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        化濁解毒活血通絡(luò)方通過調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1通路發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織抗氧化作用的機(jī)制研究※

        2022-02-01 01:36:38韓宇帆霍瑞卿李芳釗田軍彪
        河北中醫(yī) 2022年11期
        關(guān)鍵詞:尼莫地平通絡(luò)低劑量

        韓宇帆 霍瑞卿 李芳釗 孫 闊 田軍彪△

        (1.河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腦病科,河北 石家莊 050011;2.河北中醫(yī)學(xué)院2019級(jí)博士研究生,河北 石家莊 050091;3.河北中醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生,河北 石家莊 050091)

        缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率的特點(diǎn),為我國成年人群致死、致殘的首位病因[1]。研究表明,腦缺血一定時(shí)間,且在恢復(fù)血液供應(yīng)之后,大腦功能不僅難以恢復(fù),反而會(huì)出現(xiàn)更為嚴(yán)重的腦功能障礙,稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)。CIRI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,主要涉及到氧化應(yīng)激、鈣離子超載、血-腦脊液屏障的損傷、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面[2],且各個(gè)方面之間相互影響,構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。其中氧化應(yīng)激在CIRI過程中占有重要地位。研究發(fā)現(xiàn),核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)通路可通過抗氧化應(yīng)激途徑減輕CIRI,達(dá)到治療缺血性腦血管病的目的[3]。

        田軍彪教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血性腦血管病“濁毒閉阻清竅,瘀毒損傷腦絡(luò)”的病機(jī)特點(diǎn)[4]?;瘽峤舛净钛ńj(luò)方即是以此病機(jī)特點(diǎn)為基礎(chǔ)而擬定的具有化濁解毒、活血通絡(luò)之功效的中藥復(fù)方。本實(shí)驗(yàn)研究通過制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型,觀察化濁解毒活血通絡(luò)方通過Nrf2/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)通路發(fā)揮對CIRI大鼠腦組織的抗氧化作用,探討并補(bǔ)充化濁解毒活血通絡(luò)方可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,為臨床治療CIRI提供新的思路。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量250~280 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。均飼養(yǎng)在河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房清潔環(huán)境內(nèi),自由進(jìn)食及飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 化濁解毒活血通絡(luò)方藥物組成:石菖蒲15 g,地龍15 g,茯苓15 g,澤瀉6 g,黃連6 g,川芎9 g,丹參15 g,赤芍15 g,當(dāng)歸9 g,郁金15 g(顆粒劑,購自廣東一方制藥有限公司);尼莫地平片(河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠,國藥準(zhǔn)字H13022049,20 mg/片);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)G3005);4%多聚甲醛溶液(武漢谷歌生物科技有限公司,貨號(hào)LA0427);二甲苯(天津市永大化學(xué)試劑有限公司,貨號(hào)B00102602);水合氯醛(福州文萊生物科技有限公司,貨號(hào)ST1002);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào)A003-2-2);丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào)A0001-3);過氧化氫酶(CAT)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào)A007-1-1);RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)P0013E);發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司,貨號(hào)WBKLS0500);β-actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)bs-0061R);山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)ZB2301);Nrf2抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)bs-1074R);Keap1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)bs-4900R)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CM1950型冰凍切片機(jī)(德國Leica公司);CX21型數(shù)碼顯微鏡(日本Olympus公司);2720基因擴(kuò)增儀(美國ABI公司);CFX96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國BIO-RAD公司);XU027-200型烤箱(佛山市高明溫雅精密烤箱有限公司);15K型高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司);S25型電動(dòng)勻漿機(jī)(德國IKA公司);756MC型紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

        1.4 造模及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將80只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組,每組16只。除假手術(shù)組外,其余組采用Longa法制備MCAO大鼠模型。大鼠術(shù)前禁食12 h,不禁水。10%的水合氯醛(1 mL/250 g)腹腔麻醉大鼠,使大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上,消毒備皮后于頸部正中切口,分離右側(cè)肌肉、筋膜及神經(jīng),充分暴露頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)。于CCA、ICA、ECA下穿線,CCA近心端、ICA及ECA鄰近分叉處系活結(jié),ECA近頭端系2個(gè)死結(jié),CCA近心端、ICA近頭端使用微動(dòng)脈夾阻斷血流,在ECA的活結(jié)和死結(jié)之間用眼科剪小心剪出一個(gè)“V”形小口,使用鑷子將線栓從開口處插入ECA后稍系緊ECA上近分叉處活結(jié),從兩死結(jié)中間剪斷ECA并去除CCA上的動(dòng)脈夾;將線栓小心插至CCA后調(diào)轉(zhuǎn)方向提起ECA殘端將線栓送入ICA后去除ICA上的動(dòng)脈夾,緩慢沿ICA插入線栓,自分叉處起計(jì)算線栓插入約18~22 mm,當(dāng)感覺有輕微阻力時(shí)停止進(jìn)栓,于ICA近心端結(jié)扎該動(dòng)脈。消毒手術(shù)區(qū)域后用蘸有0.9%氯化鈉注射液的棉球覆蓋,缺血2 h后拔出線栓使血液恢復(fù)灌注進(jìn)入大鼠腦組織,結(jié)扎血管、消毒并縫合手術(shù)區(qū)域,形成腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組大鼠不插入線栓,僅進(jìn)行血管分離及縫合。各組大鼠于拔栓后1 h參照Zea-Longa評分法[5]對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分,1~3分的大鼠為有效模型,實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)功能評分為0分或4分、生命體征不穩(wěn)定及死亡動(dòng)物剔除,并參照隨機(jī)原則從備用組中補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。評分標(biāo)準(zhǔn)參見表1。

        表1 Zea-Longa評分法

        1.5 給藥 根據(jù)動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量計(jì)量折算系數(shù)表計(jì)算出各組的給藥劑量為:化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組25 g/(kg·d)、低劑量組6.25 g/(kg·d)、尼莫地平組9.375 mg/(kg·d),各組灌胃容積2 mL;假手術(shù)組和模型組則以0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃。每日灌胃1次,連續(xù)3 d。

        1.6 觀察指標(biāo)及方法

        1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分 灌胃3 d后,采用大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)[6]評估各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況。mNSS總分值為18分,0~6分為輕度損傷,7~12分為中度損傷,13~18分為重度損傷。

        1.6.2 腦梗死體積測定 mNSS評估后,每組隨機(jī)選取3只大鼠麻醉斷頭處死,3 min內(nèi)取出全腦,將腦組織置于-20 ℃冰箱中冷凍10 min后取出,于腦槽中自額極至枕極行冠狀切片,連續(xù)切取5片,每片厚2 mm。將切片立即置于2% TTC磷酸緩沖液中,37 ℃避光恒溫孵育30 min。染色后正常腦組織呈深紅色,梗死部分腦組織呈白色。將染色后的腦組織切片置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h拍照,應(yīng)用Image J軟件計(jì)算腦梗死體積。計(jì)算公式:腦梗死體積百分比=(腦梗死部分體積/整個(gè)腦組織體積)×100%。

        1.6.3 腦組織病理學(xué)觀察 每組隨機(jī)選取3只大鼠麻醉處死,取梗死側(cè)腦組織,橫向切取約5 mm厚度,放置于4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋后進(jìn)行切片,切片常規(guī)使用二甲苯脫蠟,經(jīng)HE染色后于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織的病理改變。

        1.6.4 腦組織含水量測定 每組隨機(jī)選取3只大鼠麻醉處死,剝?nèi)∧X組織,去除小腦、嗅球,用吸水紙將腦組織吸干并稱質(zhì)量為濕質(zhì)量(W1),恒溫95 ℃于烤箱烘烤24 h至恒重后為干質(zhì)量(W2),腦組織含水量(%)=[(W1-W2)/W1]×100%。

        1.6.5 腦組織MDA含量及SOD、CAT活性檢測 每組選取7只大鼠麻醉處死,取梗死側(cè)腦組織100 mg,研磨制備成10%組織勻漿,4 ℃下3000 r/min離心10 min,取上清液。分別按試劑盒說明書測定MDA含量及SOD、CAT活性。

        1.6.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測腦組織Nrf2、Keap1蛋白表達(dá) 每組取3只大鼠梗死側(cè)腦組織(1.6.5中大鼠腦組織)300 mg,剪碎后于液氮中研磨至細(xì)粉末狀,分裝于離心管中,加入RIPA裂解液,充分混勻,4℃,12 000 r/min離心5 min,取上清液,使用Bradford法測定蛋白質(zhì)的濃度。配制分離膠及濃縮膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,將NC膜放入封閉液中于室溫下緩慢搖動(dòng)封閉2 h;加入一抗(1∶250稀釋)4 ℃孵育過夜;洗膜3次后加入二抗(1∶6500稀釋)室溫孵育90 min;使用發(fā)光試劑反應(yīng)后充分洗膜,觀察蛋白條帶并拍照,使用Quantity one軟件分析測定各目的蛋白的表達(dá)量,以目的蛋白質(zhì)表達(dá)量與內(nèi)參β-actin灰度值的比值分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

        1.6.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測腦組織Nrf2、Keap1 mRNA表達(dá) 取7只大鼠腦組織梗死側(cè)(1.6.5中大鼠腦組織)約10 mg,液氮研磨后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管,加入0.3 mL RNA裂解液提取總RNA,按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Real-time PCR反應(yīng)應(yīng)用兩步法反應(yīng)程序,預(yù)變性95 ℃ 10 min,然后44個(gè)循環(huán)反應(yīng):95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s。擴(kuò)增完畢后,得到各樣本各目的基因及內(nèi)參基因β-actin的Cq值。目的基因Cq值-內(nèi)參基因β-actin的Cq值=ΔCq,按照公式Q=2-ΔCq,得到每個(gè)目的基因的Q值及Q均值,再以每個(gè)目的基因的Q值/Q均值,即各目的基因表達(dá)的相對定量值(RQ值),RQ值用于最終的統(tǒng)計(jì)分析。引物序列見表2。

        表2 Real-time PCR引物序列

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠mNSS比較 與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組mNSS均升高(P<0.05);與模型組比較,尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組mNSS均降低(P<0.05);與尼莫地平組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組mNSS均升高(P<0.05);與化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組mNSS升高(P<0.05)。見表3。

        表3 各組大鼠mNSS比較 分,

        2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術(shù)未見明顯腦梗死灶,其余組腦組織均見白色梗死灶。與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦梗死體積均升高(P<0.05);與模型組比較,尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦梗死體積均降低(P<0.05);與尼莫地平組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦梗死體積均升高(P<0.05);與化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組腦梗死體積升高(P<0.05)。見表4,圖1。

        表4 各組大鼠腦梗死體積比較

        圖1 各組大鼠腦組織腦梗死體積比較(TTC染色)

        2.3 各組大鼠腦組織病理學(xué)改變 光鏡下可見假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞密集,排列整齊,胞漿豐富,染色均勻,胞核居中,核仁清楚,未見明顯異常;模型組缺血區(qū)腦組織神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,水腫明顯,胞漿染色變淡,出現(xiàn)核固縮、碎裂、溶解現(xiàn)象。與模型組比較,尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組缺血壞死區(qū)有所減少,細(xì)胞排列紊亂、水腫、胞漿淡染色變淡、細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解現(xiàn)象均有減輕。尼莫地平組、化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組缺血壞死區(qū)減少更為明顯。見圖2。

        圖2 各組大鼠腦組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)(HE染色,×400)

        2.4 各組大鼠腦組織含水量比較 與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦組織含水量均升高(P<0.05);與模型組、化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組腦組織含水量均升高(P<0.05);與尼莫地平組、化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組腦組織含水量均升高(P<0.05)。尼莫地平組與化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組腦組織含水量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

        表5 各組大鼠腦組織含水量比較

        2.5 各組大鼠腦組織MDA含量及SOD、CAT活性比較 與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦組織MDA含量均升高(P<0.05),SOD、CAT活性均降低(P<0.05);與模型組比較,尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦組織MDA含量均降低(P<0.05),SOD、CAT活性均增高(P<0.05);與尼莫地平組、化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組腦組織MDA含量均升高(P<0.05),SOD、CAT活性均降低(P<0.05)。尼莫地平組與化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組腦組織MDA含量及SOD、CAT活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

        表6 各組大鼠腦組織MDA含量及SOD、CAT活性比較

        2.6 各組大鼠腦組織Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦組織Nrf2蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05),Keap1蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05);與模型組比較,尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦組織Nrf2蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05),Keap1蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05);與尼莫地平組、化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組腦組織Nrf2蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05),Keap1蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。尼莫地平組與化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組腦組織Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7,圖3。

        表7 各組大鼠腦組織Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)比較

        圖3 各組大鼠腦組織Nrf2、Keap1蛋白條帶圖

        2.7 各組大鼠腦組織Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組、尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦組織Nrf2 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05),Keap1 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05);與模型組比較,尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組腦組織Nrf2 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05),Keap1 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05);與尼莫地平組、化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組比較,化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組腦組織Nrf2 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05),Keap1 mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)。尼莫地平組與化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組腦組織Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表8。

        表8 各組大鼠腦組織Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA表達(dá)比較

        3 討論

        缺血性腦血管病為當(dāng)前我國成年人致死致殘的首位病因,其發(fā)病率呈爆發(fā)式的增長[7]。及時(shí)恢復(fù)大腦血液供應(yīng)對缺血性腦血管病患者的治療有著極為重要的意義。目前,針對缺血性腦血管病的治療方案主要包括血管內(nèi)取栓治療、溶栓治療、頸內(nèi)動(dòng)脈支架成形術(shù)、抗凝抗血小板聚集及神經(jīng)保護(hù)藥物治療等[8-9]。這些治療手段的目的均是為了改善腦血管狀況,恢復(fù)大腦的供血及供氧。但腦缺血后再灌注除了可以恢復(fù)大腦功能外,也給大腦帶來了新的損傷,因此,在快速恢復(fù)腦組織缺血缺氧狀況的同時(shí)減輕腦缺血再灌注帶來的損傷亦是本病治療的關(guān)鍵。由于CIRI復(fù)雜的病理機(jī)制及對其研究方法的局限,目前尚未找到行之有效的治療方法[10],探討對CIRI的治療方案已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。中醫(yī)藥具有多方向、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)小等諸多優(yōu)點(diǎn),因此探索能夠減輕CIRI且具有神經(jīng)保護(hù)作用的中醫(yī)藥方案對臨床治療缺血性腦血管病具有重要的價(jià)值。

        氧化應(yīng)激為CIRI機(jī)制研究中的熱點(diǎn)[11],其不僅可以直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死從而造成神經(jīng)元死亡,而且可以通過影響細(xì)胞的基因調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬、炎性反應(yīng)等多個(gè)方面對機(jī)體造成損害。當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時(shí),體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(ROS)的大量蓄積超出機(jī)體的清除能力,從而對機(jī)體造成損害的過程被稱為氧化應(yīng)激[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),Nrf2/Keap1通路是細(xì)胞重要的內(nèi)源性抗氧化通路,可通過激活該通路減輕CIRI[14]。Nrf2是一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的因子,屬于Cap-n-Collar(CNC)調(diào)節(jié)蛋白家族,Keap1為Nrf2的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[15]。正常生理情況下Nrf2與Keap1偶聯(lián)形成二聚體,與肌動(dòng)蛋白結(jié)合以低表達(dá)水平存在于細(xì)胞胞漿中,當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí),ROS通過修飾Keap1的半胱氨酸殘基使其構(gòu)象發(fā)生改變,使二者發(fā)生解離。與Keap1解離后的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,激活下游靶基因表達(dá),調(diào)控Ⅱ相代謝酶、抗氧化酶等基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化損傷的作用,減輕CIRI[16-17]。機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶如SOD、CAT等均通過該通路表達(dá)[18]。正常生理情況下,SOD可催化超氧陰離子生成H2O2,再經(jīng)過CAT及其他抗氧化酶的作用生成H2O和O2,從而減輕氧化損傷,其活性的高低可代表機(jī)體清除自由基的能力。

        CIRI屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇,以“風(fēng)、火、痰、瘀”為主要病理因素。現(xiàn)代人們因嗜食肥甘厚味、作息紊亂、酗酒抽煙等諸多不良生活習(xí)慣易形成痰濁體質(zhì),痰濁阻滯脈絡(luò)日久而成瘀,瘀血與痰濁共同損傷腦絡(luò)則發(fā)為中風(fēng)。田軍彪教授認(rèn)為,“濁毒閉阻清竅,瘀毒損傷腦絡(luò)”為CIRI的基本病機(jī),結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)擬定化濁解毒活血通絡(luò)方。方中石菖蒲開竅豁痰,醒神益智,黃連清熱解毒,郁金活血行氣,三藥化濁解毒,祛瘀通絡(luò),共為君藥;地龍性寒,味咸,長于通行經(jīng)絡(luò),具有清熱通絡(luò)之效,茯苓、澤瀉健脾利水,化濁降脂,三藥合用共為臣藥;佐以赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎活血祛瘀;川芎素有“血中氣藥”之稱,可引諸藥上行于頭目,亦作使藥之用。全方以豁痰開竅、化濁解毒、活血祛瘀藥物為主,佐以行氣通絡(luò)的中藥,共奏化濁解毒、活血通絡(luò)之功。現(xiàn)代藥理研究顯示,當(dāng)歸多糖作為當(dāng)歸的水溶性活性物質(zhì)之一,可減少模型組大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平[19];黃連提取物主要成分小檗堿可通過抑制核因子κB/Nod樣受體Pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白信號(hào)軸相關(guān)靶點(diǎn)從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及抑制炎性反應(yīng),達(dá)到對CIRI大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[20];川芎中川芎嗪通過激活Nrf2/ARE通路,促使Ⅱ相酶血紅素加氧酶-1(HO-1)釋放,發(fā)揮清除自由基抗氧化作用[21];靜脈注射芍藥苷可通過增加全腦缺血模型大鼠腦組織中SOD含量、降低MDA含量減輕腦缺血對大鼠腦組織產(chǎn)生的氧化應(yīng)激影響[22];丹參酮ⅡA可通過降低MCAO大鼠模型腦組織中MDA、一氧化氮(NO)的含量及提高SOD活性,從而起到抗自由基損傷的作用[23]。

        本實(shí)驗(yàn)從氧化應(yīng)激方面探討化濁解毒活血通絡(luò)方對MCAO模型大鼠抗CIRI的作用,與其對照的尼莫地平被證明可以通過降低CIRI大鼠腦組織中NO和MDA的含量及增加SOD活性對大鼠起到腦保護(hù)作用[24]。脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)過氧化后產(chǎn)生的過氧化物會(huì)對機(jī)體造成損傷,MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,其含量的高低可以反映機(jī)體氧化損傷的程度[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠mNSS、腦組織梗死體積及腦組織含水量均高于假手術(shù)組大鼠(P<0.05),提示造模成功;與模型組大鼠比較,化濁解毒通絡(luò)方高、低劑量組及尼莫地平組大鼠腦組織MDA含量和mNSS均降低(P<0.05),腦組織水腫均明顯減輕(P<0.05),腦梗死體積降低(P<0.05),提示化濁解毒活血通絡(luò)方具有較好的抗氧化應(yīng)激損傷的作用;尼莫地平組及化濁解毒活血通絡(luò)方高、低劑量組大鼠均較模型組大鼠腦組織Nrf2蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平均升高(P<0.05),Keap1蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平均降低(P<0.05),Nrf2/Keap1通路下游抗氧化酶SOD、CAT活性明顯升高(P<0.05),表明化濁解毒活血通絡(luò)方可通過調(diào)控Nrf2/Keap1通路激活下游抗氧化酶系統(tǒng),從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對腦組織的損傷。另外,在本實(shí)驗(yàn)中化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組較化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組在降低MDA含量、增加SOD、CAT活性及調(diào)節(jié)Nrf2、Keap1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)方面的效果更優(yōu)(P<0.05),與尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示化濁解毒活血通絡(luò)方藥物濃度對激活Nrf2/Keap1通路,改善氧化應(yīng)激狀態(tài)的效果具有一定影響,但最佳治療濃度及其與西藥治療效果相比是否存在優(yōu)勢尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

        綜上所述,化濁解毒活血通絡(luò)方可減輕MCAO模型大鼠腦組織水腫,降低腦梗死體積,改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。本方的作用機(jī)制可能與其通過調(diào)控Nrf2/Keap1通路激活下游抗氧化酶體系,升高抗氧化酶含量,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對機(jī)體的損傷作用有關(guān)。

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