陳月，薛英茹，劉海軍，劉安妮，周衛(wèi)強(qiáng)，，楊小凡，李非，安泰，李義，4，佟毅，4

（1. 營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 100029；2. 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130； 3. 中糧生化能源（榆樹(shù)）有限公司，長(zhǎng)春 130401；4. 玉米深加工國(guó)家工程研究中心，吉林中糧生化有限公司，長(zhǎng)春 130033）

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是細(xì)菌體內(nèi)的一種聚酯，可以提供細(xì)菌內(nèi)部碳源和能源的存儲(chǔ)材料［1］，具有生物可降解性［2］、生物相容性、壓電性、氣體阻隔性能、熱塑性［3］等優(yōu)良性能，在許多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，例如塑料包裝、電器材料、藥品開(kāi)發(fā)以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等［4-6］。為了進(jìn)一步完善PHA 生產(chǎn)發(fā)酵工藝、特性研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)，需要建立準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。文獻(xiàn)報(bào)道的PHA檢測(cè)方法有重量分析法及染色法、紫外光譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、核磁共振法、流式細(xì)胞光度和熒光分光光度法及傅立葉變換紅外光譜技術(shù)［7-11］。由于氣相色譜法分析樣品速度快且需要的樣品量少，因而較多用于聚羥基丁酸脂（PHB）樣品含量測(cè)定［12］，但該法存在樣品酯化時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。

Fukai 等［13］首次發(fā)現(xiàn)在堿性較低的條件下可以將PHB解聚，繼而轉(zhuǎn)化為可以進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)的酯類物質(zhì)。Braunegg 等［14］發(fā)現(xiàn)向PHB 樣品中加入少許酸化甲醇（含硫酸）和氯仿，然后在加熱、冷卻后添加適當(dāng)?shù)恼麴s水，等待溶液分層，最后取適當(dāng)有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，可間接測(cè)定PHB。在低酸度條件下，PHB可被還原為3-羥基丁酸，而3-羥基丁酸被甲酯化后可以利用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)。在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入苯甲酸作為酯化反應(yīng)過(guò)程中的內(nèi)標(biāo)物可以提高檢測(cè)準(zhǔn)確性及靈敏度，并且因?yàn)檫@種方法應(yīng)用的樣本量較小，分析速度較快，可以分析任何類型的細(xì)胞，同時(shí)具有對(duì)PHB進(jìn)行定性和定量分析的優(yōu)點(diǎn)，在一段時(shí)間內(nèi)被廣泛應(yīng)用。各種聚合物單體的組成可以通過(guò)氣相色譜法確定，但若要對(duì)其進(jìn)行定量就必須創(chuàng)建不同單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線［15］。這種方法的缺點(diǎn)是檢測(cè)前樣品處理需要的酯化時(shí)間及檢測(cè)時(shí)間均較長(zhǎng)。

在樣品預(yù)處理步驟中，有人對(duì)酯化時(shí)間、酯化溫度等進(jìn)行了探討。如廖杏梅等[16]對(duì)PHA 纖維在不同干熱溫度與干熱時(shí)間條件下的纖維化學(xué)組分、結(jié)晶度、斷裂能力及染色性能進(jìn)行了分析研究，其中，主要是通過(guò)將自動(dòng)烘干機(jī)調(diào)制預(yù)定實(shí)驗(yàn)溫度，采取控制變量法，分別控制干熱時(shí)間與干熱溫度，再分別通過(guò)紅外光譜儀、X射線衍射儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和強(qiáng)力測(cè)試儀檢測(cè)處理前后的PHA纖維，從而得出結(jié)論：隨著溫度的升高，化學(xué)組分不發(fā)生變化，結(jié)晶尺寸逐漸增大進(jìn)而破裂，斷裂強(qiáng)力及伸長(zhǎng)率逐漸減小，有利于染色，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，主衍射的衍射強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，更易于辨別。

筆者采用正交響應(yīng)面法對(duì)氣相色譜法檢測(cè)PHA含量的樣品預(yù)處理過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)樣品的酯化時(shí)間、酯化溫度、發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度對(duì)檢測(cè)效果的影響進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

智能消解儀：6B-56型，江蘇盛奧華環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

氣相色譜檢測(cè)器：7890B型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

嗜鹽菌發(fā)酵液樣品：PHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.03%，中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司。

無(wú)水甲醇：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

濃硫酸、苯甲酸：均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

三氯甲烷：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Agilent HP-5 柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；流動(dòng)相流量：2 mL/min；壓力：69.22 kPa；載氣：高純氮?dú)?；柱箱溫度：開(kāi)啟時(shí)80 ℃，維持時(shí)間3 min，最高柱箱溫度350 ℃；空 氣 流 量：400 mL/min；氫 氣 流 量：30 mL/min；尾吹氣流量：25 mL/min；加熱器溫度：250 ℃；總流量：65 mL/min；分流比：30∶1；分流流量：60 mL/min。

1.3 酯化液配制

實(shí)驗(yàn)所用酯化液由970 mL無(wú)水甲醇、30 mL濃硫酸及1 g苯甲酸配制而成，避光密封保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

從發(fā)酵開(kāi)始，以8 h 為起點(diǎn)，每隔4 h 取一次PHA菌體樣品，直到48 h，將取出的樣品放入50 mL離心管中以5 000 r/min離心10 min，倒出上清液，加水震蕩重懸，洗滌，再次以5 000 r/min 離心10 min，將處理好的菌泥及時(shí)預(yù)凍，預(yù)凍前注意需要用保鮮膜封口、扎眼，并用橡皮筋扎牢，將其冷凍干燥約48 h 后適時(shí)取出查看是否完成冷凍，以金屬針穿刺樣品不粘附為標(biāo)準(zhǔn)。樣品凍干后按圖1所示的流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。將凍干樣品碾碎，稱取0.051 g碾碎樣品于酯化管中（酯化管預(yù)先去皮），并做好標(biāo)記，用5 mL移液槍取每管2 mL三氯甲烷溶液、2 mL酯化液（配制溶液）于酯化管中，使樣品完全溶解，然后將酯化管放入金屬浴中，于100 ℃加熱反應(yīng)3.5 h，反應(yīng)前確保酯化管擰緊不漏液，以免加熱過(guò)程中三氯甲烷溶液揮發(fā)。反應(yīng)完成后將酯化管降溫，并在每個(gè)酯化管中加入1 mL 去離子水（不要一次性開(kāi)太多管，以免揮發(fā)），用震蕩儀震蕩5 min后靜置1 h，使溶液上下分層，然后用1 mL進(jìn)樣針管取分層后的下層液1 mL過(guò)膜，進(jìn)行氣相檢測(cè)。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.5 定量原理

PHA 是一類聚合物，并不是某種單一的物質(zhì)，PHB是PHA家族中被發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的典型代表，通?？梢酝ㄟ^(guò)PHB 替代PHA 開(kāi)展研究工作［2］。PHB在濃硫酸作用下可以解聚，脫去水分子后形成巴豆酸，在配制的酯化液中也可以使巴豆酸與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)進(jìn)一步生成巴豆酸甲酯，而巴豆酸甲酯可以通過(guò)氣相色譜檢測(cè)分析得到其含量，從而推斷出PHA的含量，并且該方法可以用于純品以及菌體細(xì)胞中PHA的檢測(cè)。即：PHB+濃硫酸→巴豆酸；巴豆酸+無(wú)水甲醇→巴豆酸甲酯。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

利用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法定量，得到不同樣品預(yù)處理?xiàng)l件下樣品中PHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 過(guò)程變量的影響

根據(jù)Box-Behnken 的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度、酯化時(shí)間、酯化溫度為優(yōu)化因子，最優(yōu)區(qū)間分別設(shè)為12.25～13.25 g/L，3～4 h，90～110 ℃，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素編碼與水平見(jiàn)表1，響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)因素編碼與水平

表2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案的結(jié)果，可以得到常數(shù)項(xiàng)、線性項(xiàng)（X1、X2、X3）、交互項(xiàng)（X1X2、X1X3、X2X3）、平方項(xiàng)（X12、X22、X32）對(duì)PHA 含量檢測(cè)結(jié)果的影響，并且得到了PHA含量檢測(cè)值（響應(yīng)值X）與各影響因素的二次多項(xiàng)回歸方程模擬：

表3 是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果。由表3 中的P值可知，酯化溫度（X1）、發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度（X3）對(duì)PHA 含量測(cè)定值的影響顯著，顯著性大小為：酯化時(shí)間（X2）＜發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度（X3）＜酯化溫度（X1）。由表3 可知，該模型的F=13.07，P=0.028 9＜0.05，表明該模型在規(guī)定的回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好，并且該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.975 1，表明PHA 含量的實(shí)際值與模型的預(yù)測(cè)值擬合程度較好，校正決定系數(shù)RAdj2=0.900 5，表明模型的90.05%可以由響應(yīng)面法解釋，該模型的精密度為10.867＞4，進(jìn)一步說(shuō)明模型合理。綜上所述，該模型可以理想地分析與預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

應(yīng)用Design-expert 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，得到了各個(gè)影響因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值R的三維圖以及等高線圖，從三維圖中可以看到因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值R的復(fù)雜關(guān)系。

圖2為酯化溫度與酯化時(shí)間交互左右對(duì)PHA含量的響應(yīng)曲面。由圖2 可見(jiàn)，在以發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度12.75 g/L為中心點(diǎn)條件下，隨著酯化溫度與酯化時(shí)間在一定范圍內(nèi)的增大，PHA含量測(cè)定值不斷增大，當(dāng)酯化溫度為95～105 ℃、酯化時(shí)間為3.2～3.8 h時(shí)，PHA含量測(cè)定值較高。

圖2 酯化溫度與酯化時(shí)間交互左右對(duì)PHA含量的響應(yīng)曲面

圖3為以酯化時(shí)間3.5 h為中心點(diǎn)的酯化溫度與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對(duì)PHA 檢測(cè)含量的響應(yīng)曲面。由圖3 可見(jiàn)，隨著酯化溫度以及發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)的升高，PHA含量測(cè)定值不斷增大，當(dāng)酯化溫度為95～105 ℃，而發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度為12.25～12.85 g/L 時(shí)，PHA含量測(cè)定值較大。

圖3 酯化溫度與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對(duì)PHA檢測(cè)含量的響應(yīng)曲面

圖4為酯化時(shí)間與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對(duì)PHA 檢測(cè)含量的響應(yīng)曲面。由圖4 可見(jiàn)，在酯化溫度在中心點(diǎn)100 ℃的條件下，隨著酯化時(shí)間以及發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)的增加，當(dāng)發(fā)酵液菌體質(zhì)量濃度為12.25～12.85 g/L、酯化時(shí)間為3.2～3.6 h時(shí)，PHA含量測(cè)定值較高。

圖4 酯化時(shí)間與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對(duì)PHA檢測(cè)含量的響應(yīng)曲面

2.2 模型優(yōu)化

利用軟件優(yōu)化影響因素后，模型的最佳實(shí)驗(yàn)條件為酯化溫度103.28 ℃，酯化時(shí)間3.43 h，樣品質(zhì)量濃度為12.64 g/L，預(yù)測(cè)得到的PHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.13%。為了方便實(shí)驗(yàn)操作與儀器控制，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件：酯化溫度103 ℃，酯化時(shí)間3.4 h，樣品質(zhì)量濃度12.64 g/L。同時(shí)為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及可行性，按照優(yōu)化條件進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，得到的PHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.04%，與響應(yīng)預(yù)測(cè)值相比較，相對(duì)誤差為0.09%，證明該實(shí)驗(yàn)條件可行。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法，從發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度、酯化時(shí)間以及酯化溫度三個(gè)影響因素探究了PHA 檢測(cè)前處理的優(yōu)化，P值為0.028 9，小于0.05，R2=0.975 1，表明該模型在規(guī)定的回合區(qū)域內(nèi)擬合效果較好，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間有著很好的擬合度，最終確定酯化溫度為103 ℃，酯化時(shí)間為3.4 h，樣品質(zhì)量濃度為12.64 g/L時(shí)，檢測(cè)效果最佳。PHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)值為96.04%，與預(yù)測(cè)值誤差為0.09%。

通過(guò)研究PHA檢測(cè)前處理過(guò)程，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)適當(dāng)?shù)目刂契セ瘻囟?、酯化時(shí)間、發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度，減少PHA檢測(cè)時(shí)間損耗以及能源消耗。