項 爍 張 弛

·論 著·

小干擾RNA修飾BMSCs分泌的外泌體對CCI動物模型修復(fù)的促進(jìn)作用研究

項 爍 張 弛

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院（金華市中心醫(yī)院）康復(fù)科，浙江金華 321000

探討Piezo2沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）來源外泌體修復(fù)慢性壓迫性神經(jīng)損傷（chronic constriction injury，CCI）動物模型的相關(guān)作用。以成熟的大鼠為實驗對象，提取大鼠的骨髓組織培養(yǎng)原代BMSC，超速離心法提取Piezo2基因siRNA沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC來源外泌體，用手術(shù)方案構(gòu)建CCI動物模型，根據(jù)實驗?zāi)康膶⑷虢M的SD大鼠分成模型組、BMSC組和外泌體組，利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫熒光染色法檢測Piezo2、NeuN、IbA1和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的mRNA相對表達(dá)量。原代BMSC的CD29、CD90和CD105蛋白呈陽性，而CD45、CD34和CD11b呈陰性。而外泌體組動物（dorsal root ganglion，DRG）組織中脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活明顯弱于模型組和BMSC組。外泌體組Piezo2的mRNA相對表達(dá)量明顯低于BMSC組和模型組（<0.05），外泌體組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達(dá)量明顯高于BMSC組（<0.05）。Piezo2沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC來源外泌體可以促進(jìn)CCI的修復(fù)，值得進(jìn)一步推廣。

Piezo2；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；外泌體；慢性壓迫性神經(jīng)損傷

慢性壓迫性神經(jīng)損傷（chronic constriction njury，CCI）是臨床的常見病、多發(fā)病，多見于各種慢性損傷性疾病[1,2]。Piezo2蛋白是目前的“明星分子”，研究發(fā)現(xiàn)，Piezo2蛋白表達(dá)量與本體感覺、痛覺和腫瘤相關(guān)痛覺有關(guān)[3,4]。Piezo2蛋白可分布于皮膚中，感受體外壓力的變化，也可分布于肺上皮組織中，與呼吸功能相關(guān)，也可分布于血管內(nèi)皮中，與血液流動、血壓的變化密切相關(guān)[5,6]。本研究中，以Piezo2作為研究切入點，探討siRNA-Piezo2沉默質(zhì)粒對CCI動物模型的修復(fù)作用，以期為臨床上慢性壓迫性神經(jīng)損傷的患者提供新的治療方案和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和實驗細(xì)胞

實驗動物選擇12只SPF級SD大鼠，周齡（5.36±1.43）周，體質(zhì)量（349±55）g，購自浙江省中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK（浙）2021-1010]；飼養(yǎng)于金華市實驗動物中心內(nèi)[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021- 0024]。實驗開始前于（22±2）℃、50%～60%濕度、12h明暗交替的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由飲水進(jìn)食。實驗細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），取自大鼠股骨側(cè)的骨髓組織，采用原代培養(yǎng)法。本研究方案獲得金華市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[（倫理審批號：（研）2021-109-47）]。

1.2 BMSC的提取和鑒定

以成熟的SD大鼠為實驗對象，采用腹腔注射3%水合氯醛0.4ml/kg行麻醉，然后骨髓穿刺針提取后腿大腿骨內(nèi)骨髓組織，采用差速培養(yǎng)法培養(yǎng)原代細(xì)胞，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)原代BMSC細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀方法鑒定原代BMSC細(xì)胞定。

1.3 Piezo2基因siRNA沉默質(zhì)粒的構(gòu)建和慢病毒轉(zhuǎn)染

Piezo2基因siRNA沉默質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染委托上海吉瑪生物試劑有限公司完成，利用慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC，倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染率。

1.4 Piezo2基因siRNA沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs的外泌體的提取和鑒定

采用超速離心法收集細(xì)胞的外泌體。利用透射電子顯微鏡法檢測外泌體的囊泡結(jié)構(gòu)和直徑鑒定外泌體，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測外泌體的分子標(biāo)志物CD63、CD9和CD81的表達(dá)鑒定。

1.5 CCI動物模型的構(gòu)建

構(gòu)建CCI動物模型，以SD大鼠為研究對象，腹腔注射3%水合氯醛進(jìn)行麻醉，采用下肢大腿背側(cè)入路，鈍性分離股二頭肌，充分暴露坐骨神經(jīng)主干，通過利用羊腸線環(huán)扎坐骨神經(jīng)的方法構(gòu)建CCI動物模型，碘伏消毒后逐層縫合切口。

1.6 CCI動物模型構(gòu)建成功的檢測

采用行為學(xué)的觀察方法對CCI動物模型是否成功進(jìn)行檢測，術(shù)后2周每隔1～2d觀察大鼠的步態(tài)和左后肢的姿勢、局部皮膚及肌肉張力的改變程度、是否存在舔咬肢體現(xiàn)象等。大鼠術(shù)后1～2周內(nèi)，下肢行走無力，左側(cè)足趾并攏輕度外翻，經(jīng)常懸空不敢著地；站立時以右后肢持重，左后肢抬起并緊貼腹部；術(shù)后2周，左后肢出現(xiàn)較明顯的肌肉萎縮，說明CCI動物模型構(gòu)建成功。

1.7 實驗動物分組

將入組的SD大鼠分成模型組、BMSC組和外泌體組，每組SD大鼠各5只。模型組SD大鼠均采用手術(shù)方案構(gòu)建CCI動物模型，BMSC組SD大鼠構(gòu)建CCI動物模型后，局部注射BMSC細(xì)胞，劑量5×105個/ml，注射量0.5ml，3次/周；外泌體組D大鼠構(gòu)建CCI動物模型后，局部注射外泌體0.5ml，3次/周。

1.8 免疫熒光檢測

所有實驗動物處理4周后，無痛苦處死后，收集背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）組織，制成蠟塊，冰凍切片機(jī)處理后，取出切片，用PBS沖洗后，10%山羊血清常溫封閉30min，加入神經(jīng)元特異核蛋白（neuronal nuclei antigen，NeuN），離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）一抗，4℃冰箱濕盒孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5min，避光條件下加入二抗IgG-FITC，室溫孵育30min，棄掉二抗溶液后，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚[2-(4-Amidinophenyl)-6- indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI）]DAPI試劑，避光孵育5min，PBS清洗3次，每次5min，加入防淬滅劑后，加入蓋玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.9 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測目的基因的mRNA相對表達(dá)量

利用Trizol法提取上述3組DRG組織中的總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。采用熒光定量PCR試劑盒分析上述各組DRG組織中的DNA樣本，采用2-△△CT法進(jìn)行分析。引物設(shè)計由上海生工公司設(shè)計并檢測合格。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BMSC的培養(yǎng)和鑒定

原代BMSC呈鋪路石樣分布，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD29、CD90和CD105呈陽性，而CD45、CD34和CD11b呈陰性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSC，可作為種子細(xì)胞存在，見圖1。

2.2 慢病毒介導(dǎo)siRNA-Piezo2沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC結(jié)果

慢病毒可將siRNA-Piezo2沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC，轉(zhuǎn)染成功后細(xì)胞即可檢測到綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率=熒光視野下細(xì)胞數(shù)/白光視野下細(xì)胞數(shù)×100%，結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)siRNA-Piezo2沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC轉(zhuǎn)染效率為（75.33±6.13）%。

2.3 BMSCs來源外泌體的鑒定結(jié)果

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，BMSCs來源外泌體為杯口狀結(jié)構(gòu)見圖2A，蛋白質(zhì)印跡法可以檢測到外泌體的分子標(biāo)志物CD63、CD9和CD81的表達(dá)見圖2B，外泌體直徑150～180nm，見圖2C。

圖1 BMSC的流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

圖2 BMSCs來源外泌體的鑒定結(jié)果

A.外泌體的囊泡結(jié)構(gòu)（透射電子顯微鏡，×800）；B.免疫蛋白印跡法檢測外泌體的CD63、TSG101表達(dá)；C.外泌體的囊泡直徑在100nm附近

2.4 免疫熒光染色結(jié)果顯示脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用

CCI模型組動物DRG組織中脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛激活，BMSC組動物DRG組織中脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活明顯弱于模型組，而外泌體組動物DRG組織中脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活明顯弱于模型組和BMSC組，鎮(zhèn)痛效果較好，見圖3。

2.5 外泌體組SD大鼠DRG組織中Piezo2、NeuN、IbA1和GFAP的表達(dá)

Peizo2蛋白與IbA1蛋白的染色合并后呈棕色，在DRG組織中的表達(dá)部位重合度較高。而Peizo2蛋白與NeuN蛋白和GFAP蛋白的染色合并圖層界限較為清楚，表達(dá)部位重合度較低，見圖4。

圖3 免疫熒光染色結(jié)果顯示脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用（倒置熒光顯微鏡，×100）

注：綠色熒光代表脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，綠色熒光越多說明激活的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞越多，表示疼痛越劇烈

圖4 外泌體組SD大鼠DRG組織中Piezo2、NeuN、IbA1和GFAP的表達(dá)（倒置熒光顯微鏡，×100）

2.6 RT-PCR檢測結(jié)果

各組SD大鼠DRG組織中Piezo2、NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達(dá)量結(jié)果顯示，模型組和BMSC組中Piezo2的mRNA相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（>0.05）。BMSC組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達(dá)量明顯高于模型組（<0.05），外泌體組Piezo2的mRNA相對表達(dá)量明顯低于BMSC組和模型組（<0.05），外泌體組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達(dá)量明顯高于BMSC組（<0.05），見表1。

3 討論

CCI是臨床上的常見病、多發(fā)病，多見于腰椎間盤突出癥[7,8]。干細(xì)胞為有效的治療方案，有研究認(rèn)為，干細(xì)胞對于CCI具有一定的修復(fù)作用[9,10]。但是干細(xì)胞的分化方向不定，療效不確定，因此，如何尋找更加的治療方案是目前研究的重點和熱點問題。

新型機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo2在多種生理過程中發(fā)揮作用，如機(jī)械痛、排尿、呼吸、血壓、骨骼重塑等[11,12]。Piezo2主要與觸覺、本體覺、內(nèi)臟覺機(jī)械力感知相關(guān)，因此，在神經(jīng)感知和修復(fù)方面具有較大的潛力。研究證明，Piezo2蛋白有利于保持血壓穩(wěn)定，可能對于開發(fā)治療心力衰竭的新藥物具有一定的作用[13]。也有研究認(rèn)為Piezo2與觸摸超敏痛密切相關(guān)，且Piezo2的表達(dá)集中在外周感覺神經(jīng)元，因此，在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)方面，Piezo2蛋白具有較大的潛力[14]，因此，本研究通過探討Piezo2在CCI動物模型中的修復(fù)作用，以期為臨床上CCI患者的治療提供思路。

表1 RT-PCR檢測結(jié)果（）

干細(xì)胞在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域方面的探討較多，多利用干細(xì)胞的多向分化潛能和種子細(xì)胞特性，在一定程度上彌補了神經(jīng)細(xì)胞的壞死，起到一定的恢復(fù)作用。但是由于干細(xì)胞的分化方向不定，增殖能力欠缺，因此，在干細(xì)胞針對神經(jīng)組織的修復(fù)無法達(dá)到預(yù)期的效果。為了進(jìn)一步優(yōu)化種子細(xì)胞的作用，對干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾是當(dāng)前研究的熱點問題。李文凱等[15]將嘌呤受體P2Y2的siRNA沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果證明，嘌呤受體P2Y2的siRNA沉默質(zhì)粒可以促進(jìn)BMSC的分化，對于增強(qiáng)BMSC的分化潛能具有十分重要的作用。本研究中利用siRNA-Piezo2沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC，以期對BMSC的成神經(jīng)細(xì)胞分化中起到一定作用。

外泌體是近幾年較熱門的領(lǐng)域，相較于干細(xì)胞，外泌體可以獨自攜帶遺傳信息，發(fā)揮持久的誘導(dǎo)作用，其優(yōu)點是可以擺脫細(xì)胞的死亡周期，提高誘導(dǎo)基因分子的濃度。潘韻芝等[16]將ANXA2基因過表達(dá)處理，然后通過慢病毒轉(zhuǎn)染腫瘤干細(xì)胞，觀察其對肝癌的增殖和凋亡等生物學(xué)行為的影響，結(jié)果證明，利用基因修飾工具調(diào)控某一基因的表達(dá)可以起到一定的作用。因此，本研究利用siRNA質(zhì)粒構(gòu)建Piezo2的沉默質(zhì)粒，通過慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC，然后利用CCI動物模型進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，CCI模型組動物DRG組織中脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛激活，說明疼痛較劇烈，BMSC組動物DRG組織中脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活明顯弱于模型組，而外泌體組動物DRG組織中脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活明顯弱于模型組和BMSC組，說明鎮(zhèn)痛效果較好，分析其原因，考慮可能與Piezo2的siRNA質(zhì)?？梢哉T導(dǎo)BMSC的成神經(jīng)細(xì)胞分化有關(guān)。

本研究利用RT-PCR和免疫熒光染色對CCI動物模型DRG組織中的修復(fù)作用，檢測NeuN、IbA1和GFAP的表達(dá)，結(jié)果表明，外泌體組NeuN、IbA1和GFAP的mRNA相對表達(dá)量明顯高于BMSC組（<0.05），結(jié)果說明，外泌體的NeuN、IbA1和GFAP的相對表達(dá)量明顯增加，進(jìn)一步說明siRNA- Piezo2轉(zhuǎn)染BMSC后可以促進(jìn)其對CCI動物模型的修復(fù)作用。

綜上，Piezo2沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC來源外泌體可以促進(jìn)CCI的修復(fù)，值得進(jìn)一步推廣。

[1] 胡安全, 王正安, 秦力, 等. 定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)作用及生物力學(xué)評價[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2021, 59(15): 6-9.

[2] Medeiros P, Dos Santos IR, Júnior IM, et al. An adapted chronic constriction injury of the sciatic nerve produces sensory, affective, and cognitive impairments: A peripheral mononeuropathy model for the study of comorbid neuropsychiatric disorders associated with neuropathic pain in rats[J]. Pain Med, 2021, 22(2): 338-351.

[3] Ranade SS, Woo SH, Dubin AE, et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice[J]. Nature, 2014, 516(7529): 121-125.

[4] Handler A, Ginty DD. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation[J]. Nat Rev Neurosci, 2021, 22(9): 521-537.

[5] Huang Z, Sun Z, Zhang X, et al. Loss of stretch- activated channels, PIEZOs, accelerates non-small cell lung cancer progression and cell migration[J]. Biosci Rep, 2019, 39(3): 1679-1683.

[6] Anderson EO, Schneider ER, Bagriantsev SN. Piezo2 in cutaneous and proprioceptive mechanotransduction in vertebrates[J]. Curr Top Membr, 2017, 79(3): 197-217.

[7] Sun J, Li JY, Zhang LQ, et al. Nrf2 Activation attenuates chronic constriction injury-induced neuropathic pain via induction of PGC-1α-mediated mitochondrial biogenesis in the spinal cord[J]. Oxid Med Cell Longev, 2021, 168(88): 115-127.

[8] Chu LW, Cheng KI, Chen JY, et al. Loganin prevents chronic constriction injury-provoked neuropathic pain by reducing TNF-α/IL-1β-mediated NF-κB activation and schwann cell demyelination[J]. Phytomedicine, 2020, 67(45): 153-166.

[9] 路曉淼, 姜晟, 李孝亮, 等. 神經(jīng)生長因子對兔牙髓干細(xì)胞體外增殖, 成骨分化影響的實驗研究[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2021, 46(1): 4-7.

[10] 朱雪芬, 黃成, 丁健, 等. 膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向功能性神經(jīng)元分化的機(jī)制[J]. 中國組織工程研究, 2021, 25(7): 7-13.

[11] Song Y, Li D, Farrelly O, et al. The mechanosensitive ion channel piezo inhibits axon regeneration[J]. Neuron, 2019, 102(2): 373-389.

[12] Coste B, Houge G, Murray MF, et al. Gain-of-function mutations in the mechanically activated ion channel PIEZO2cause a subtype of distal arthrogryposis[J]. PNAS, 2013, 110(12): 4667.

[13] Wang J, Hamill OP. Piezo2-peripheral baroreceptor channel expressed in select neurons of the mouse brain: A putative mechanism for synchronizing neural networks by transducing intracranial pressure pulses[J]. J Integr Neurosci, 2021, 20(4): 825-837.

[14] Zeng WZ, Marshall KL, Min S, et al. PIEZOs mediate neuronal sensing of blood pressure and the baroreceptor reflex[J]. Science, 2018, 362(6413): 464-467.

[15] 李文凱, 張英馳, 楊勇, 等. 嘌呤受體P2Y2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成脂分化中的作用[J]. 中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志, 2021, 14(1): 8-11.

[16] 潘韻芝, 馬賽, 曹凱悅, 等. 高表達(dá)ANXA2肝癌干細(xì)胞外泌體對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性的調(diào)控作用[J]. 中國腫瘤, 2019, 11(4): 7-12.

Effect of small interfering RNA modified exosomes secreted by BMSCs on the repair of CCI animal model

Department of Rehabilitation, Jinhua Hospital affiliated to Zhejiang University Medical College (Jinhua Municipal Central Hospital), Zhejiang, Jinhua 321000, China

To explore the related role of the secrete derived from bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) transfected with Piezo2 silencing plasmid in repairing the animal model of chronic compression injury (CCI).The mature SD rats were taken as the experimental object. The bone marrow tissue of SD rats was extracted and the primary BMSC was cultured. Extraction of BMSC derived exosomes transfected with Piezo2 gene siRNA silencing plasmid by ultracentrifugation. The CCI animal model was constructed by surgical scheme. According to the experimental purpose, the SD rats were divided into model group, BMSC group and exosomes group. The relative mRNA expressions of Piezo2, NeuN, Iba1 and GFAP were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunofluorescence staining.The primary BMSCs were positive for CD29, CD90 and CD105 proteins, but negative for CD45, CD34 and CD11b. The activation of spinal dorsal horn microglia in the DRG tissue of animals in the BMSC group was significantly weaker than that in the model group, while the activation of spinal dorsal horn microglia in the DRG tissue of animals in the exosome group was significantly weaker than that in the model group and BMSC group, indicating that the analgesic effect was better. The relative expression of Piezo2 mRNA in exosome group was significantly lower than that in BMSC group and model group (<0.05), and the relative expression of NeuN, Iba1 and GFAP mRNA in exosome group was significantly higher than that in BMSC group (<0.05).Transfection of BMSC derived exosomes with piezo2 silencing plasmid can promote the repair of chronic compression injury (CCI), which is worthy of further promotion.

Piezo2; Bone marrow mesenchymal stem cells; Exosomes; Chronic compressive nerve injury

R644

A

1673-9701(2022)36-0001-05

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2020KY343）

項爍，電子信箱：Professorllii@163.com

（2022–05–22）

（2022–09–26）