劉瑞紅，潘立寧，王曉瑜，陳黎，陳滿堂，秦亞瓊，劉克建，王冰，謝復(fù)煒

（中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001）

煙草中非揮發(fā)性有機酸約占煙葉重量的10%，其種類和含量對煙氣吸味有很大影響[1-3]。非揮發(fā)有機酸不僅能與生物堿結(jié)合，調(diào)節(jié)游離態(tài)和質(zhì)子化煙堿的比例，減少口腔刺激感，改善抽吸質(zhì)量，還可以增加煙葉的脂肪和臘味，提高抽吸勁頭[4-5]，另外，研究還顯示非揮發(fā)有機酸是煙葉香型風(fēng)格研究的重要指標(biāo)之一[6-7]，因此檢測煙草中非揮發(fā)性有機酸對了解煙葉的內(nèi)在質(zhì)量、改進葉組配方和加香加料都具有重要指導(dǎo)意義。

煙草中的非揮發(fā)有機酸一般是以堿金屬鹽或有機堿鹽的形式存在，只有小部分以游離形式存在，因此其檢測一般先經(jīng)衍生化處理，再使用氣相色譜進行分離分析。硫酸甲醇衍生化-氣相色譜(GC)法由于原料易得、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確度高，已成為煙草有機酸測定常用的檢測方法[8-13]，如劉春奎等[8]通過硫酸甲醇甲酯化-GC法測定并比較了河南不同產(chǎn)區(qū)、不同等級烤煙樣品的非揮發(fā)性有機酸含量；王冰等[9]比較了加熱回流和室溫放置兩種硫酸甲醇甲酯化衍生化方法對煙草中多元酸和高級脂肪酸測定的影響；穆童等[10]用硫酸甲醇甲酯化-GC法測定并分析了煙株上、中、下3個部位煙葉樣品中的非揮發(fā)性有機酸含量變化及其與化學(xué)品質(zhì)和感官品質(zhì)指標(biāo)的關(guān)系。

甲酯化過程和萃取過程均是硫酸甲醇衍生化-GC法檢測有機酸的關(guān)鍵步驟。已有文獻(xiàn)對甲酯化過程的溫度和時間進行了研究[14-15]，但針對煙草中有機酸的甲酯化過程探討較少。另外由于甲酯化溶液中雜質(zhì)較多，通常在甲酯化溶液中加入水和二氯甲烷，充分搖勻或振蕩，進行目標(biāo)物萃取。已報道的萃取方法存在靜置時間長、分層效果差、萃取次數(shù)多、操作繁瑣等問題，萃取效果往往不理想；且硫酸甲醇甲酯化溶液呈強酸性，采用二氯甲烷萃取后仍殘留較多氫離子，進樣會導(dǎo)致氣相管路及金屬配件損耗較大?；诖?，筆者對煙草中非揮發(fā)有機酸的甲酯化過程和萃取過程關(guān)鍵影響因素進行了探索和優(yōu)化，建立了13種影響煙草吃味的非揮發(fā)性有機酸測定方法，為大批量煙葉測試工作提供一種精密度好、穩(wěn)健度高、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：6890N 型，附氫火焰離子化檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：CP2245型，德國賽多利斯集團。

恒溫水浴鍋：HH-ZK4型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

分液漏斗振蕩器：EYELA MMV-1000W 型，日本東京理化器械株式會社。

調(diào)速振蕩器：HY-8型，常州國華電器有限公司。

渦旋儀：Multi Reax型，德國海道夫公司。

乳酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，美國阿法埃莎公司。

乙二酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，德國西格瑪奧德里奇公司。

丙二酸、十四酸、十六酸、十八酸、十九酸、二十酸、己二酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99%、97%、98%、98%、98%、99%，日本東京化成工業(yè)株式會社。

丁二酸、蘋果酸、亞油酸、油酸、亞麻酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99%、99%、97%、99%，比利時Acros Organics公司。

檸檬酸、香草酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98%、99%，北京百靈威科技有限公司。

甲醇：色譜純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，德國默克公司。

二氯甲烷：色譜純，德國默克公司。

濃硫酸、氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

蒸餾水：香港屈臣氏集團。

煙葉樣品：251個，2019年從全國八大香型煙葉產(chǎn)區(qū)的80 個取樣點采集的X2F、C3F、B3F 3 種等級煙葉。

參比煙葉樣品：由上述251 個煙葉樣品均勻混制而成。

1.2 溶液制備

硫酸-甲醇溶液：采用量筒準(zhǔn)確量取3 800 mL甲醇至5 000 mL 燒杯中，量取200 mL 濃硫酸，邊攪拌邊加入，放置冷卻后，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，常溫密封放置，待用。

水相溶液：(1)Na2HPO4-NaCl 混合溶液：分別稱取90 g 十二水合磷酸氫二鈉和40 g 氯化鈉，加入1 000 mL 水，采用630 W 的功率超聲，邊超聲邊攪拌，至完全溶解。(2)Na2HPO4溶液：稱取90 g十二水合磷酸氫二鈉，加入1 000 mL 水，采用630 W 的功率超聲，邊超聲邊攪拌，至完全溶解。(3)蒸餾水：采用香港屈臣氏集團的4 L桶裝蒸餾水。

內(nèi)標(biāo)溶液：稱取1.00 g 己二酸、0.15 g 十九酸至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至45 mL，超聲溶解并放至室溫，用甲醇定容至標(biāo)線。

有機酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別稱取0.05 g 乳酸、0.7 g乙二酸、0.1 g丙二酸、0.02 g丁二酸、1.0 g蘋果酸、0.6 g檸檬酸、0.02 g香草酸、0.02 g十四酸、0.1 g十六酸、0.1 g亞油酸、0.15 g油酸、0.035 g十八酸、0.02 g 二十酸(精確至0.1 mg)于150 mL 燒杯中，加入約40 mL 甲醇超聲至完全溶解，放置室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，得到有機酸混合儲備液。依次移取上述儲備液125、250、500、1、2、5 mL于50 mL容量瓶中，用硫酸-甲醇溶液稀釋定容至標(biāo)線，搖勻，然后轉(zhuǎn)移至100 mL 平底燒瓶中，加入300 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和50 mL 硫酸-甲醇溶液，將燒瓶與冷凝管緊密連接，在80 ℃下水浴回流120 min，冷卻至室溫，得到甲酯化溶液，取5 mL 甲酯化溶液至125 mL 分液漏斗中，依次加入10 mL Na2HPO4-NaCl混合水溶液和7.5 mL二氯甲烷，于分液漏斗中振蕩器中以220 r/min 速度振蕩10 min。振蕩結(jié)束后，取下分液漏斗，靜置10 min，然后取下層溶液至盛有4.0 g無水硫酸鈉的錐形瓶中，向分液漏斗中繼續(xù)加入7.5 mL 二氯甲烷，重復(fù)萃取，合并兩次萃取液。搖動錐形瓶，使萃取液與無水硫酸鈉充分接觸，然后機械振蕩30 min，振蕩頻率為180 r/min。將萃取液過0.22 μm 有機相濾膜，得到系列濃度有機酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別用B1、B2、B3、B4、B5、B6表示。

1.3 樣品處理

硫酸甲醇甲酯化：稱取1 g 煙末樣品至100 mL平底燒瓶中，加入300 μL內(nèi)標(biāo)溶液和50 mL硫酸-甲醇溶液，將燒瓶與冷凝管緊密連接，在設(shè)定溫度下水浴回流設(shè)定時間，冷卻至室溫，得到甲酯化溶液。

提?。?1)用分液漏斗一次萃取。取5 mL 上述甲酯化溶液至125 mL分液漏斗中，依次加入10 mL水相溶液和15 mL 二氯甲烷，于分液漏斗中振蕩器中以220 r/min振蕩10 min。振蕩結(jié)束后，取下分液漏斗，靜置10 min，然后取下層溶液至盛有4.0 g 無水硫酸鈉的錐形瓶中。搖動錐形瓶，使萃取液與無水硫酸鈉充分接觸，然后以180 r/min 機械振蕩30 min。萃取液過0.22 μm有機相濾膜，進樣至氣相色譜儀中分析。(2)兩次萃取。每次加入二氯甲烷7.5 mL，合并兩次萃取液，其余步驟不變。(3)三次萃取。每次加入二氯甲烷5 mL，合并三次萃取液，其余步驟不變。(4)渦旋萃取。取5 mL甲酯化溶液至40 mL離心管中，依次加入10 mL水相溶液和15 mL二氯甲烷，于渦旋儀中以2 000 r/min 的速度渦旋10 min，取下層萃取液過0.22 μm 有機相濾膜，進樣至氣相色譜儀中分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：DB-5MS 石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；進樣模式：分流進樣，分流比為5∶1；進樣體積：1 μL；進樣口溫度：280 ℃；升溫程序：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min 升至280 ℃，保持30 min；載氣：氦氣，恒流模式，流量為1.5 mL/min；檢測器：FID；檢測器溫度：280 ℃；氫氣流量：40 mL/min；空氣流量：400 mL/min；尾吹氣：氦氣，流量為30 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

雖然氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)和氣相色譜-火焰離子化檢測器(GC-FID)均可用來測定有機酸甲酯化產(chǎn)物，而國家計量檢定規(guī)程(JJG 700—2016)[16]要求GC-FID 的定量重復(fù)性(測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)不大于3%，國家計量技術(shù)規(guī)范(JJF 1164—2006)[17]對GC-MS 測量重復(fù)性要求為不大于10%，文獻(xiàn)也表明GC-FID 的測量重復(fù)性優(yōu)于GCMS[18]，因此針對需長期測定大批量煙葉樣品并對測定結(jié)果重復(fù)性要求較高的情況，在滿足待測物質(zhì)分離度的條件下，優(yōu)先選擇GC-FID進行檢測。

有機酸甲酯化后極性降低，適合使用弱極性色譜柱進行分離，因此筆者選擇DB-5MS 石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)進行檢測。由于煙草中乳酸、香草酸、二十酸含量較低，為了滿足其測定，實驗優(yōu)化了載氣流速、升溫速率以及FID 檢測器的氫氣、空氣、尾吹氣流速及比例，在確保十三種有機酸甲酯化產(chǎn)物具有良好分離度的基礎(chǔ)上，獲得較窄的色譜峰，從而提高分析靈敏度。最終優(yōu)化的色譜條件見1.4。

圖1 為在上述優(yōu)化色譜條件下，有機酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B4和參比煙葉樣品經(jīng)硫酸-甲醇甲酯化后的二氯甲烷萃取液的GC-FID色譜圖。由圖1可知，13 種有機酸的分離效果好，色譜峰形對稱，說明優(yōu)化得到的色譜條件較為合適。

圖1 有機酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和參比煙葉樣品甲酯化產(chǎn)物的GC-FID圖

表1 無內(nèi)標(biāo)和雙內(nèi)標(biāo)校正下參比煙葉樣品目標(biāo)酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2 甲酯化過程優(yōu)化

2.2.1 甲酯化溫度

甲酯化溫度是影響煙草中游離和結(jié)合態(tài)有機酸是否衍生完全的關(guān)鍵因素。王冰等研究表明，60 ℃加熱回流2 h比室溫放置20 h甲酯化測定結(jié)果高5%～38%[9]，原因可能是煙草中結(jié)合態(tài)的酸要進一步酯化需要的反應(yīng)能量更高，但其并未進一步考察不同溫度對甲酯化的影響。筆者對比了60、70、80 ℃下加熱回流對甲酯化結(jié)果的影響。

通過觀察實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水浴溫度為60 ℃時，甲酯化溶液不沸騰，煙葉粉末沉于燒瓶底部；隨著溫度升高，甲酯化溶液沸騰狀態(tài)逐步加劇，在70 ℃水浴時，甲酯化溶液微沸，部分煙葉粉末處于流動狀態(tài)；當(dāng)水浴溫度增加至80 ℃時，甲酯化溶液處于劇烈沸騰狀態(tài)，煙葉粉末上下翻滾，甲酯化過程更加均勻。進一步增加甲酯化溫度，甲酯化溶液沸騰狀態(tài)無明顯變化，但水的蒸發(fā)損失加速，因此選擇將考察的甲酯化溫度上限設(shè)定為80 ℃。

圖2為甲酯化溫度對樣品中有機酸甲酯相對萃取率的影響（樣品編號見圖1，下同）。由圖2 可知，由于有機酸在煙草中的存在形態(tài)不同，不同有機酸全部酯化需要的反應(yīng)能量略有差異，水浴溫度由60 ℃增至80 ℃，參比煙葉樣品中乳酸等13 種有機酸酯化產(chǎn)物響應(yīng)面積增加4%～12%，因此選擇80 ℃作為水浴溫度。

圖2 甲酯化溫度對樣品中有機酸甲酯相對萃取率的影響

2.2.2 甲酯化時間

為了確保目標(biāo)有機酸完全衍生，分別設(shè)置水浴時間為60、75、90、105、120 min 進行試驗，探究水浴時間對參比煙葉樣品甲酯化結(jié)果的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，水浴120 min時，各有機酸衍生化基本完成，因此選擇甲酯化時間為120 min。

圖3 甲酯化時間對樣品中有機酸甲酯相對萃取率的影響

2.3 萃取過程優(yōu)化

2.3.1 鹽析萃取

在水中加入適量鹽產(chǎn)生的鹽析效應(yīng)不僅可提高萃取率，還可降低萃取過程中的乳化現(xiàn)象，有利于分層取樣；另外有機酸甲酯化溶液呈強酸性，即使用二氯甲烷萃取后仍殘留有氫離子，對氣相色譜儀金屬配件有腐蝕作用，因此筆者在水相中加入Na2HPO4，形成pH 緩沖體系，以減弱溶液酸性，同時提高萃取效率。圖4 為分別采用蒸餾水、Na2HPO4溶液和Na2HPO4-NaCl 混合溶液振蕩萃取甲酯化參比煙葉樣品中各有機酸甲酯的相對萃取率。由圖4 可知，加入Na2HPO4溶液與Na2HPO4-NaCl 混合溶液均能提高萃取效率，但由于Na2HPO4-NaCl混合溶液中因加入NaCl 而增大了離子濃度，鹽析效率提高，其萃取效果稍優(yōu)于Na2HPO4溶液。另外實驗觀察到加入Na2HPO4-NaCl 混合溶液進行萃取時，分層速度快、效果好，因此選用Na2HPO4-NaCl混合溶液進行鹽析萃取。

圖4 水相組成對樣品中有機酸甲酯相對萃取率的影響

2.3.2 振蕩方式

為進一步提高萃取效率，以參比煙葉樣品中有機酸甲酯化產(chǎn)物的色譜峰面積為指標(biāo)，對比了分液漏斗振蕩和渦旋振蕩兩種萃取方式的萃取效果。圖5為不同萃取次數(shù)和方式下有機酸甲酯的相對萃取率，其中分液漏斗萃取3次代表萃取完全。由圖5可知，僅萃取1 次時，乳酸、蘋果酸和香草酸的甲酯化產(chǎn)物萃取率較低，為77%～88%，其它有機酸甲酯化產(chǎn)物萃取率為88%～96%。造成這種差異的原因是乳酸、蘋果酸和香草酸甲酯化產(chǎn)物含有游離羥基，在極性溶劑中溶解度較高，不易被萃取到二氯甲烷相，檸檬酸雖然也含有羥基，但其三個羧基甲酯化后會產(chǎn)生較大位阻，與其它含羥基有機酸相比，在極性溶劑中的溶解度較低。有機酸甲酯化產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)決定了其在甲醇水和二氯甲烷兩相間的分配比，由于分配比是固定的，無論采取分液漏斗振蕩萃取還是渦旋萃取，僅萃取1次時的萃取率較低，因此為了保證萃取完全，選用分液漏斗多次振蕩萃取方式。

圖5 萃取方式對樣品中有機酸甲酯相對萃取率的影響

2.3.3 萃取次數(shù)

萃取不完全，方法的穩(wěn)健度會受到影響，而重復(fù)萃取3 次，萃取步驟耗時較長。由上述研究可知，Na2HPO4-NaCl混合溶液可以提高萃取效率，縮短萃取時間，因此在保證萃取完全的前提下，為了減少萃取次數(shù)，提高工作效率，研究了使用Na2HPO4-NaCl混合溶液萃取完全所需要的萃取次數(shù)。

圖6 為采用Na2HPO4-NaCl 混合溶液對甲酯化參比煙葉樣品分別萃取1、2、3 次的萃取率。由圖6可知，加入Na2HPO4-NaCl混合溶液萃取2次與萃取3 次的效果相當(dāng)，因此選用Na2HPO4/NaCl 混合鹽水萃取2次即可萃取完全。

圖6 萃取次數(shù)對樣品中有機酸甲酯相對萃取率的影響

2.4 線性關(guān)系與定量限

對系列濃度的甲酯化標(biāo)準(zhǔn)品檢測，以各有機酸與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比(y)對其相應(yīng)含量比(x)進行回歸分析，得到各有機酸的線性方程及其相關(guān)系數(shù)；以10 倍信噪比對應(yīng)的有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為方法的定量限。13 種有機酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限、測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及加標(biāo)回收率列于表2。由表2可知，13種目標(biāo)酸的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，定量限為0.02～0.13 mg/g。

表2 煙草中有機酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗

以參比煙葉樣品作為分析對象，重復(fù)測定10次，考察方法的精密度，精密度試驗質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果見表3。對樣品進行低、中、高3 種不同濃度水平的加標(biāo)處理，衍生化后進GC-FID分析，計算其加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。從表3、表4可知，測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～3.5%(n=10)，加標(biāo)回收率為90.6%～105.0%，說明該方法精密度、準(zhǔn)確度較好，可以滿足大批量樣品定量需求。

表3 煙草中有機酸的精密度試驗質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

表4 251個烤煙樣品檢測結(jié)果分析

表4 煙草中有機酸的加標(biāo)回收試驗質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

2.6 實際樣品分析

采用上述優(yōu)化方法分批測試了從全國八大香型煙葉產(chǎn)區(qū)采集的251 個實際煙葉樣品，每批樣品測試時均插入1個參比煙葉樣品和1個標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B4作為監(jiān)控，其中參比煙葉樣品需和每批待測實際煙葉樣品經(jīng)過相同的樣品前處理后進樣檢測，以用來監(jiān)控樣品前處理過程，而標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B4經(jīng)一次性制備好后密封備用，每批實際煙葉樣品進樣前取備用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進樣檢測，以監(jiān)控儀器狀態(tài)。表5為36天內(nèi)251個實際煙葉樣品和兩種監(jiān)控樣品中有機酸含量測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表5 可知，在實際樣品測試期間，參比煙葉監(jiān)控樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液監(jiān)控樣品中各目標(biāo)酸測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于3%，進一步說明了優(yōu)化后的方法穩(wěn)健性好，適合長時間、大批量樣品測試。而由251 個實際煙葉樣品中有機酸測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差可知，丙二酸、蘋果酸、檸檬酸在不同煙草樣品中含量差異較大，是造成卷煙香型質(zhì)量風(fēng)格差異的重要有機酸類物質(zhì)，文獻(xiàn)也表明丙二酸、蘋果酸、檸檬酸是區(qū)分濃香型煙葉和其它香型煙葉的關(guān)鍵指標(biāo)[19]；而十六酸、亞油酸、油酸+亞麻酸、十八酸和二十酸在煙葉樣品中含量差異較小，說明高級脂肪酸類物質(zhì)在不同類型煙葉樣品中含量相對穩(wěn)定。

3 結(jié)語

建立了一種簡單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定且適合大批量煙草樣品中非揮發(fā)有機酸測試的樣品處理方法。采用雙內(nèi)標(biāo)校正提高煙草中有機酸甲酯化-氣相色譜分析方法的穩(wěn)定性。在甲酯化溫度80 ℃、水浴120 min條件下，通過分液漏斗振蕩方式，利用二氯甲烷和Na2HPO4/NaCl混合鹽水溶液鹽析萃取兩次，測得的有機酸結(jié)果重復(fù)性好、精密度和回收率高，適合大批量煙葉樣品測試。