沈倩，張思平，劉瑞華，劉紹東，陳靜，葛常偉，馬慧娟，趙新華，楊國正，宋美珍，龐朝友

棉花出苗期耐冷綜合評價體系的構(gòu)建及耐冷指標(biāo)篩選

沈倩1, 2，張思平1，劉瑞華1，劉紹東1，陳靜1，葛常偉1，馬慧娟1，趙新華1，楊國正2，宋美珍1，龐朝友

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽 455000；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

【目的】綜合評價棉花品種（系）出苗期耐冷性，建立可靠評價模型，篩選鑒定指標(biāo)，為耐冷品種選育鑒定提供簡便有效的評價方法?！痉椒ā恳?00份陸地棉品種（系）為試驗材料，設(shè)恒定低溫、晝夜變溫和適宜溫度3個處理，測定其出苗率、下胚軸長、根長、百粒重等指標(biāo)，采用耐冷系數(shù)差異分析、頻次分析、降幅分析、主成分分析、聚類分析和多元回歸分析等方法，對群體進行耐冷型劃分，并建立耐冷性評價模型和確定鑒定指標(biāo)?！窘Y(jié)果】各指標(biāo)在適宜溫度下變異幅度較小，變異系數(shù)為3.12%—18.89%，各品種（系）出苗率在85.00%以上，具有較高的生活力，可用于后續(xù)耐冷性分析。在低溫脅迫下群體內(nèi)各指標(biāo)變異幅度增大，為7.14%—108.33%，在恒定低溫和晝夜變溫下，變幅最大的指標(biāo)依次為根長和萌發(fā)指數(shù)。主成分分析將14個低溫相關(guān)指標(biāo)和百粒重轉(zhuǎn)換為6個相互獨立的綜合指標(biāo)，代表了全部數(shù)據(jù)74.98%的信息量。利用隸屬函數(shù)法計算綜合耐冷評價值（），并對其進行聚類分析，按照耐冷性強弱將200份陸地棉品種（系）劃分為5類，第Ⅰ類群屬于強耐冷型共2份，第Ⅱ類群屬于耐冷型共42份，第Ⅲ類群屬于中耐冷型共69份，第Ⅳ類群屬于較敏感型共83份，第Ⅴ類群屬于敏感型共4份，其中，新陸中16號為耐冷性最強的品種。采用多元回歸分析方法，建立棉花出苗期耐冷性預(yù)測模型為=-4.10+0.584+0.4014+0.321+0.225（2=0.92），篩選出4個耐冷性鑒定指標(biāo)，分別為恒定低溫下的棉苗總長、出苗率、干物重和晝夜變溫下的萌發(fā)率。田間早播試驗中各品種（系）的出苗率，與室內(nèi)試驗結(jié)果基本一致?！窘Y(jié)論】采用恒定低溫和晝夜變溫處理結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法對棉花出苗期耐冷性評價是可行的，恒定低溫下的棉苗總長、出苗率、干物重和晝夜變溫下的萌發(fā)率，可作為鑒定指標(biāo)。

棉花；出苗期；耐冷性；綜合評價；指標(biāo)篩選

0 引言

【研究意義】棉花是重要的天然纖維作物，作為戰(zhàn)略物資在國民經(jīng)濟中占有重要地位。新疆已成為中國最重要的棉花生產(chǎn)基地，2018—2021年連續(xù)4年新疆棉花總產(chǎn)量占全國80%以上。然而，新疆棉區(qū)早春低溫危害頻發(fā)，導(dǎo)致棉花萌發(fā)出苗率降低，生育期延遲，最終造成產(chǎn)量及品質(zhì)下降，早期低溫已經(jīng)成為影響新疆棉花生產(chǎn)的主要環(huán)境因素之一[1-2]。因此，了解棉花出苗期耐冷特性，建立耐冷性預(yù)測模型、篩選評價指標(biāo)、鑒定耐冷品種，對生產(chǎn)中抵御早春低溫冷害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】出苗期是棉花遭受低溫冷害最多的時期[3-4]，種子萌發(fā)最低溫度為10.5—12.0℃，10.0℃以下不能萌發(fā)[5-6]，下胚軸伸長并形成維管束需要在16.0℃以上[7]。新疆棉花出苗期面臨的溫度脅迫通常是“倒春寒”形成的0—15.0℃低溫[8]，低溫已經(jīng)嚴(yán)重制約棉花生產(chǎn)，選育耐冷品種是解決低溫冷害問題最直接有效的方法。針對植物出苗期耐冷性鑒定，國內(nèi)外研究人員從鑒定方法和指標(biāo)篩選等方面進行了廣泛研究。在玉米萌發(fā)期耐冷性研究中，在10℃低溫脅迫下測定發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等性狀，采用主成分分析、聚類分析等統(tǒng)計方法對自交系進行耐冷性鑒評，并劃分5個耐冷等級[9]。在粒用高粱中，利用10℃低溫脅迫對257份種質(zhì)材料種子萌發(fā)期耐冷性進行研究，篩選出萌發(fā)率作為高粱萌發(fā)期耐冷性鑒定指標(biāo)[10]。韓德志等[11]利用158份中歐大豆種質(zhì)，采用人工低溫脅迫處理，通過不同時期出苗率、最終出苗率、相對出苗率及出苗指數(shù)進行綜合分析，獲得出苗期耐冷種質(zhì)6份。目前，多指標(biāo)的綜合評價在作物出苗期耐冷性鑒定中已得到廣泛應(yīng)用。在棉花出苗期耐冷性鑒定和指標(biāo)篩選研究中，王俊娟[12]利用恒溫0℃冷處理7 d后的子葉展平率作為棉花萌發(fā)期耐冷性鑒定指標(biāo)，對13份棉花種質(zhì)材料進行耐冷評價。張隴艷等[13]在4℃恒定低溫下對53份陸地棉品種（系）進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)胚芽鮮/干重、活力指數(shù)可作為萌發(fā)期耐冷性鑒定的正向指標(biāo)，而平均發(fā)芽時間和平均發(fā)芽速度可作為負(fù)向指標(biāo)。目前對棉花出苗期耐冷性綜合評價多采用恒定低溫，忽略晝夜溫差變化，晝夜變溫與恒定溫度在作物中存在不同的響應(yīng)機制。在晝夜變溫條件下，小麥幼苗的淀粉酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性具有晝夜周期特性，而恒溫條件下生長的小麥幼苗則無此特性[14]。作物耐冷性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，受諸多因素控制，在不同生育時期和不同冷害類型下會表現(xiàn)出顯著的形態(tài)發(fā)育及生理生化差異[15]，因此，探討適當(dāng)?shù)脑u價方法和指標(biāo)尤為重要。【本研究切入點】前人對棉花出苗期耐冷性鑒定研究多在單一溫度下進行，其結(jié)果對指導(dǎo)生產(chǎn)中耐冷品種篩選具有局限性，并且在建立評價體系和篩選指標(biāo)中采用材料份數(shù)較少，未見大規(guī)模的耐冷鑒定研究。因此，采用恒定低溫和晝夜變溫2種鑒定方法對200份品種（系）進行耐冷性研究，其結(jié)果將更為準(zhǔn)確，將為出苗期耐冷品種鑒定和遺傳改良提供幫助。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對來源于不同生態(tài)區(qū)的200份材料為研究對象，結(jié)合北疆棉區(qū)獨特的早春低溫氣候特點，采用恒定低溫和晝夜變溫模擬田間低溫脅迫，結(jié)合田間早播驗證試驗，測定萌發(fā)率、出苗率等指標(biāo)，深入研究棉花出苗期耐冷性差異，精準(zhǔn)篩選耐冷種質(zhì)，為培育和鑒定耐冷棉花新品種，對解決新疆早春低溫造成出苗不齊、苗勢不一的瓶頸難題具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以來自不同生態(tài)區(qū)的200份棉花品種（系）為供試材料（電子附表1），其中，中國黃河流域棉區(qū)59份、長江流域棉區(qū)24份、西北內(nèi)陸棉區(qū)81份和北部特早熟棉區(qū)15份，以及國外棉區(qū)21份，材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所早熟課題組收集和提供，全部材料至少經(jīng)過3代以上自交純化。

1.2 試驗方法

適溫下基礎(chǔ)性狀測定：脫絨后，每個材料挑選大小一致、飽滿的棉花種子，采用培養(yǎng)皿砂培法，每個材料播種3皿，每皿20粒種子，沙子質(zhì)量含水量為15%，置于適溫光照培養(yǎng)室（28℃12 h晝/25℃12 h夜）中生長5 d，逐日統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)，用于計算萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)；另采用紙缽砂培法，每個紙缽播種15粒，3個紙缽為一組，播種后置于適溫光照培養(yǎng)室生長7 d，至子葉完全展平后，測定各材料的出苗率、下胚軸長、根長、棉苗總長和干物重。試驗重復(fù)3次。

設(shè)定低溫處理溫度：統(tǒng)計分析北疆棉區(qū)2009—2020年氣象數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在4月5日至12日有日均溫10—12℃低溫危害，4月18日至20日最低溫度從8℃驟然降至4℃，結(jié)合棉花種子萌發(fā)、下胚軸伸長和出苗所需最低溫度條件，設(shè)定恒定低溫（4℃，12 h晝/12 h夜）和晝夜變溫（16℃12 h晝/4℃12 h夜）2種低溫處理方法。

篩選低溫處理時間：隨機選20個品種開展低溫處理時間篩選試驗（品種編號和名稱為：8（晉棉23）、18（陜70）、28（新陸早8號）、38（中棉所24）、48（602186）、58（岱字棉14號）、68（魯棉研36）、78（中棉所12號）、98（新陸早21號）、108（墾N27-3）、118（新陸早37號）、129（新陸中8號）、143（新陸中30號）、148（新陸中41號）、161（遼錦棉6號）、169（鄂棉16號）、178（渤棉1號）、188（贛棉3號）、198（豫棉2號）、199（新陸早53號））。采用紙缽砂培法，播種后置于適溫光照培養(yǎng)室生長2 d。隨后轉(zhuǎn)至恒定4℃低溫冷室中，分別進行低溫處理1、3、5、7和9 d，最后移回至適溫光照培養(yǎng)室恢復(fù)生長，7 d后測定各材料的出苗率；播種后，將紙缽置于晝夜變溫環(huán)境中，分別培養(yǎng)10、12、13、14和16 d后轉(zhuǎn)移到適溫光照培養(yǎng)室中，恢復(fù)生長5 d后，測定各材料的出苗率。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

恒定低溫處理：采用紙缽砂培法，播種后置于適溫光照培養(yǎng)室生長2 d。隨后，將全部材料轉(zhuǎn)至恒定4℃低溫冷室中培養(yǎng)5 d，最后移回至光照培養(yǎng)室恢復(fù)生長，7 d后測定各材料的出苗率、下胚軸長、根長、棉苗總長和幼苗干物重共5個表型指標(biāo)。同時分別在冷處理前（0 h）和脅迫處理24 h后，去除種殼置于液氮冷凍保存，用于測定可溶性糖含量和游離氨基酸含量。

晝夜變溫處理：采用培養(yǎng)皿砂培法，播種后將培養(yǎng)皿置于晝夜變溫環(huán)境中，培養(yǎng)20 d，每隔1 d統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)，計算萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)；采用紙缽砂培培養(yǎng)法，播種后，將紙缽置于晝夜變溫環(huán)境中，培養(yǎng)13 d后轉(zhuǎn)移到適溫光照培養(yǎng)室中，恢復(fù)生長5 d后，測定各材料的出苗率、下胚軸長、根長、棉苗總長和幼苗干物重共5個表型指標(biāo)。試驗重復(fù)3次。

田間試驗：以土壤5 cm地溫持續(xù)3 d平均達(dá)到10℃以上作為適宜早播時期，完全隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，共4個小區(qū)，各小區(qū)面積為56.0 m2（14.0 m×4.0 m），4.0 m行長，每個品種（系）播種1行，每行播種100粒。2021年和2022年早播時間分別為3月28日和3月27日。調(diào)查出苗時間和出苗率，待出苗數(shù)目穩(wěn)定后停止調(diào)查。

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo) 萌發(fā)率（germination rate，GR，%）=種子萌發(fā)數(shù)/供試種子數(shù)×100%（以露白，即胚根伸出0.5 mm為標(biāo)準(zhǔn)判定種子萌發(fā)）

萌發(fā)指數(shù)（germination index，GI）=ΣG/D，G為第D天對應(yīng)的萌發(fā)數(shù)（從第一粒種子萌發(fā)開始，至連續(xù)3 d沒有種子繼續(xù)萌發(fā)為止）。

出苗率（emergence rate，ER，%）=出苗數(shù)/供試種子數(shù)×100%

下胚軸長、根長、棉苗總長和幼苗干物重4個指標(biāo)，以不同材料的性狀測定值為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對各指標(biāo)測定值求平均數(shù)獲得最終值。同時稱取各材料的百粒重。

1.3.2 生理指標(biāo) 采用蒽酮比色法測定植物組織中可溶性糖含量，采用茚三酮顯色法測定游離氨基酸含量，測定方法參照《植物生理生化試驗原理和技術(shù)》。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

為了消除不同種質(zhì)基礎(chǔ)性狀間差異，采用單個指標(biāo)的耐冷系數(shù)（cold tolerance coefficient，CTC）對耐冷性進行評價。利用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理和分析，利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行頻次分析、主成分分析、相關(guān)性分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析和多元回歸分析，采用Origin和Graphpad prism作圖，相關(guān)指標(biāo)計算及標(biāo)準(zhǔn)如下：

耐冷系數(shù)：CTC=，= 1, 2, 3, …,（1）

式中X和CK為第個指標(biāo)在低溫和適宜溫度下的測定值。

式中，P為第個綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率，表示第個指標(biāo)在所有指標(biāo)中的重要程度。

各材料單項指標(biāo)的隸屬函數(shù)值[(x)]：

式中，x、xmin、xmax分別表示第個指標(biāo)及第個綜合指標(biāo)的最小值、最大值。

根據(jù)因子權(quán)重（ω）及隸屬函數(shù)值[(x)]，計算耐冷性度量值（cold tolerance coefficient comprehensive evaluation values，）。

計算主成分權(quán)重（W），

式中，P為各材料第個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率，為主成分的數(shù)目。

計算關(guān)聯(lián)系數(shù)（δ）、關(guān)聯(lián)度（γ）和指標(biāo)權(quán)重系數(shù)（ω(γ)）：

= 1, 2, 3, …,,= 1, 2, 3, …,（6）

式中，minmin|0()- x()|為二級最小差，maxmax|0()- x()|為二級最大差，為分辨系數(shù)（取值0.5）。

式中，S為第個材料某性狀的標(biāo)準(zhǔn)差，X為第個品種某性狀的平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同種質(zhì)基礎(chǔ)性狀分析

在適宜溫度下，對棉花的10個數(shù)量性狀進行統(tǒng)計分析，其中出苗率、下胚軸長、根長、棉苗總長和干物重用來衡量材料出苗后生長情況，萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)反映種子萌發(fā)活力，可溶性糖和游離氨基酸含量用來反映低溫脅迫下滲透調(diào)節(jié)物含量變化。對各性狀的均值、中位數(shù)、變異系數(shù)、最值、偏度和峰度進行統(tǒng)計分析（圖1），結(jié)果表明，只有萌發(fā)率在群體內(nèi)成偏正態(tài)分布，其余9個指標(biāo)為正態(tài)分布。供試材料基礎(chǔ)萌發(fā)率99.05%，在3 d內(nèi)均可悉數(shù)萌發(fā)，且出苗率為94.34%，因此，各材料在適宜條件下具有高生活力。各指標(biāo)在群體內(nèi)的變異系數(shù)介于3.12%—18.89%，萌發(fā)指數(shù)的變異系數(shù)最大，萌發(fā)率的變異系數(shù)最小，說明各個指標(biāo)對材料基因型的依賴性不同（表1）。幼苗的下胚軸長、根長、棉苗總長和干物重呈顯著正相關(guān)關(guān)系，百粒重與干物重、可溶性糖和游離氨基酸含量呈正相關(guān)關(guān)系（圖1）。綜上可知，在幼苗光形態(tài)建成過程中指標(biāo)間有一定相關(guān)性，百粒重對幼苗生長有重要正向調(diào)控作用。

2.2 篩選低溫處理時間

在恒定低溫脅迫下，恢復(fù)后，供試材料的平均出苗率隨脅迫時間的延長而逐漸降低，變異系數(shù)逐漸增大。低溫脅迫第5天時供試材料的平均萌發(fā)率為40.77%，變異系數(shù)為88.04%。當(dāng)脅迫時間延長至7和9 d時，平均出苗率為降低至2.84%— 2.19%，嚴(yán)重影響棉花出苗。在晝夜變溫脅迫下，恢復(fù)后的平均出苗率同樣隨脅迫時間延長呈降低趨勢，變異系數(shù)呈增加趨勢，脅迫13 d時，出苗率的最小值為0.00%，最大值為90.04%，平均值為43.38%。低溫處理14和16 d后，出苗率僅約為23.00%（表2）。為保證后續(xù)研究中各性狀有豐富的變異，確定恒定低溫處理時間為5 d，晝夜變溫處理時間為13 d。

HGW：百粒重；ER：出苗率；HL：下胚軸長度；RL：根長；TL：棉苗總長；GR：萌發(fā)率；GI：萌發(fā)指數(shù)；DW：干物重；SS：可溶性糖含量；SAA：游離氨基酸含量。*和**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。下同

表1 200份棉花品種（系）基礎(chǔ)性狀的統(tǒng)計學(xué)分析

表2 20個棉花品種在低溫處理不同時間后出苗率的差異分析

2.3 單項耐冷性指標(biāo)的差異分析

低溫處理后，測定的14個性狀均為連續(xù)分布，不同低溫處理對不同性狀的影響程度存在差異。在恒定低溫處理5 d，恢復(fù)生長7 d后，幼苗根長和低溫處理24 h后可溶性糖含量呈偏正態(tài)分布，其余下胚軸長、根長、棉苗總長等指標(biāo)呈正態(tài)分布；晝夜變溫處理13 d恢復(fù)5 d后，根長、棉苗總長和萌發(fā)指數(shù)呈偏正態(tài)分布，其余4個指標(biāo)呈正態(tài)分布。各指標(biāo)耐冷系數(shù)的變異系數(shù)介于7.14%—108.33%，其中，晝夜變溫下萌發(fā)率的變異系數(shù)最大，恒定低溫下下胚軸長的變異系數(shù)最小（表3）。同一區(qū)間內(nèi)各性狀耐冷系數(shù)分布次數(shù)和頻率相差較大，CTC值越接近于1，表明耐冷性越強。在CTC大于0.8的指標(biāo)有恒定低溫下的出苗率、下胚軸長、根長、可溶性糖含量等，以及晝夜降溫下出苗率、下胚軸長等，其分布頻率最高的為可溶性糖含量（99.50%）。CTC值越小且分布頻率越高，表明該指標(biāo)對冷脅迫的敏感度較強，在0＜CTC≤0.2區(qū)間內(nèi)，恒定低溫下的出苗率，晝夜變溫下的出苗率、萌發(fā)指數(shù)和萌發(fā)率指標(biāo)，分布頻率依次為19.00%、1.00%、85.00%和23.00%（表4），表明各指標(biāo)對冷脅迫反應(yīng)的敏感程度依次為萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)率、恒定低溫下的出苗率和晝夜變溫下的出苗率。各指標(biāo)在低溫脅迫后變化趨勢不同，在恒定低溫處理下的可溶性糖含量在脅迫后含量升高，升幅為23.74%，游離氨基酸含量和表型指標(biāo)在低溫處理后受到顯著抑制，降幅在14.13%—86.44%，其中，降幅最大的是晝夜變溫下的萌發(fā)指數(shù)（圖2）。不同供試材料間耐冷系數(shù)所反映的耐冷性不同，且同一供試材料各指標(biāo)的耐冷系數(shù)值也具有差異較大，表明各指標(biāo)對低溫敏感性不同，因此，只對某一指標(biāo)的耐冷性分析會忽略指標(biāo)間復(fù)雜關(guān)系以及不同的重要性，仍需進一步對多個指標(biāo)進行綜合評價。

2.4 主成分分析

共調(diào)查分析出苗期低溫相關(guān)指標(biāo)15個，較多性狀間相關(guān)性會加大研究的復(fù)雜度。主成分分析可以對原性狀實現(xiàn)綜合分析目的。對各指標(biāo)進行主成分分析，根據(jù)特征值＞1和主成分載荷矩陣，將具有相同本質(zhì)的變量歸為一類，可將原來各單項性狀指標(biāo)轉(zhuǎn)換為6個新的相互獨立的綜合指標(biāo)（用PV1、PV2、PV3、PV4、PV5和PV6表示），且累計貢獻(xiàn)率達(dá)74.98%，其中，第一主成分的貢獻(xiàn)率最大，為22.65%（表5）。在第一主成分中，恒定低溫下的棉苗總長、下胚軸長、根長和干物重的特征向量較大，它可能代表棉花出苗期在恒定低溫下耐冷性的綜合指標(biāo)。第二主成分中，晝夜變溫脅迫下的棉苗總長、根長和下胚軸長等7個指標(biāo)的系數(shù)特征向量較大，表明第二主成分主要表示在晝夜變溫脅迫下耐冷性綜合指標(biāo)。第三主成分中，晝夜變溫脅迫下的萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)特征向量相對較大。第四主成分中2種低溫脅迫下出苗率的特征向量相對較大。第五主成分中特征向量較大的是晝夜變溫下的干物重。第六主成分中百粒重的特征向量較大。同時，在6個主成分中，主要載荷指標(biāo)與其特征向量值差異較大，說明所測指標(biāo)在棉花出苗期耐冷表型多樣性中均起作用。

表3 不同棉花材料出苗期各耐冷指標(biāo)的差異分析

CC：恒定低溫；DVC：晝夜變溫。下同 CC: constant chilling; DVC: diurnal variation of chilling. The same as below

表4 供試棉花材料各性狀指標(biāo)的耐冷系數(shù)及其在不同區(qū)間的分布

CTC：耐冷系數(shù)。下同 CTC: Cold tolerance coefficient. The same as below

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05） Different lowercase letters indicate significant differences at P＜0.05 level

表5 6個主成分的特征向量、特征值、方差貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率

2.5 指標(biāo)的綜合D值評價及耐冷級別劃分

依據(jù)主成分分析得到6個主成分，計算隸屬函數(shù)值獲得每個材料的值，利用值來評價供試種質(zhì)耐冷性，值越大耐冷性越強。供試種質(zhì)資源值介于-3.62—1.78，均值為0.018。根據(jù)值對供試材料進行系統(tǒng)聚類分析，對其耐冷性進行等級劃分，可將200份棉花種質(zhì)的耐冷性分為五類（圖3-A，電子附表1）：第Ⅰ組屬于強耐冷型，包含新陸中16號和新陸中12號2份棉花種質(zhì)，全部來源于西北內(nèi)陸棉區(qū)；第Ⅱ組屬于耐冷型，包含新陸中15號、新陸中22號、新陸中21號和新陸早35號等42份，分布于西北內(nèi)陸棉區(qū)的品種（系）數(shù)量占此分組的64.29%，來源于國外和長江流域棉區(qū)的份數(shù)最少，均為7.14%；第Ⅲ組屬于中耐冷型，包括新陸早46號、新陸早40號、新陸早16號和新陸早33號等69份，有47.83%的品種（系）來源于西北內(nèi)陸；第Ⅳ組屬于較敏感型，包括新陸早50號、遼棉27號、墾N27-3和遼棉9號等83份，5個棉區(qū)的品種（系）數(shù)量相差不大，為9.64%—36.14%；第Ⅴ組屬于敏感型，包括光葉岱字棉、金墾69-2、銀山4號和莊稼漢102號共4份，其中，有分布于西北內(nèi)陸棉區(qū)的2份，國外和長江流域的各1份（圖3-B，電子附表1）。由聚類分析結(jié)果可知，強耐冷型的種質(zhì)資源只有2份，占比1.00%，敏感型的種質(zhì)資源有4份，占比2.00%，剩余大多數(shù)為中間類型占到97.00%。從第Ⅰ至第Ⅴ組，耐冷性逐漸降低，各組中分布于西北內(nèi)陸的品種（系）數(shù)量逐漸減少。

A：耐冷性系統(tǒng)聚類圖；B：5個分組中品種（系）的地理分布。FR：國外棉區(qū)；NEM：北部特早熟；NW：西北內(nèi)陸；YR：黃河流域；YZR：長江流域

2.6 耐冷指標(biāo)篩選和耐冷性預(yù)測

為建立可用于棉花出苗期耐冷性評價的數(shù)學(xué)模型，對低溫下測定的14個指標(biāo)和百粒重共15個指標(biāo)進行多元回歸分析。以單項耐冷系數(shù)CTC為比較數(shù)列，其值為參考數(shù)列，得到回歸方程。當(dāng)只有一個變量（TL-CC）時，回歸方程判定系數(shù)為0.64，檢驗達(dá)到極顯著水平，說明模型擬合度較好，回歸方程具有一定解釋能力（表6）。隨著選入方程的自變量依次增加，判定系數(shù)逐漸增大并接近1，當(dāng)自變量為TL-CC、GR-DVC、ER-CC和DW-CC變量時，判定系數(shù)為0.92，檢驗均達(dá)到極顯著水平，相對應(yīng)的回歸方程能很好評價陸地棉出苗期耐冷性。當(dāng)再增加一個自變量SS-CC時，判定系數(shù)更接近于1，擬合方程更準(zhǔn)確，相比表型指標(biāo)可溶性糖含量測定較復(fù)雜，為使鑒定方法簡化，選用=-4.10+0.584+0.4014+ 0.321+0.225作為棉花出苗期耐冷性評價模型。同時也表明恒定低溫下的棉苗總長、干物重、出苗率和晝夜變溫下的萌發(fā)率4個指標(biāo)對低溫脅迫更敏感。

表6 棉花品種（系）耐冷性預(yù)測模型

1：恒定低溫下出苗率；4：恒定低溫下的棉苗總長；5：恒定低溫下的干物重；6：恒定低溫下的可溶性糖含量；14：晝夜變溫下的萌發(fā)率

1: ER-CC;4: TL-CC;5: DW-CC;6: SS-CC;14: GR-DVC

2.7 耐冷性驗證試驗

通過田間早播試驗對室內(nèi)鑒定結(jié)果進行驗證。共挑選30個種質(zhì)，包括強耐冷型1個（編號為135）、耐冷型4個（編號為138、147、168、144）、中耐冷型13個（編號為122、120、61、95、153、96、141、84、20、83、173、169、9）、較敏感型10個（編號為85、55、140、182、52、60、40、31、41、86）和敏感型2個（編號為165、164），播種后12—13 d開始出苗。品種間出苗率差異較大的時期出現(xiàn)在出苗早期，即播種后15—19 d（4月12日—16日）。強耐冷型和耐冷型品種在2021年和2022年的平均出苗率依次為32.00%和30.45%、46.67%和15.25%，均顯著高于中耐冷型、較敏感型和敏感型。其中，強耐冷型品種新陸中16號在2年中出苗率均最高（圖4-A）。2個低溫條件下獲得的綜合值，與分別在每種低溫脅迫下獲得的綜合值-CC和-DVC，存在一定相關(guān)性。在室內(nèi)條件下綜合值與-DVC值呈顯著正相關(guān)關(guān)系（2=0.97），2021年田間品種（系）的出苗率（ER-2021）與-CC值呈顯著正相關(guān)關(guān)系，2022年田間品種（系）的出苗率（ER-2022）與-DVC值和值呈顯著正相關(guān)關(guān)系（圖4-B）。綜合值可以用于生產(chǎn)中棉花出苗期耐冷性鑒定，2021年出苗率與-CC值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，可能與2021年4月3—7日連續(xù)5 d最低溫驟然降至4℃以下有關(guān)（圖4-C），低溫發(fā)生形式與室內(nèi)恒定低溫處理方法相似。而在2022年，未出現(xiàn)驟然降溫的冷害形式，在播種后15—19 d平均溫度在10—13℃（圖4-D），低溫發(fā)生形式與室內(nèi)晝夜變溫處理方式相似。因此，采用恒定低溫和晝夜變溫相結(jié)合的方式，對耐冷品種的篩選更加準(zhǔn)確。

3 討論

3.1 棉花出苗期低溫處理方法

選育鑒定耐冷品種是減少冷害的重要途徑之一，而耐冷資源的鑒定是培育耐冷品種的基礎(chǔ)，因此，如何有效模擬田間低溫環(huán)境，準(zhǔn)確篩選耐冷性種質(zhì)資源是耐冷品種選育的關(guān)鍵[16]。目前，關(guān)于低溫對棉花生產(chǎn)的影響以及耐冷種質(zhì)的篩選已有相關(guān)報道，且大多采用恒定低溫處理方法。徐建偉等[17]在恒定低溫下，以發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等為鑒定指標(biāo)，采用模糊隸屬函數(shù)值法篩選北疆棉區(qū)10年來主栽或大面積推廣的棉花品種，獲得2份萌芽期強耐冷性材料。高利英等[18]對黃淮棉區(qū)不同時期38個代表性棉花品種進行恒定低溫18℃、15℃和12℃處理，利用發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等進行耐冷性鑒定和綜合評價，劃分耐冷等級。雖然前人對棉花出苗期間耐冷特性進行了有價值的研究，但在處理條件上忽略了田間晝夜溫差的影響。因此，確定適合大批量棉花種質(zhì)耐冷性評價的溫度條件是耐冷性鑒定工作有效進行的前提。本研究以200份棉花品種（系）為試驗材料，模擬田間播種后可能遭遇的冷害溫度，對棉種進行恒定低溫和晝夜變溫處理，以低溫下萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)、可溶性糖和游離氨基酸含量變化，恢復(fù)生長后出苗率、根長、下胚軸長、棉苗總長和干物重，以及百粒重作為評價指標(biāo)，進行出苗期耐冷性鑒定。恒定低溫處理模擬田間播種后驟然降溫的危害形式，可造成幼根生長點不可逆損傷，大部分品種（系）在恢復(fù)生長后，主根損傷嚴(yán)重，側(cè)根生長旺盛，此低溫處理評價了種質(zhì)芽期的耐冷性。晝夜變溫模擬田間播種后日均溫為10℃的低溫，耐冷型材料在恢復(fù)生長后能正常出苗，敏感型材料出現(xiàn)爛芽、爛種，此低溫處理評價了種質(zhì)萌發(fā)期的耐冷性。綜上所述，本研究使用的鑒定方法與以往恒定溫度鑒定相比更接近生產(chǎn)環(huán)境，鑒定結(jié)果更具有應(yīng)用意義。

A：田間出苗率；B：室內(nèi)條件下獲得品種（系）的綜合值與田間出苗率的相關(guān)性分析；D：恒定低溫和晝夜變溫下各指標(biāo)的綜合值；D-CC：恒定低溫下各指標(biāo)的綜合值；D-DVC：晝夜變溫下各指標(biāo)的綜合值；ER-2021：供試材料在2021年的出苗率；ER-2022：供試材料在2022年的出苗率；C：2021年田間溫度；D：2022年田間溫度

3.2 棉花出苗期耐冷性評價指標(biāo)篩選

植物在逆境條件下，改變自身生長和形態(tài)特征如降低植株的高度、鮮重和干重等來適應(yīng)逆境條件[19-20]，通過調(diào)整自身生物量分配來維持逆境條件下植株的存活和生長[21-22]。不同品種不同指標(biāo)對低溫脅迫的反應(yīng)不盡相同，用某一單項指標(biāo)很難全面準(zhǔn)確地反映品種的耐冷實質(zhì)，采用多個指標(biāo)對作物的耐冷性進行綜合評價更為可靠。以往研究中，棉花出苗期耐冷性鑒定指標(biāo)，大多為胚芽鮮/干重、發(fā)芽率、發(fā)芽時間、以及冷處理后出苗率、子葉展平率等表型指標(biāo)[13, 18]，都未涉及百粒重指標(biāo)。粒重是自然選擇和進化的結(jié)果，在一定程度上與種子的活力和抗逆性有關(guān)[23]。本研究通過統(tǒng)計材料百粒重，發(fā)現(xiàn)品種（系）粒重越輕耐冷性越好，這一規(guī)律與大豆萌發(fā)期耐冷性研究結(jié)果一致，百粒重偏小種質(zhì)耐冷性越顯著[11, 24-25]，可能是萌發(fā)期耐冷相關(guān)基因與粒重、籽仁含量等調(diào)控相關(guān)基因密切連鎖導(dǎo)致。本研究在耐冷性綜合評價時，增加百粒重作為耐冷鑒定指標(biāo)，使萌發(fā)期耐冷評價更全面準(zhǔn)確。

3.3 棉花低溫適應(yīng)與地理分布相關(guān)性探討

棉花原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，對冷敏感。在長期的人工馴化和自然選擇過程中，棉花種植區(qū)呈現(xiàn)出生態(tài)地理分化，包括一些氣溫較低的高緯度和高海拔地區(qū)[26]。一般認(rèn)為，西北內(nèi)陸的品種（系）比黃河、長江流域的棉花更耐冷。通過比較本研究采用的200份材料的地理分布，發(fā)現(xiàn)來源于中高緯度區(qū)域的種質(zhì)，如西北內(nèi)陸棉區(qū)的棉花品種（系）多數(shù)耐低溫，而黃河和長江流域棉區(qū)的棉花種質(zhì)則多數(shù)不耐低溫。張隴艷等[13]研究中也發(fā)現(xiàn)分布于西北內(nèi)陸的品種新陸中4號等5份材料表現(xiàn)為強耐冷性，同時在擬南芥[27]、水稻[28]、白三葉[29]、黃瓜[30]耐冷性研究中也得到了類似結(jié)果，高緯度地區(qū)的材料耐冷性更強。因此，推測在棉花生產(chǎn)過程中高緯度地區(qū)棉花耐冷性更強，可能是由耐冷基因人工馴化造成的。

4 結(jié)論

獲得出苗期強耐冷型品種新陸中16號和新陸中12號。恒定低溫（4℃）處理5 d后恢復(fù)生長7 d；晝夜變溫（16℃/4℃）處理13 d后恢復(fù)生長5 d的方法，適合作為棉花種質(zhì)出苗期耐冷性鑒定的條件。恒定低溫恢復(fù)生長后幼苗的棉苗總長、出苗率、干物重和晝夜變溫下的萌發(fā)率，可作為棉花出苗期耐冷性快速鑒定的指標(biāo)。

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Construction of A Comprehensive Evaluation System and Screening of Cold Tolerance Indicators for Cold Tolerance of Cotton at Seedling Emergence Stage

SHEN Qian1,2, ZHANG SiPing1, LIU RuiHua1, LIU ShaoDong1, CHEN Jing1, GE ChangWei1, MA HuiJuan1, ZHAO XinHua1, YANG GuoZheng2, SONG MeiZhen1, PANG ChaoYou1

1Institute of Cotton, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan;2College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070

【Objective】In this study, the purpose was to comprehensively evaluate the cold tolerance of cotton varieties (lines) at seedling emergence stage, establish a reliable evaluation model, screen and identify indicators, and provide a simple and effective evaluation method for the selection and identification of cold-tolerant varieties in cotton.【Method】200 upland cotton varieties (lines) were used to test hypocotyl length, root length and 100-grain weight, etc. under three treatments of constant chilling (CC), diurnal variation of chilling (DVC) and normal conditions. A combination of integrated cold tolerance coefficient difference analysis, frequency analysis, drop analysis, principal component analysis, cluster analysis, and multiple regression analysis were used to classify their cold tolerance types, establish cold tolerance prediction models, and screen evaluation parameters. 【Result】The variation of each parameters at normal conditions were minor fluctuations ranging from 3.12% to 18.89%. The seedling emergence rate was above 85.00%, which had high viability and could be used for subsequent cold tolerance analysis. The variability of each parameter within the accessions increased under chilling stress, ranging from 7.14%-108.33%, and the most variable parameter were root length under CC condition and germination index under DVC condition. Principal component analysis converted the 14 parameters under chilling stress and 100-grain weight measured into six mutually independent composite indicators, representing 74.98% of the total data information. The comprehensive cold tolerance evaluation value () was calculated by the affiliation function method and then clustering analysis was performed. 200 cotton varieties (lines) were divided into five categories according to their cold tolerance, with 2 of the group Ⅰ being strongly cold tolerant, 42 of the group Ⅱ being cold tolerant, 69 of the group Ⅲ being medium cold tolerant, 83 of the group Ⅳ being more sensitive, and 4 of the group Ⅴ being sensitive, of which Xinluzhong 16 was the most cold-tolerant material. A multiple regression analysis was applied to establish a prediction model for cold tolerance of cotton at seedling emergence as=-4.10+0.584+0.4014+0.321+0.225(2=0.92), and four parameters for cold resistance evaluation were confirmed, namely total length of seedling, emergence rate, and dry weight under CC stress, germination rate under DVC stress. The cold-tolerant varieties (lines) had higher seedling emergence rates of early sowing experiment in the field, which were basically consistent with the results of the indoor results. 【Conclusion】It is feasible to use CC and DVC stress combined with multivariate statistical analysis to evaluate the cold tolerance of cotton at seeding stage, and total length of seedling, emergence rate, and dry weight under CC stress, germination rate under DVC stress can be used as evaluation parameters.

L.; seedling emergence stage; cold tolerance; comprehensive evaluation; parameters screening

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.002

2022-07-13；

2022-08-15

2021年度第七師胡楊河市財政科技計劃（2021C02）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2020-ICR）

沈倩，E-mail：shenqian429@126.com。通信作者宋美珍，E-mail：songmzccri@163.com。通信作者龐朝友，E-mail：chypang@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）