提取效率，凈化過(guò)程的損失，基質(zhì)影響等基本接近，可以用來(lái)校正這些因素帶來(lái)的測(cè)試偏差，特別適用于采用質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí)的痕量殘留分析[17]。

表2 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量結(jié)果

2.4 提取溶劑的優(yōu)化

分別采用乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯進(jìn)行樣品提取，考察4 種溶劑的提取效果，4 種提取溶劑提取回收率見(jiàn)圖2。由圖2 可見(jiàn)，乙腈的提取效果最好，糠醛加標(biāo)回收率為91.0%，5-羥甲基糠醛回收率為95.8%，明顯優(yōu)于其它3 種溶劑?？啡?、5-羥甲基糠醛屬于極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，極性溶劑的提取效率較高，乙腈屬于強(qiáng)極性溶劑，此外，乙腈作為提取溶劑時(shí)，不易提取油脂類物質(zhì)，可以減少雜質(zhì)干擾[13]，故最終選用乙腈作為提取溶劑。

圖2 4種提取溶劑提取回收率

2.5 樣品凈化劑的優(yōu)化

速溶咖啡基質(zhì)比較復(fù)雜，含有色素、脂肪、蛋白質(zhì)以及糖類等化合物[18]，凈化去除這些干擾物質(zhì)，既有利于提高回收率，保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，又可以延長(zhǎng)色譜柱壽命。按照QuEChERS原則，分別選取SCX、PSA、GCB、C184種凈化劑，設(shè)計(jì)了3種組合進(jìn)行驗(yàn)證，以選取最佳的凈化劑。分別考察AN50E011、5982-5021、5982-5321 3 種凈化劑組合的凈化效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可見(jiàn)，速溶咖啡樣品使用AN50E011 凈化，糠醛加標(biāo)回收率為88.3%，5-羥甲基糠醛回收率為94.1%，回收率明顯高于其它2 種凈化劑，因此最終選擇AN50E011 作為凈化劑。

圖3 3種凈化劑提取回收率

2.6 線性關(guān)系、檢出限和定量限

用乙腈稀釋，配制7種不同濃度的糠醛、5-羥甲基糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為0.001、0.005、0.02、0.1、0.4、2.0、8.0 μg/mL，糠醛-d4、5-羥甲基糠醛-13C6為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、定量離子峰的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。

以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法的檢出限，10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法的定量限。

線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限與定量限結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 可知，各組分線性良好，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法檢出限、定量限滿足檢測(cè)需求。

表3 兩種糠醛類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選取速溶咖啡樣品分別在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果列于表4。由表4可知，糠醛、5-羥甲基糠的平均回收率為91.8%～96.8%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～6.5%(n=5)，準(zhǔn)確度和精密度良好。

表4 兩種糠醛類化合物的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)語(yǔ)

以乙腈提取，用100 mg C18、50 mg SCX、150 mg無(wú)水MgSO4凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，建立了速溶咖啡中糠醛、5-羥甲基糠醛的GC-MS 測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏可靠，為速溶咖啡中糠醛、5-羥甲基糠醛的提取和檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支撐。